Name: 層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 学ぶ 平行平板フローチャンバーを用いて内皮前駆細胞に層流のせん断応力を加え、細胞接着と形態変化を評価する方法です。蛍光顕微鏡でリアルタイム観察が可能で、創薬研究にも応用できます。

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著者らは、機械加工とフローチャンバーを介して画像の細胞に技術で支援するためにライカマイクロシステムズからフローチャンバーの部品やマットモーズリーの組み立ての彼のたゆみない努力のための生体計測器とマシンショップでは、Joeオーウェンに感謝したいと思います。我々は、デュークの灌流サービスからケビンコリンズと流れの回路設計に関する有益な助言のための医用生体工学専攻の博士スティーブウォレス恩義があります。我々はまたRC1HL099863 - 01&quot;補助装置の循環の生体適合性を向上させるために自家EPCライニング&quot;グラントを通じて、支援のためにアレクサンドラジャンセンとNIHが支援する国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムに感謝します。

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私達の流れの回路とフローチャンバーは、私たちが定義されている流体のせん断応力への付着細胞、例えば、EPCを、服従することができます。チャンバーの上部と底部が透明なので、細胞接着と形態は、リアルタイムで、チャンバー自体を介して、または流れの実験の後と解体フローチャンバーのいずれかを評価することができます。その時点で、細胞は、無菌条件下で収穫することができると再メッキのどちらか、またはさらなる分析のために彼らのDNAまたはRNA等を、収集するために使用。 層流を実現するために、チャンバーの設計は、いくつかの条件が満たされているようにする必要があります。 最初に、流れは粘性力に対する慣性力の比である、そのレイノルズ数（Re）を 、計算することによって検証することができます層、である必要があります。 （粘性力が支配する場合、 日時は小さく、流れは層流または"完全に開発された"です-通常RE &lt;2300。慣性力が支配的であれば 、RE&gt; 4000の場合のようにそれは、乱流になるまで、流れはますますランダムになります。）我々は、式（3）8にしたがって再計算することができます。 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（3）"> ρは流体密度、Qは流量である、μは粘度であり、wとhは、それぞれチャンバーの幅と高さ、であり、そしてD hは 、式（4）8によると定義され、水力直径です。 <img alt="式4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（4）"> 166からまでの高さと私たちの3つのフローチャンバーのレイノルズ数、 - 267μmの、13.9の範囲 - 流量で34.6℃15ダイン/ cm 2のせん断応力を得るためにalculated。 234から100ダイン/ cm 2のせん断応力について計算された流速で、チャンバーのレイノルズ数は90.4の範囲であった。これらのレイノルズ数のすべての2300よりはるかに低いものであり、層流のための基準を満たしている。 第二に、速度場と流路（すなわち、完全に開発された）に沿った距離とは無関係であることがせん断応力のため、流体入口からスライドへの距離は、入り口の長さ、LはEよりも長くなければなりません。これは、式5によれば、入り口の長さを計算することによって満たすことができます。 <img alt="式5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（5）">上記の値については、入り口の長さは0.01〜0.25 cmまでの範囲。 第三に、横方向の速度とせん断応力が変化しないことを確実にするために著しく一次元チャンネル流（Δ 中 、Ph / 2L）の値から、比はH / W 1よりもはるかに小さくする必要があります。一次元流れの下、壁面せん断応力の95％になるように二次元流れの条件下での平均壁面せん断応力の場合、H / Wは0.10以下である必要があります、そして二次元流れの条件下での壁面せん断応力のためになるために一次元流れの下の壁面せん断応力の97.5％は、H / Wは0.05以下である必要があります。私たちの設計したフローチャンバーの大きさ1.7幅のcmと166との - 高さ267μmの、これらの条件が満たされている。 入り口では横方向の圧力勾配がない場合、圧力は流れの方向にのみ変化します。これは、流路に染料または粒子を用いて評価することができる。さらに、定常流実験のために、パルスダンパーは、流路に挿入されます。パルスダンパーでは、PULSの大部分を取り出しatilityは、回路内のローラーポンプによって引き起こされ、私たちは定常流の近似仮定することができます。注目すべきは、利用パルスダンパーでは、それが効果的にローラーポンプの特定の周波数に対する出力の流れに脈動をなくすことができるように、回路で使用されているポンプとチューブと互換性があります。とI / P 26チューブ - どんなMasterflex L / Sシリーズポンプ（600 RPMは0）と排出ライン上で使用するときに私たちのデモではMasterflex L / Sパルスダンパーでは、層流を実現しています。拍動流の場合は、プログラム可能なポンプは、様々な波形を生成するために使用することができます。 拍動流の場合は、プログラム可能なポンプは、様々な波形を生成するために使用することができます。 さらに、回路は、灌流液のようにサンプルが容易に細胞や流れ媒体の汚染を危険にさらすことなく、異なるタイムポイントで収集することができるように設計されています。この例では、NO 2の濃度は、 -で化学発光によって測定したオニクス/ Sieversの一酸化窒素アナライザー（NOA 280、Sieversの楽器、ボールダー、CO）は、以前に10を説明した。亜硝酸の分析に使用される還元剤はNOに亜硝酸塩に変換しないように削減の可能性を秘めているが、そのような硝酸塩等の窒素のいずれか高い酸化物を減らすには不十分であるため、相対的にである酢酸のヨウ化カリウム（14.5 M酢酸と0.05 M KI）であった亜硝酸塩の特定。サンプル6をしながら失われたボリューム用に調整しながら生産総量の亜硝酸が生成される濃度と回路の総体積の積として算出した。 次の手順では、流れの実験の成功した実行のために重要です。 <ol class="lroman"><li>気泡がその表面から細胞をティアオフする可能性があるので、それは、フロー設定時に気泡の形成を避けることが望ましい。これは、最適な底の部分、上のフローチャンバーの上部に配置する際に世話をすることによって回避することができます。