Name: ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学ぶ回転細胞培養システムを用いた3次元ヒト細胞培養法。低シアー環境で栄養膜細胞を培養し、分化マーカーと増殖因子の発現を向上させ、in vivoに近い生理学的特性を再現する手法です。

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この作品は、健康補助金NIH / NICHD＃HD051998（CAMまで）の米国国立研究所によってサポートされていました。

1。コラーゲンビーズの調製<ol><li>前の3次元細胞培養のためのロードEVTsに、一つはCytodex 3マイクロキャリアビーズを準備する必要があります。 <ol><li>実験に必要なCytodex - 3ビーズの適切な量を秤量。このプロトコルは、ビーズの0.05グラムが必要とされる、10ミリリットルRCCSの容器に適合されている。 50ミリリットルRCCSの容器の場合、スケールは調整する。 50mLのオートクレーブ可能な円錐管で、12mLダルベッコのリン酸との混合250mgのCytodex - 3ビーズが溶液（DPBS）をバッファ。この金額は、5 RCCS船で十分です。 </li></ol></li><li>オートクレーブ処理が蒸発につながるように十分なボリュームが、円錐管に存在していることを確認します。大まかに110℃で10分間チューブ、オートクレーブを締めくくる℃に</li><li>オートクレーブサイクルの完了時にコニカルチューブを外し、Cytodex - 3ビーズ溶液を冷却することができます。 </li><li>コニカルチューブは室温に冷却した後、1X DPを使用して12.5mLに総量をもたらすために無菌テクニックを使用してBS。 </li><li>キャップと室温で作製Cytodex - 3ビーズを格納する。準備ビーズが膨潤し、使用前に室温に冷却してください。 Cytodex - 3ビーズの上記製剤は、5つの10mLのRCCSの船のために提供します。我々は、コラーゲンが約1ヶ月後に不安定になるように室温でCytodex - 3ビーズの拡張ストレージは、パフォーマンスの低下につながることを観察した。 133から215μmからサイズのCytodex - 3ビーズの範囲。 </li></ol> 2。メディアの準備<ol><li>プラスサプリメント、60％L - 15リーボビッツのメディア（22から適応）、40％MEMアルファで構成されてGTSF - 2メディアを（22から適応）、最適化されたRCCSの1Lを準備します。最初に、補充したMEMアルファの合計量で400mlの準備： 21.2mM重炭酸ナトリウム 0.06％ペプトン 0.7mmのフルクトース 1.4mmのガラクトース 5.6mMグルコース 1％HEPES 1％L -グルタミン 0.5パーセントのITS 10％のFBS </li><li> ITSのストック溶液を準備するには、氷酢酸（約0.05mL）を添加することによって準備さ5mLの滅菌酸性化したH 2 Oに溶解する。解散する渦巻、45mL滅菌水で従ってください。 </li><li>組織培養グレードH 2 Oに溶解して十分なL - 15培地の600ミリリットルのためのリーボビッツの粉体を秤量</li><li> L - 15リーボビッツの培地を1Lに細胞培養液の合計量をもたらす。フィルター滅菌し、4℃で保存して暗所で。使用した培地の各アリコートに個別に1％ペニシリン - ストレプトマイシンを追加。 </li><li> GTSF - 2メディア以外の多くのメディアの配合に成功RCCSでテストされています。個々の研究室では実験が行われてのために最適である培地自分で決定する必要があります。 </li></ol> 3。細胞とビーズインキュベーション<ol><li> 〜80％コンフルエントにEVTsを伝播、トリプシンおよび認められた細胞培養のプラクティスを使用して数える。 </li><li>暖かいの4mlの中の1 × 10 6 EVTsを一時停止EDメディア。 </li><li>ゆっくりと準備Cytodex - 3ビーズをミックス。無菌テクニックを使用して、幅広い先端、10mLの血清ピペットおよび未使用の15mlのコニカルチューブへの転送を使用して、準備したビーズの2.5mLを削除します。彼らはピペットにアタッチするときにビーズの小さな損失があるかもしれないことに注意してください。 </li><li> Cytodex - 3ビーズをチューブの底に沈殿することができます。沈降した後、Cytodex - 3ビーズを乱すことなくDPBSの最上層を除去するピペッターを使用してください。 </li><li>準備Cytodex - 3ビーズをメディアで1 × 10 6準備EVTsを混ぜる。 </li><li> 30分間室温で細胞ビーズ混合物をインキュベートする。定期的に穏やかに混合する。 37℃、5％CO 2でさらに30分間インキュベートする。定期的に穏やかに混合する。 </li></ol> 4。 RWVのロード<ol><li>層流キャビネットでは、パッケージから10mLのRCCSを削除し、安定性のための滅菌、6ウェル培養プレートに入れてください。 RCのラベルが付いた図については図1を参照してくださいCS。 </li><li>港から大型ストッパーを外します。 </li><li>温めたメディアと10mLのためにインキュベート細胞ビーズ混合物の合計量をもたらす。 </li><li>大規模なポートを介してRCCSに細胞/ビーズ混合物をロードする。潜在的な気泡の除去を助けるためにロードするときRCCS（最大大きいポート）45 °の角度で傾斜させることが必要。ゆっくりと着実に容器を充填することにより、正圧のビルドアップを防ぐ。 </li><li>大規模なポートでストッパーを交換してください。 </li><li> 3 mLシリンジからピストンを外し、小さな港に空の注射器を置きます。各シリンジへのメディアの1 - 3ML追加。ゆっくりと2つの弁を開く。静かにシリンジで注射器のピストンを交換してください。すべての気泡が内側のチャンバーから除去されるまで1シリンジからメディアを追加します。 </li><li> RCCSをピックアップし、気泡を確認するために、目の前でそれを回転させながらそっと側をタップします。 いずれかの気泡がある場合は空気の気泡が形成Oを妨害するため、お客様は、チャンバーからそれらを得る必要がありますfは、セルの集合体と剪断力を紹介。気泡が小さいポートの下になるまで、RCCSを回転させて気泡を取り除きます。その後そっとチャンバーのポートと外に泡を強制的に反対側に注射器を押し下げます。 </li><li>片側のポートを閉じます。ゆっくりと形成される気泡を防ぐ容器、中に正圧の少量を導入する他の注射器のピストンを押し下げます。第二バルブを閉じます。 </li><li>ローターにRCCSをロードします。 37℃CO 2インキュベーターで19rpmで回転を開始します。 </li></ol> 5。メディアを変更する<ol><li>毎日その後も、最初の3日間は一日おきにメディアを変更します。 </li><li>ローターの電源を切り、RCCSを取り外します。 、いくつかの吸引を作成し、各小ポートからシリンジを削除し、ビーズが大きいポートの反対を解決するような角度でRCCSを配置するピストンを引き上げます。 </li><li>ビーズは、すべて決着した後に、小弁の1つを開き、メディアは、RCCの、廃棄物の容器に流出することができます。この方法でメディアの2 / 3を取り外します。ビーズを邪魔しないため、任意の集合体を破棄しないようにしてください。 </li><li>小さなバルブを閉じて、大規模なポートを開きます。バック大きいポートを介してRCCSにメディアを追加します。大規模なポートでストッパーを交換してください。 </li><li> 4.9 - 手順4.6を繰​​り返します。 </li><li>凝集体のサイズが大きくなるに従い、お客様は最適な速度で小さな循環パターンに理想的に、常時懸濁液中にそれらを保つために回転速度を増加する必要があります。凝集体が目に見えて成長し始めると、一般的に、それぞれの給餌後に0.3から0.7 rpmの間に速度が向上します。 </li></ol> 6。伝播細胞を収集<ol><li>ローターからRCCSを削除します。それぞれの小さなポートからシリンジを取り外し、ビーズが大きいポートの反対側の沈殿ができるように角度でRCCSを置きます。 </li><li>ビーズは、すべて決着した後に、小弁の1つを開いて、メディアが流出することができますRCCSの、廃棄物の容器に。この方法でメディアの1 / 3を取り外します。 </li><li>小さなバルブを閉じて、大規模なポートを開きます。優しくスワール容器をバックソリューションに集約して分散させる。滅菌50ミリリットルコニカルチューブに空の液体混合物。収集された凝集体は完全に凝集体の回復を最大化するために培養容器を洗浄するために上清を使用する前に、コニカルチューブに定住することができます。集計は、このようなフローサイトメトリー、浸潤アッセイ、免疫蛍光などとして、すぐにダウンストリームアッセイに用いることができる。 </li></ol> 7。代表的な結果 Cytodex - 3ビーズでRCCSで育ったEVT様細胞（SGHPL - 4栄養膜細胞株）の例を図2に示されています。 EVTのような細胞株は、離れてメインクラスタから拡張し、近隣のクラスタに接続する突起が表示されます。ビーズの多くは、完全に伝播する細胞で覆われている。一度RCCSとPLAから削除Tedは、細胞外マトリックスに、EVT -のような3次元培養した細胞は積極的におよび/ ​​または移動を（図3）に侵入。 RT - PCRのデータは、従来の細胞培養単層（図4）とは対照的に、3次元凝集体に見られるようにMMPの発現増加を確認する。興味深いことに、侵略に関連付けられていない遺伝子もRCCSにアップレギュレートされている（表1）とトロホブラストの細胞に侵入すると免疫の相互作用などの分野を線引きで助けることができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。回転細胞培養システム（RCCS）の漫画の描写。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。RCCSの5日間の成長後の代表的な集合体の位相コントラスト顕微鏡写真。矢印は浸潤細胞を示し、*はCytodex 3マイクロキャリアビーズを表します。 <imgalt files></imgalt> 図3。RCCS成長凝集体は、フィブリンゲルに包埋した。フィブリンゲルを介して浸潤は（A）24時間後にフィブリンの埋め込みには早くも観察され、（B）48時間を通して継続した。矢印は浸潤細胞を示し、*はCytodex 3マイクロキャリアビーズを（参考文献から、許可を得て、脚色7）を表します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4単層とRCCSの比較ゼラチンザイモグラムはSGHPL - 4 EVT様細胞を伝播。 MMP - 2及びMMP - 9のプロと、アクティブなフォームは、RCCS栽培栄養膜細胞（文献[7]から、許可を得て、適応）によって分泌された。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="表1"> 表1。RCCSで育ったSGHPL - 4細胞（文献[7]から、許可を得て、適応）からマイクロアレイの結果のまとめ。 <ol class="lalpha"><li d><li>単分子膜における検出限界以下であったの遺伝子を示している。 </li></ol>

