層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

このビデオ記事の全体的な目標は、接着細胞を層流条件にさらす手法を説明し、十分に定量化可能な流体せん断応力に対する応答を評価することです。これは、最初にフローチャンバーなしでフロー回路を組み立てることによって達成されます。この回路には、リザーバーパルス、ダンパー、ハードチューブ、ソフトチューブ、4ウェイストップコック、接続されたルアーアダプター、およびエアフィルターが含まれます。

次のステップは、無菌条件下での細胞培地など、必要な大量の8を回路に充填し、ポンプを開始してパルスダンパーを充填し、チューブの空気をパージすることです。これに続いて、セルに着座したスライドをフローチャンバーの底板に挿入します。手順の最後のステップは、フローチャンバーを一列に並べた状態でフロー回路を完全に組み立てることです。

最終的には、蛍光顕微鏡を使用して透明なチャンバーを通じて流体せん断応力にさらされた蛍光標識内皮前駆細胞の整列を示す結果を得ることができる細胞の機能的挙動を研究する。多くの場合、細胞を流体せん断応力にさらすことにより、in vivoの生理機能を模倣する必要があります。平行プレートフローチャンバーと連続フロー回路を設計し、フロー条件下での細胞の観察と透明なチャンバーの観察を可能にしました。

この技術は、医学および工学の分野における貴重な研究ツールとして役立ちます。当社のフローチャンバーは、直立顕微鏡または倒立顕微鏡を使用して、フロー下の細胞を断続的またはリアルタイムで視覚化できます。さらに、Dr.Ach Nickの設計により、研究者は標準的な顕微鏡レンズを使用して、透明または放射線不透過性の表面上の細胞を画像化することができます。

さらに、薬理学研究における重要なツールとして、フロー条件下での細胞に対する薬物の影響を研究することができます。セットアップの視覚化は、プロトコルを読み取るだけでは習得が難しいステップのいくつかであるため、非常に重要です。Dr.Ock Nextの研究室で一般的に使用されるフローチャンバーとフロー回路のセットアップ方法について、ステップバイステップで説明します。

まず、36インチのハードチューブのセグメントをパルスダンパーの一方の端からもう一方の端に取り付けます。18インチのソフトチューブを取り付けます。18インチのソフトチューブセクションの端に8分の1インチのオスルアーアダプターを配置します。

オスルアーを1つの8インチメスルアーアダプターに接続します。メスルアーを新しい18インチのソフトチューブセグメントに取り付けます。250ミリリットルのガラスビーカーキャップに3つの穴を開けます。

チューブを収めるには、1.5インチのソフトチューブのセグメントを1つの穴に挿入します。通気孔として。ハードチューブとソフトチューブの自由端をキャップの他の2つの穴から250ミリリットルのガラスボトルに挿入します。

硬いチューブがリザーバーの底に達していることを確認します。回路のセットアップ全体で無菌性を維持することは、この手順の成功に不可欠です。したがって、すべての部品を滅菌する必要があり、全体を通して滅菌手袋を着用する必要があります。

組み立てた部品に加えて、これらの部品は滅菌する必要があります。1つの完全なフローチャンバー、3 x 2インチのソフトチューブセグメント、1つのオスと1つのメス、1つの8分の1インチルアーアダプター、4つの1/ハーフインチの皿ネジ、6つの5 16インチ、8つの30秒。インチトラック/インチ、フラットヘッドネジ、ピンセット1組、スライドガラス1枚、スチーム滅菌タオル2枚。

摂氏121度で60分間オートクレーブします。フロー回路フローチャンバーを4×4ウェイストップコックを1つずつ配置し、ストップコックとすべての滅菌部品をこの滅菌フィールドに配置します。滅菌手袋を着用したまま、2つの4方向ストップコックをつなぎます。

開いているにキャップを取り付けますampファイルポート。フロー回路の2つのソフトチューブセグメントを取り付けているオスとメスのルアーアダプターを取り外し、接続されたストップコックを挿入します。リザーバーに挿入されたソフトチューブを30ミリリットルのシリンジに取り付け、シリンジピストンを取り外します。

ボトルに125ミリリットルのEPC媒体を入れます。ソフトチューブをストップコックに再接続します。滅菌シリンジフィルターを通気孔に入れます。

次に、フロー回路を摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿インキュベーターに移します。このタイプの石炭パーマーチューブで使用するために示されているマスターフレックスローラーポンプヘッドにハードチューブをクランプします。チューブがローラーポンプの取り付けトラックと重ならないようにしてください。

チューブがポンプヘッドから出る両側にマーキングペンで印を付けます。すべてのストップコックがサンプルポートに向かって閉じられ、フロー回路に沿って開いていることを確認した後、ポンプを始動します。流れの方向を確認します。

PERFUSE 8は、ガラスリザーバーから硬質チューブを通ってパルスダンパーに移動する必要があります。フローチャンバーの組み立てには、滅菌手袋を使用して、1つの2インチソフトチューブセグメントを1つの8分の1メスルアーアダプターに接続します。別の2インチのソフトチューブセグメントを8分の1インチのオスルアーアダプターに接続します。

メスルアーアダプター付きの2インチソフトチューブを流入ポートに取り付け、オスルアーアダプター付きの2インチソフトチューブを流出ポートに取り付けます。これらのルアーアダプターの両方に4ウェイストップコックを取り付けます。残りの2インチのソフトチューブピースをバブルトラップから外れているサイドポートコネクタに接続し、滅菌ピンセットを使用して一方向のストップコックを取り付けます。