お互いに両方の平行を維持し、再調整せずに1つの動きの底にトップを下げることにより実現。そうすることで、流路内に存在および/またはフローティング可能性がある小さな気泡は、アルミニウム筐体のどちらかの端に泡のトラップに転送されます。 </li><li>貯水池の流出管がタンクの底に達することを保証することが重要です。そうでなければ、空気が灌流液レベルがわずかにチューブの端を下回った場合、タンクからチャンバーにつながるチューブに吸い込まれる可能性があります。 </li><li>研究者は、回路とチャンバーに吸い込まれる空気という結果になる、ポンプが誤ってフローの開始時に逆方向に実行されないようにポンプの流れの方向を理解しておく必要があります。 </li><li>泡の形成を（血清中に含まれる変性タンパク質に起因する）を避けるために、我々はperfusaより約1インチにチャンバーからタンクにつながるチューブを下げるアドバイス貯水池内のTEのレベル。しかし、流れ媒体のレベルを超えてそれ​​を維持することで、実験中に貯水池への流入を確認することができます。 </li><li>一緒にチャンバーの部品をねじ込む場合、それはもう片方の手で電動ドライバーを動作させながらしっかりと片手でハウジングを把握することが重要です。電動ドライバーの動きは、ネジが締まっている一度'の周りにチャンバーを放り出す"可能性を秘めているトルクに変換されることに注意してください。 </li><li>回路の形成とその表面から細胞を持ち上げてから、任意の圧力波を避けるために、すべてのストップコックは、フローを開始する前に、開いていることを確認してください。 </li><li>特に長期的な流れの研究のために（&gt; 48時間）我々は、より困難かつ弾力性のあるチューブを配管の破断を防ぐために、ポンプヘッドに挿入する使用することをお勧めします。 </li><li>それは、チューブが精神的に不安定なポンプヘッドの歯のために、ポンプヘッド内部に"移行"することが可能です。したがって、我々はどのように浴槽に細心の注意を払って提案しますINGは、ポンプヘッドに固定し、チューブは"に引っ張ら'や実験中に外れている場合、簡単に気づくことができるようなマーキングペンでチューブの両端をマーキングしています。 </li><li>常に慎重に接続不良が原因で実験中の灌流液の漏出を防ぐために灌流を開始する前に、回路とチャンバーのすべての単一のコネクタを確認してください。これは、パルスダンパーの流入と流出のコネクタのために特に重要です！ </li><li>あなたが蛍光標識を使用する場合、光の露出を制限するために覚えている。 </li></ol>私たちのフローチャンバーの可能な制限は、高さは、アルミニウムに加工チャネルの高さで固定されているということです。しかし、これは各実験の前にチャネルの高さの検証と調整する必要がないという利点があるため、単に所望の値にポンプの流量を調整することによって、せん断応力の計算を簡素化します。あなたの研究の目標に応じて、それはすることが望ましい場合がありますポンプの速度を増加させずにせん断応力を増加させる。このケースでは、例えば媒体11にデキストランを加える、灌流液の粘度を増やすことをお勧めします。 流回路の可能な制限は、細胞の代謝物の非常に低濃度を定量化しようとしたときに問題がある可能性がある使用される媒体の大ボリュームです。ここに示されていませんが、それは実質的に小さく貯水池及びパルスダンパーを使用して、回路量を削減し、チューブの長さと直径を小さくすることが可能です。 さらに、培養中の細胞に流体せん断応力を適用するために使用できるいくつかの他の市販のシステムがあります。マイクロ流体ベースのシステムでは、これらのチャネル12,13,14の入力と出力の貯水池として機能しているウェルプレートへの解決策でロードされる様々なマイクロ流路内のセルの同時分析を可能にする、流出からBioFluxシステムを例えば。しかし、これらおよびその他のマイクロ流体システムは、標準的な顕微鏡のスライドとは互換性がないので、そのようなRT - PCRやウエスタンブロットなどの更なる実験のための細胞が十分な数の回復のために許可されていません。さらに、彼らは、あまりユーザーフレンドリーは$ 40,000の最小のコストおよび付属機器に応じて、10万ドル以上の合計に到達する可能性があります。 Flexcellインターナショナル株式会社、FlexcellストリーマーとFlexFlowのシステムから使用可能な2つのマクロ流体のシステムが、うまく内皮細胞15,16,17、流体の流れの条件の下で人間のアニュラスのセル18と線維芽細胞19を研究するために使用されている。 GlycoTechを通じて利用可能なサードシステムは、腫瘍細胞の接着20および内皮単層への白血球接着21を研究するために利用されている。 ストリーマーのシステムは、複数のスライドを一度に同一のせん断応力条件の下で実行することができますが、表示ウィンドウを欠いていると - 私たちとは違って設計 - フロー下での細胞のリアルタイム可視化のために許可されていません。 FlexFlowシステムが表示するウィンドウを持っていますが、ほとんどの実験室で使用されている標準的な顕微鏡ではないかもしれない正立顕微鏡が必要です。さらに、FlexFlowシステムは、フローチャンバー内に配置するときに反転するセルでコーティングされたカバースリップを必要とします。これは、我々の研究で実証チタンでコーティングされたガラス、などの不透明な表面上に蛍光細胞の可視化を排除する。最後に、特殊なカバースリップは、マルチ千ドルの価格帯でFlexcell Streamerのシステムに似ているFlexFlowシステム、専用に購入する必要があります。 GlycoTechは、大幅に安価な、しかし、便利な私たちの部屋のようなオートクレーブ幹になることができないキャストアクリルの組み合わせにより製造されて円形と長方形の平行平板フローチャンバーを、提供しています。注、オートクレーブ可能なように記載されている他のフローチャンバーの彼らは特殊な顕微鏡レンズ22,23を必要とするため、非現実的に表示されます。 GlycoTechシステムは、繰り返し使用して厚さに変更するため、（メーカーは毎10使用後に新しいものを購入されることをお勧めします）時間の経過とともにチャンバーの高さを変更する上部と底板との間にシリコンゴムのガスケットを、利用しています。 O -リングを内蔵した当社のアルミチャンバーは、上部と底板の完全な反対を可能にし、実験の間に一定の室の高さを保証します。最後に、真空ポンプは、当社の設計では必要ではないGlycoTechチャンバー、を含む多くのフローチャンバー設計における漏れ防止のシールを、達成するために必要です。 ここに示されていないのに対し、フローチャンバーは細胞の接着及び/または動作のリアルタイムイメージングのための全体の流れの実験中に、顕微鏡下に保持することができます。