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</ol>

我々は、開示することは何もない。

ここで紹介する培養技術は、高度に侵襲EVT様細胞との調査官が用意されています。それは今分化の損失が三次元（心尖部、基底、および横方向のセルの表面）10,13における化学と分子の手がかりに対する細胞応答の阻害に起因する単層で発生することが認識されている。この手法は、EVTの細胞を侵入に子宮内に記載されている特性を反映している。手順は、従来の単層組織培養時間の動態を模倣するが、差動式で細胞を提供するので、比較アッセイを用いることができる。細胞塊はいつでも実験で使うために収穫されることがあります。クラスタやコラーゲン分解が単一の細胞懸濁液として細胞を単離するために用いることができるとして、それらを使用することができます。 Cytodex 3マイクロキャリアビーズは、個々の研究室&quot;特定の利害をより助長するかもしれない他の細胞外マトリックス（ECMに）でコーティングされた足場やマイクロキャリアビーズに​​置換してもよい。 Alternatively、細胞培養用インサートとスピナーフラスコ10,23のような特定の細胞型の培養条件、より助長するかもしれない他の多...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> Cytodexマイクロキャリアビーズ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td>回転細胞培養システム（RCCS） </td><td> Synthecon </td><td> RCCS - D </td><td>ローターベース、電源、4使い捨てRCCSユニットが含まれています</td></tr><tr><td> RCCS使い捨てユニット</td><td> Synthecon </td><td>お問い合わせSynthecon </td><td></td></tr><tr><td> 3ミリリットルルアーロックチップシリンジ</td><td> BD </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 10ミリリットルワイド先端血清用ピペット</td><td> BD </td><td> 357504 </td><td></td></tr><tr><td> MEMアルファ</td><td>インビトロジェン</td><td> 12561-072 </td><td></td></tr><tr><td>リーボビッツのL - 15培地、粉</td><td>インビトロジェン</td><td> 41300-039 </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O、エンドトキシンフリー</td><td>フィッシャー</td><td> MT - 25 - 055 - CM </td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S - 7795 </td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP1420 - 100 </td><td></td></tr><tr><td>果糖</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F3510 - 100 </td><td></td></tr><tr><td>ガラクトース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G5388 - 100 </td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G7528 - 250 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>インビトロジェン</td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td>インスリン - トランスフェリン - 亜セレン酸ナトリウム（ITS） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 10437 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