細胞播種スライドを細胞培養容器から取り出し、フローチャンバーの底板のくぼみに入れます。スライドがシリンジまたはピペットを使用してセルに装着された側を上に向けて配置されていることを確認し、セルに装着されたスライドの上に10ミリリットルの温かいEPC培地を置きます。媒体がフローチャンバー内のスライドを覆うようにしますが、底板のOリングに媒体をこぼさないでください。

フローチャンバーの上部プレートを下部プレートに置き、ネジ穴を合わせます。チャンバースクリュープレートに気泡が入らないように、2つのプレートを平行に保ちます。一緒に。自動電池式ドライバーを使用して、流入側バブルトラップポートに取り付けられた一方向ストップコックを開くことにより、流入バブルトラップを空気で排出します。

10ミリリットルのシリンジを使用して、流入チューブをEPCメディウムで静かに洗い流し、このストップコックを閉じてキャップします。次に、流出ポートの4方向ストップコックを開き、フローチャンバーを通じてEPC媒体を静かに洗い流すことにより、チャンバーチャネルを空気抜きします。再び10ミリリットルのシリンジキャップを使用して、すべての4方向ストップコック接続を閉じます。

組み立てられたフロー回路を備えた加湿インキュベーターにフローチャンバーを移します。フロー回路を一時停止し、ポンプはフロー回路を閉じます。漏れを防ぐために、コックを流れの方向に止めます。

フローチャンバーをフロー回路に接続するフローチャンバーをフロー回路に接続した後、ストップコックをフロー方向に開きます。フローポンプを再開し、PERFUSE8が正しい方向に流れることを確認します。流量を希望のせん断応力に調整します。

フロー実験中、フローチャンバーを回路から取り外して、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で細胞をイメージングできます。これを行うには、ストップコックでフローチャンバーをフロー回路から切り離して、ストップコック接続を行います。分析のために灌流8つのサンプルを採取します。

まず、ポンプを一時停止し、パルスダンパーに最も近い位置にあるストップコックを閉じます。保護キャップを取り外し、逆さまにして、汚染されていないことを確認します。小さなシリンジをサンプルポートに挿入します。

ストップコックをフローチャンバーの方向に閉じ、サンプルポートとパルスダンパーの方向の回路を開いたままにします。回路から必要な量のサンプルを引き出し、活栓を閉じてサンプルポートに向け、シリンジを取り外します。大量の8個のサンプルをラベル付きのバイアルに保管し、摂氏マイナス80度で凍結します。

サンプルポートを要約し、フローを開始する前にすべてのストップコックが開いていることを確認してください。この方法を使用すると、ヒトの血液由来の内皮前駆細胞を15分以内にチタンスライドに播種し、生理的なせん断力で接着することができます。この図に示すように、EPCは、播種直後の約210平方ミクロンから3時間後の約657平方ミクロン、および1平方センチメートルあたり15ダインズの流体せん断応力の48時間後の約1,152平方ミクロンまでの流れの影響下で広がります。

この光学顕微鏡画像は、ヒトのEPCのランダムな配向を示しています。1平方センチメートルあたり100食で3時間の流れの後、6時間の静止した着座期間の後、細胞は広がりましたが、ランダムな向きのままです。100 dines/square cmimeterで48時間の流体せん断応力の後、EPCは流れの方向に整列し、配向されます。

ここでは、EPCをCTOで標識し、細胞核をherxで染色してフロー後に死滅させた。比較のために、この画像は、流れの方向に合わせてチタンスライド上のブタのEPCを示しています。48時間の流れと1平方センチメートルあたり15回の食事のせん断応力曝露の後、細胞境界を抗pcam染色で染色し、核をサイトキシン核酸染色で染色しました。

この方法では、分泌された細胞代謝物の分析および/または定量のために、所定の時点でPERFUSE 8のサンプルを取得することもできます。ここに示されているのは、ブタのEPCを使用した48時間のフロー実験中の亜硝酸塩の生成の例です。この手順を試みるときは、全体を通して無菌性を維持することが重要です。

さらに、連続フローを開始する前にフローチャンバー内の気泡の数を減らすために必要な措置を講じることが重要です。また、実験中にPERFUSE eightが漏れるのを防ぐために、フローチャンバーと回路のすべての接続を事前に確認することをお勧めします。このチャンバーは、上部プレートと下部プレートの完全な対抗を可能にし、真空ポンプを必要とせずに漏れ防止シールを提供するOリングを内蔵して設計されています。

また、この機能により、実験間のチャンバー高さが一定になり、ゴム製のガスケットや調整が不要になります。当社のフローチャンバーは、標準化された顕微鏡スライドを採用しています。したがって、多数の細胞がさらなる実験に利用可能です。

例えば、フロー後の細胞からのRNAおよびDNAは、タンパク質合成または遺伝子発現について評価できます。当社の回路設計により、流体せん断応力下で細胞から分泌される一酸化窒素の主要な酸化代謝物である亜硝酸塩などの細胞代謝物の分析と定量のために、灌流8つのサンプルを収集することができます。このビデオを見れば、接着細胞を流体せん断応力にさらすためのフローチャンバーと滅菌フロー回路の組み立て方法について十分に理解できるはずです。