これが望まれている場合、我々は37灌流液の温度を維持するために、加熱ランプまたはチャンバーの下で加熱パッドを使用することをお勧め℃を毛皮細胞や代謝物または治験薬またはエージェントのない"再循環"が24を希望されない場合がある、ローラーポンプは、シリンジポンプに置き換えることができます。 それは、流体せん断応力下で細胞間相互作用を評価するためにコンフルエントEPCの層上に接着細胞、例えば蛍光血小板（Achneckらによって記載された血小板アッセイを使用して。6,25）を介して異なる方法で標識された細胞を流すことも可能です。私たちのフローチャンバーは、灌流液サンプリングポートと表示ウィンドウなど、他の利用可能なフローチャンバー、の貴重な機能を組み合わせて、どちら倒立または正立顕微鏡との互換性の重要な利点があります。それは完全にオートクレーブ可能であり、一定の室の高さに漏れ止めシールを達成するために真空ポンプを必要とせずに繰り返し実験が可能になります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 製品/試薬 </td><td> 会社 </td><td> 製品＃ </td></tr><tr><td> 10mlのシリンジ</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 07940〜12 </td></tr><tr><td> 1ウェイStopcoks </td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 30600〜00 </td></tr><tr><td> 30mlのシリンジ</td><td> BDメディカル</td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4ウェイストップコック</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 30600〜04 </td></tr><tr><td>アルミ合金</td><td> N / </td><td> 6061 </td></tr><tr><td>細胞培養皿（4ウェル、長方形） </td><td>サーモサイエンティフィック、ヌンク</td><td> 267061 </td></tr><tr><td>細胞トラッカーオレンジ</td><td>インビトロジェン</td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>研究オーガニック</td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td>インビトロジェン</td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM - 2 Singlequots </td><td>ロンザ</td><td> CC - 4176 </td></tr><tr><td>メス型ルアーアダプター</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> SI - 45500〜04 </td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>シグマ</td><td> F0895 - 2mgを</td></tr><tr><td>キャップ付きのガラスボトル（250ミリリットル） </td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 34594〜24 </td></tr><tr><td>ハードチューブ</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 06508〜16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td>シグマ</td><td> H8264 - 500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td>シグマ</td><td> H8889 - 500ML </td></tr><tr><td>ヘキストStain Solutionが</td><td>シグマ</td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 605E </td></tr><tr><td>男性のルアーアダプター</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> EW - 45505〜04 </td></tr><tr><td> MCDB - 131、1Xミディアム</td><td> Cellgro </td><td> 15から100 - CV </td></tr><tr><td>とげのあるポリプロピレン継手</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 06365〜90 </td></tr><tr><td> O -リング</td><td> N / </td><td> AS568A </td></tr><tr><td>パルスダンパー</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 07596〜20 </td></tr><tr><td>ポンプドライブ（Masterflex L / S可変速経済のドライブ） </td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 7524〜40 </td></tr><tr><td>ポンプヘッド（Masterflexイージーロードポンプヘッド） </td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 07518〜60 </td></tr><tr><td>スライド</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 48500〜00 </td></tr><tr><td>ソフトチューブ</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 96400〜16 </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td>シリンジフィルタ</td><td>コー​​ルパーマーインストゥルメント（株） </td><td> 02915〜12 </td></tr><tr><td> SYTOXオレンジ核酸は染色</td><td>インビトロジェン</td><td> S - 11368 </td></tr><tr><td>トリプシンEDTA </td><td>ロンザ</td><td> CC - 5012 </td></tr><tr><td>トリプシン中和液</td><td>ロンザ</td><td> CC - 5002 </td></tr></tbody></table>