人間の栄養膜研究の分野では、胎盤形成の間に確立された複雑な環境を理解する上で役立ちます。これらの研究の性質上、in vivoの実験で 、人間は不可能です。初代培養、外植培養と栄養膜細胞株1の組み合わせは、子宮壁2の侵略と妊娠の成功確立のために必要とされるextravillous栄養膜細胞（EVTs）による子宮螺旋動脈3,4の改造の我々の理解をサポートしています。このようなモデルから収集した豊富な知識にもかかわらず、それは彼らのin vivoでの対応で 5,6と比較した場合、EVTのような細胞株を用いた in vitro細胞培養モデルにおいて細胞のプロパティを変更し表示することが受け入れられている。回転細胞培養システム（RCCS）で培養した細胞は、より密接にUで差別化を模倣することEVTのような細胞株の、形態学的表現型、および機能的特性を表示する侵略（例：マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP））と栄養膜の分化7,8,9を仲介する遺伝子の発現増加とテロササナEVTs、。サンジョルジュ病院胎盤細胞ライン- 4（SGHPL - 4）（親切に先生ガイウィットリーと博士ジュディスカートライトによる寄贈）RCCSでテストするために使用されたEVT様細胞株です。 RCCSの培養容器のデザインは、臓器および組織の3次元（3 - D）の環境で機能するという原則に基づいている。生理学的に適切なせん断の条件を含む容器内の動的な培養条件、のために、三次元的に培養した細胞は、天然の細胞の親和性に基づいて、凝集体を形成し、アセンブリ10,11,12器官のような組織に分化する。流体の軌道の維持は、 生体内に存在する条件と同様の低せん断、低乱流の環境を提供します。培養細胞の沈降は、回転を調整することによって打ち消された細胞の一定の自由落下を確実にするためにRCCSの速度。ガス交換は、バイオリアクターの背面に透過性の疎水性膜を介して行われます。それらが多孔質マイクロキャリアビーズの表面上で培養されているため、 生体内での彼らの親の組織と同様に、RCCSに成長した細胞は三次元（それらの、頂端基底、および側面即ち）で化学と分子勾配に対応することができます。プラスチックのような不浸透性の表面上の2次元単層として増殖させた場合、細胞はその基底面では、この重要なコミュニケーションを奪われている。そのため、環境によって課された空間の制約が深くこうして3次元環境13の重要な役割を示唆し、周囲の微小環境からどのように細胞の感覚とデコード信号に影響を与えます。 我々は、7,14,15,16、様々な人間の上皮組織の生物学的に意味のある3 - Dモデルを設計するRCCSを使用している。実際、多くの過去の報告では、DEMデータを持っているRCCSで培養された細胞は、他のモデル10,17-21では実現されていない生理学的に関連する表現型を担うことができることonstrated。要約すると、RCCSの文化は、実験操作の様々な従順な分化した細胞を大量に提供する簡単に、再現性、高スループットのプラットフォームを表します。次のプロトコルでは、例としてEVTsを使用して、我々ははっきりとRCCSに3次元的に培養接着細胞に必要な手順を説明します。

伝統的な、二次元細胞培養技術は、しばしば、分化マーカー、サイトカインおよび増殖因子に関する変更特性になる。 extravillous栄養膜細胞株を以下に示すように回転する細胞培養系における三次元細胞培養（RCCS）は、これらの要因の多くの表現を再確立します。

ヒト栄養膜細胞の研究分野は、胎盤形成中に構築される複雑な環境の理解に寄与しています。これらの性質上、...