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

この方法の全体的な目標は、層流の条件に接着細胞をさらすとよく定量化流体のせん断1ストレスへの応答を評価する手法を説明することです。 私たちのフローチャンバーの設計とフローの回路（ 図1）は 、フロー中の様々な時点（ 図11C）で、フロー（ 図11A、B）の直前に細胞の形態の細胞接着とイメージングのテストを可能にする透過的な表示領域が含まれています、そして後のフロー（ 図11D）。これらの実験は、ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞（EPC）とブタEPCは2,3に図示されている。 また、このメソッドは、他の接着細胞タイプ、例えば平滑筋細胞（平滑筋細胞）または線維芽細胞に適用可能である。 チャンバーと回路のすべての部分が容易に蒸気オートクレーブで滅菌されています。他のとは対照的にチャンバは、例えば、マイクロ流体チャンバー、セル（セルサイズに応じて&gt; 1万円）の多数は、細胞培養や他の実験で、例えば、DNAまたはRNAの抽出、または免疫組織化学（ 図11E）のための無菌条件下での流動実験後に回収することができますまたは電子顕微鏡5をスキャン。せん断応力は、灌流液の流量、流体の粘度、またはチャネルの高さと幅を変えることによって調整することができます。一次元の流れが維持されることを確保しながら、後者は流体の体積やセルのニーズを減らすことができます。チャンバーの高さが大きく、複数の実験のしやすさを増大させるガスケットの使用、に依存しないので、それは、実験の間にチャンバーの高さを測定する必要はありません。さらに、回路設計が簡単に解析および/ ​​または流体せん断応力の曝露で細胞から分泌される代謝物の定量、例えば、一酸化窒素（ 図12）6灌流液サンプルの収集を可能にします</suP&gt;。

我々は、無菌連続流回路における層流のせん断応力を受ける接着細胞への方法を記述しています。細胞の接着、形態は、透明なチャンバーを通過代謝物の分析と将来の実験や培養のためのせん断曝露後に細胞を回収するための回路から得られた試​​料を研究することができる。

本手法の全体的な目的は、接着細胞を層流条件下にさらし、それに対する反応を評価するための技術を記述することにあります。

このビデオ記事の目的は、接着細胞を層流条件下にさらし、定量可能な流体せん断応力に対する反応を評価する手法を解説することです。まず、フローチャンバーを除いた状態で流路回路を組み立てます。回路には、リザーバー、パルスダンパー、ハードチューブ、ソフトチューブ、4方活栓および接続用ルアーアダプター、ならびにエアフィルターが含まれます。次のステップは、無菌条件下で細胞培地などの目的の緩衝液を回路に満たし、ポンプを始動してパルスダンパーを満たし、チューブ内の空気を除去することです。続いて、細胞が載ったスライドをフローチャンバーの底板に挿入します。手順の最終ステップは、フローチャンバーを直列に組み込み、フロー回路を完全に組み立てることです。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて透明チャンバー越しに流体せん断応露にさらされた蛍光標識血管内皮前駆細胞の配列を確認し、細胞の機能的な挙動を研究することが可能です。細胞の機能的挙動を研究するためには、流体せん断応力を加えることで生体内の生理学的条件を模倣することがしばしば必要となります。本研究では、フロー条件下で細胞を研究し、透明チャンバーを通して観察できる平行平板フローチャンバーおよび連続フロー回路を設計しました。この手法は、医学および工学の分野において有用な研究ツールとなります。当社のフローチャンバーを使用することで、正立顕微鏡または倒立顕微鏡を用いて、流れの中にある細胞の間欠的またはリアルタイムな可視化が可能です。さらに、Dr.Ach Nickの設計により、研究者は標準的な顕微鏡レンズを使用して、透明な表面または放射線不透過性の表面上の細胞をイメージングすることができます。さらに、流れ条件下での細胞に対する薬物の影響を研究するための、薬理学研究における重要なツールとして活用できます。いくつかの手順はプロトコルを読むだけでは習得が困難であるため、セットアップの視覚化が不可欠です。ここでは、Dr.Ock Nextの研究室で一般的に使用されているフローチャンバーとフロー回路のセットアップ方法について、ステップバイステップで説明します。フロー回路を組み立てます。まず、36 inchのハードチューブのセグメントをパルスダンパーの一端に取り付け、もう一端を接続します。次に、18 inchのソフトチューブのセグメントを取り付けます。18 inchのソフトチューブセクションの末端に、1/8 inchのオスルアーアダプターを装着します。オス側のルアーを1/8インチのメス側ルアーアダプターに接続します。メス側のルアーを、新しく切り出した18インチのソフトチューブのセグメントに取り付けます。250 milliliterのガラスビーカーのキャップに3つの穴を開けます。チューブを適合させるため、1.5 inchのソフトチューブのセグメントを1つの穴に挿入し、エアベントとして使用します。ハードチューブとソフトチューブの自由端を、キャップの残りの2つの穴を通して、リザーバーとして機能する250 milliliterのガラスボトルに挿入します。ハードチューブがリザーバーの底部まで届いていることを確認してください。回路のセットアップ全般において無菌状態を維持することが、本手順を成功させるために不可欠です。したがって、すべての部品を滅菌し、全過程を通じて滅菌手袋を着用してください。組み立て済みの部品に加えて、以下の部品を滅菌する必要があります。フローチャンバー1個、3×2インチのソフトチューブセグメント（オスとメス各1本）、1/8インチのルアーアダプター、1/2インチの皿ネジ4本、6 5/16インチのネジ（1インチあたり30山）8本、ピンセット1ペア、ガラススライド1枚、およびタオル2枚を蒸気滅菌してください。121°Cで60分間オートクレーブ滅菌します。フロー回路、フローチャンバー、4方活栓4個、1方活栓1個、およびすべての滅菌済み部品をこの滅菌野の上に配置します。滅菌手袋を着用し、2つの4方活栓を接続します。開いたサンプルポートにキャップをはめます。