この手順では、生体内の細胞キネティクスを模倣するために、三次元細胞培養システムを使用します。まず、collagen ENCをコーティングしたビーズとともに細胞をインキュベートします。次に、細胞とビーズを回転細胞培養システムに導入し、低せん断・低乱流環境で3D細胞凝集体を増殖させます。最後に、一般的な単層培養で増殖させた細胞の遺伝子発現および細胞分化と比較するためのダウンストリームアプリケーションに用いるため、細胞を回収します。得られた3D培養は、in vivoの状況に極めて近い細胞キネティクスおよび挙動を示します。我々はRCCSを用いて、さまざまなヒト上皮組織の生物学的に意義のある3Dモデルを構築してきました。共同研究者であるSydney Morris博士の研究室の元大学院生であるJessica Warner博士が、ここからはEVT細胞を用いてこの手順を実演します。50 mLコニカルチューブに入れられた12 mLのDPBS中で、250 mgのマイクロキャリアCytoDex 3ビーズをオートクレーブ滅菌します。準備したビーズを膨潤させ、室温まで冷却してください。次に、無菌条件下で全量を12.5 millilitersに調整します。DPBSを用いて、80%コンフルエントに達した絨毛外トロフォブラスト細胞を回収します。トリプシン消化を用いて、調製したCytodex 3ビーズを穏やかに混合し、先端の広い10 milliliterセロロジカルピペットを使用して、2.5 millilitersを15 milliliterコニカルチューブに移します。CytoDex-3ビーズがチューブの底に沈殿した後、CytoDex-3ビーズを乱さないように、上層のDPBSをピペットで除去します。EVT細胞とCytoDex-3ビーズを混合します。室温で30分間、適宜混合しながらインキュベートし、続いて細胞培養インキュベーター内で適宜混合しながら30分間インキュベートします。10 mLのRCCSを滅菌済みの6ウェル培養プレートに配置し、大きなストッパーを取り除きます。次に、加温したGTSF two培地を加え、細胞ビーズ混合物の全量を10 mLにし、大きなポートからRCCSにロードします。大型ポートストッパーを交換し、小型ポートを閉じます。次に、3 mLシリンジを2つの小型ポートに装着します。各シリンジに培地を加えます。2つのバルブをゆっくりと開き、シリンジピストンを元に戻します。一方のシリンジから培地をゆっくりと加え、内部チャンバーからすべての気泡が排出されるまで操作してください。RCCSを持ち上げ、回転させながら側面を軽く叩いて、気泡が残っていないか確認します。RCCSを回転させ、気泡が小さなポートの下に来るまで移動させて、残りの気泡を除去します。次に、反対側にあるシリンジをそっと押し下げ、気泡をポートからチャンバー外へ押し出します。同様に、片側のポートを閉じて、もう一方のシリンジピストンをそっと押し下げて容器内に少量の正圧をかけ、圧力をかけたまま2つ目のバルブを閉じます。最後に、RCCSをローターにロードします。最適な培養条件を維持するため、細胞培養インキュベーター内で19 RPMで回転を開始させます。最初の3日間は1日おきに、その後は毎日培地を補充してください。まず、ローターの電源を切り、RCCSを取り出します。ピストンを引き上げ、吸引力を発生させます。各小型ポートからシリンジを取り外し、RCCSを傾けて、ビーズが大型ポートの反対側に沈殿するようにします。次に、小さなバルブのいずれかを開き、ビーズを乱さないように、RCCSから培地の3分の2を廃棄容器に排出します。小さなバルブを閉じ、大きなポートを開きます。RCCSに培地を加え、ストッパーを戻して、前述のようにすべての気泡を追い出し、培養物をインキュベーター内のロテーターに設置します。凝集体の成長が始まったら、細胞が懸濁状態に保たれるよう、目視で確認しながら回転速度を上げてください。細胞を回収するには、RCCSをローターから取り出します。各小ポートからシリンジを取り外し、ビーズが大ポートとは反対側に集まるようにRCCSを傾けます。ビーズがすべて沈殿した後、小バルブのいずれか1つを開き、培地の3分の1を廃液容器に排出します。小バルブを閉じ、大ポートを開きます。容器を静かに回旋させて凝集体を溶液中に再分散させ、細胞を滅菌済みの50 milliliter・コニカルチューブに移します。コニカルチューブ内で回収した凝集体を沈殿させた後、その上清を用いて培養容器を再度十分に洗浄し、凝集体の回収率を最大化します。ワイドボアピペットチップを使用して、直ちに凝集体を分注し、後続の機能解析に用います。S-G-H-P-L 4 絨毛細胞株は、絨毛外絨毛細胞様細胞の一例です。Cyto X Threeを用いたRCCS内で育成された典型的な凝集塊では、多くのビーズが増殖する細胞で完全に覆われています。メインのクラスターから伸びて隣接するクラスターに付着している突起に注目してください。RCCSから取り出し、細胞外マトリックス上に播種すると、3Dで培養されたEVT様細胞は積極的に浸潤および遊走します。実際に、RT-PCRデータにより、従来の細胞培養単層と比較して、3D凝集塊ではMMPの発現が増加していることが確認されています。興味深いことに、浸潤に関連しない遺伝子もRCCSにおいてアップレギュレートされています。このビデオを視聴することで、RCCSを細胞株、初代細胞、あるいは幹細胞に使用し、生体内での細胞キネティクスをより忠実に模倣した三次元細胞培養を行う方法について、明確に理解できるはずです。

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表現型および機能解析のためのヒト胎盤組織からのHLA-G+ 外芽外栄養芽細胞の精製

学ぶ回転細胞培養システムを用いた3次元ヒト細胞培養法。低シアー環境で栄養膜細胞を培養し、分化マーカーと増殖因子の発現を向上させ、in vivoに近い生理学的特性を再現する手法です。

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

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