フロー回路の2つのソフトチューブセグメントを接続しているオスおよびメスのルアーアダプターを取り外し、接続されたストップコックを挿入します。リザーバーに挿入されているソフトチューブを30 milliliterシリンジに取り付け、シリンジのプランジャーを取り出します。ボトルに125 millilitersのEPC培地を満たします。ソフトチューブをストップコックに再接続します。エアベントに滅菌済みのシリンジフィルターを装着します。次に、フロー回路を37°C、5% 二酸化炭素の加湿インキュベーターに移します。このタイプのCoal Palmerチューブに使用するように指定されているマスターフレックス・ローラーポンプヘッドに、ハードチューブを固定します。チューブがローラーポンプの取り付けトラックに重ならないようにしてください。ポンプヘッドの両側でチューブが出ている箇所に、マーキングペンで印を付けます。すべてのストップコックがサンプルポート側で閉じられ、流路に沿って開いていることを確認した後、ポンプを始動させます。流れの方向を確認してください。PERFUSE 8は、ガラスリザーバーからハードチューブを通ってパルスダンパーに移動させる必要があります。フローチャンバーの組み立てには、滅菌手袋を着用し、2インチのソフトチューブセグメントを1/8インチのメス用ルアーアダプターに接続します。さらに別の2インチのソフトチューブセグメントを1/8インチのオス用ルアーアダプターに接続します。メス用ルアーアダプター付きの2インチソフトチューブを流入ポートに、オス用ルアーアダプター付きの2インチソフトチューブを流出ポートに取り付けます。これらのルアーアダプターの両方に4方活栓を取り付けます。残りの2インチソフトチューブをバブルトラップから出ているサイドポートコネクターに接続し、滅菌ピンセットを使用して一方向活栓を取り付けます。細胞を播種したスライドを細胞培養容器から取り出し、フローチャンバー底板の凹部に設置します。スライドの細胞播種面が上を向いていることを確認し、シリンジまたはピペットを用いて、温めたEPC培地10 millilitersを細胞播種スライドの上に注入します。培地がフローチャンバー内でスライドを覆うようにしますが、底板のOリングの上に培地がこぼれないように注意してください。フローチャンバーの上プレートを下プレートの上に置き、ネジ穴の位置を合わせます。チャンバーのネジプレート内に気泡が入らないよう、2枚のプレートを平行に保ってください。自動バッテリー式ドライバーを使用して、流入側のバブルトラップポートに取り付けられたワンウェイストップコックを開き、流入バブルトラップ内の空気を抜きます。10 mLシリンジを用いて、流入チューブをEPC培地で緩やかに洗浄し、その後、このストップコックを閉じてキャップします。次に、流出ポートの4方活栓を開き、フローチャンバーにEPC培地を緩やかに流して、チャンバーチャネル内の気泡を除去します。再び10 mLシリンジを用い、4方活栓のすべての接続箇所にキャップをして閉じます。組み立てたフロー回路とともに、フローチャンバーを加湿インキュベーターに移します。フロー回路ポンプを一時停止させ、漏れを防ぐために流れ方向に沿ってフロー回路のストップコックを閉じてください。フローチャンバーをフロー回路に接続します。フローチャンバーの接続後、流路方向に沿ってストップコックを開きます。フローポンプを再稼働させ、PERFUSE eightが正しい方向に流れていることを確認してください。流速を調整し、目的のせん断応力に設定します。フロー実験中に、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で細胞を観察するために、フローチャンバーを回路から取り出すことができます。そのためには、ストップコック同士の接続部分で、フローチャンバーをフロー回路から切り離してください。分析用に灌流液のサンプルを採取します。まず、ポンプを停止させ、パルスダンパーに最も近いストップコックを閉じます。保護キャップを取り外し、汚染を防ぐため、キャップを逆さまにして置きます。サンプルポートに小型シリンジを挿入します。ストップコックをフローチャンバー側で閉じ、サンプルポートおよびパルスダンパー側の回路を開いたままにします。回路から必要な量のサンプルを吸引し、シリンジを取り外す前にサンプルポート側のストップコックを閉じます。採取したサンプルをラベル付きのバイアルに保存し、-80 °Cで凍結させます。サンプリングポートを密閉し、フローを開始する前にすべてのストップコックが開いていることを確認します。この方法を用いることで、ヒト血液由来の内皮前駆細胞を15分以内にチタン製スライド上に播種し、生理的な剪断力の下で接着させることができます。この図に示すように、EPCは、15 dynes/cm²の流体剪断応力下において、播種直後の約210 µm²から、3時間後には約657 µm²、48時間後には約1,152 µm²まで、フローの影響を受けて拡大します。この光学顕微鏡画像は、ヒトEPCのランダムな配向を示しています。100 dines per square centimeterの流れを3時間加えた後、6時間の静止期間を置いた状態では、細胞は伸展していますが、配向はランダムなままです。100 dines per square centimeterの流体せん断応力を48時間加えると、EPCは流れの方向に沿って整列し、配向します。ここでは、EPCsをCTOで標識し、フロー後の細胞核をherxで染色しました。比較として、この画像はチタン製スライド上の豚EPCsをフロー方向に沿って配列させた状態で示しています。48時間のフローおよび15 dynes/cm²のせん断応力曝露後、細胞境界をanti pcam染色で、核をcytoxin核酸染色で染色しました。この手法を用いることで、分泌された細胞代謝物の分析および定量のために、あらかじめ設定した時点でPERFUSE 8からサンプルを回収することも可能です。ここでは、ブタEPCを用いた48時間のフロー実験における亜硝酸塩の生成例を示します。この手順を実施する際は、終始無菌状態を維持することが重要です。さらに、連続流を開始する前に、フローチャンバー内の気泡を減らすために必要な措置を講じることが重要です。気泡は細胞を剥離させる可能性があるためです。また、実験中のPERFUSE eightの漏出を防ぐため、灌流前にフローチャンバーおよび回路のすべての接続箇所を確認することを推奨します。このチャンバーは、上部プレートと下部プレートを完全に密着させることができ、真空ポンプを必要とせずに漏れのないシールを実現するOリングを内蔵した設計となっています。この機能により、実験間でチャンバーの高さを一定に保つことができ、ゴム製ガスケットや調整の必要性がなくなります。当社のフローチャンバーでは標準的な顕微鏡スライドを使用するため、後続の実験に利用できる大量の細胞を確保することが可能です。例えば、フロー後の細胞から抽出したRNAおよびDNAを用いて、タンパク質合成や遺伝子発現を評価できます。当社の回路設計では、灌流した8つのサンプルを回収して分析することが可能であり、流体剪断応力下で細胞から分泌される一酸化窒素の主要な酸化代謝物である亜硝酸塩などの細胞代謝物を定量できます。このビデオを視聴することで、接着細胞に流体剪断応力を負荷するためのフローチャンバーおよび滅菌フロー回路の組み立て方法について、十分に理解できるはずです。

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本稿では、同時に血小板機能および凝固を測定止血の実験モデルを説明します。血小板およびフィブリンの蛍光をリアルタイムで測定し、血小板付着率、凝固速度と凝固の開始が決定されます。モデルは、輸血用の濃縮物で流下血小板凝固促進特性を決定するために使用されます。...

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

この研究では、血小板の接着、広がり、および分泌の流れを調べるための蛍光顕微鏡検査に基づく方法を説明しています。この多目的プラットフォームは、血栓症および止血に関する機械的研究のための血小板機能の調査を可能にする。...

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

ここでは、流体せん断応力下における血管内皮細胞の培養と遺伝子発現解析のワークフローが表示されます。同時に監視制御環境および外因性参照 RNA の定量的 PCR...

剪断応力の複数の平行平板流チャンバーを使用して内皮細胞の遺伝子発現解析

学ぶ 平行平板フローチャンバーを用いて内皮前駆細胞に層流のせん断応力を加え、細胞接着と形態変化を評価する方法です。蛍光顕微鏡でリアルタイム観察が可能で、創薬研究にも応用できます。

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

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