Name: マルチカラーで神経回路の地形を明らかにし (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ WGA-Alexaトレーサーを用いたマルチカラー神経回路可視化法。マウスの脊髄に圧力注入し、小脳・大脳皮質・脳幹の投射パターンを高速かつ鮮明にマッピングする技術です。

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この作品は、RVSのスタートアップ資金イェシーバー大学の医学のアルバートアインシュタイン大学から新たな研究者によってサポートされていました。

<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は急速に発展し、成体マウスでは神経突起を標識するための新規蛍光ベースのアプローチを使用してトレースする軸索に成功し、樹状突起に必要な外科的および技術的な詳細を記載している。 WGA -アレクサを使用して、我々は、トレーサーとマーカーが高解像度で三次元のパターン化された回路の地形を分析するために使用することができる方法を示します。 多くのトレーサーは、コレラ毒素サブユニットB、ビオシチン、Neurobiotin、インゲンマメleucoagglutinin（PHAL）、fluororuby、fluoremeraldとfluorogoldを含む神経回路をトレースするために利用可能です。さらに、最近の遺伝学的およびウイルスベースのトレーサーは分子的に異なる神経細胞のサブセットは地形的に高い精度でそのターゲットに接続されていることを明らかにした。いくつかの神経トレーサーを主に順行性または逆行方向（3000 MW対たとえばBDA 10,000 MW）のいずれかで輸送されるが、トレーサーの分子は、しばしば両方で輸送されることに注意してください方向。我々の研究では、我々は地形投影パターンの分析...

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器/試薬 </td><td> モデル/カタログ番号 </td><td> 会社 </td></tr><tr><td>ビーズ滅菌器</td><td>モデルは250猫をSteri。 ＃18000から45 </td><td>ファイン科学ツール</td></tr><tr><td> Cauterizer </td><td>ネコ。 ＃18000から00 </td><td>ファイン科学ツール</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管</td><td>ネコ。 ＃300056 </td><td>ハーバード装置</td></tr><tr><td>デュアルステージガラスマイクロピペットプラー</td><td>モデル001 - PC - 10 </td><td>ナリシゲ</td></tr><tr><td>マイクロメータの注射器</td><td>ネコ。 ＃GS - 1100 </td><td> Gilmontインスツルメンツ</td></tr><tr><td>小動物の定位音源</td><td>モデル940 - </td><td> Kopfは計装</td></tr><tr><td>電極マニピュレータ</td><td>モデル960 </td><td> Kopfは計装</td></tr><tr><td> Vetcare室</td><td>ネコ。 ＃340508 </td><td>ハーバード装置</td></tr><tr><td>暖房パッド</td><td>ネコ。 ＃341241 </td><td>ハーバード装置</td></tr><tr><td>ライカDFC360 FXカメラ</td><td> DFC360 FX </td><td>ライカ</td></tr><tr><td>ライカDFC490カメラ</td><td> DFC490 </td><td>ライカ</td></tr><tr><td>ライカDM5500顕微鏡</td><td> DM5500 </td><td>ライカ</td></tr><tr><td>ライカDFC3000 FXカメラ</td><td> DFC3000 FX </td><td>ライカ</td></tr><tr><td>ライカMZ16 FA顕微鏡</td><td> MZ16 FA </td><td>ライカ</td></tr><tr><td> CY3フィルター</td><td>モデル＃11600231 </td><td>ライカ</td></tr><tr><td> FITCフィルター</td><td>モデル＃11513880 </td><td>ライカ</td></tr><tr><td> A4 DAPI / UVフィルター</td><td>モデル＃11504162 </td><td>ライカ</td></tr><tr><td>小麦胚芽アグルチニン、のAlexa Fluor ® 488コンジュゲート</td><td>ネコ。 ＃W11261 </td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td>小麦ドイツメートル凝集素、のAlexa Fluor ® 555コンジュゲート</td><td>ネコ。 ＃W32464 </td><td>インビトロジェン</td></tr></tbody></table>

マルチカラーで神経回路の地形を明らかにし

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

神経回路は、機能的な地形図にまとめられています。複雑な回路のアーキテクチャを視覚化するために我々は、複数の地形予測のグローバルなパターン形成を確実にラベルを付けるためにアプローチを開発した。小脳は、神経回路の整然とした配置を研究する理想的なモデルです。例えば、脊髄小脳苔状繊維のコンパートメントの組織は、苔状線維のパターン形成を研究するための不可欠なシステムであることが実証されています。我々は最近、アレクサ555と488コンジュゲート小麦胚芽レクチン（WGA）が開発し、成体マウスの脊髄小脳苔状線維の投射をトレースするために使用できることを示した（Reeberら2011）。我々は、神経突起を標識するためWGA -アレクサトレーサー望ましいツールを作る三大特性を発見した。最初に、Alexaの蛍光色素は強烈であり、その明るさは、直接トレースした後wholemountイメージングが可能になります。第二に、WGA -アレクサトレーサーは、開発の全体軌跡と大人の神経projectioにラベルを付けるNS。第三に、WGA - Alexaのトレーサーは、急速に逆行し、順行性の両方の方向に輸送される。ここでは、トレーサーと他の必要なツール、脊髄小脳トレースのための手術を実行する方法とどのように最高の三次元の画像トレースされた突起を準備する方法について詳細に説明します。要約すると、我々だけでなく小脳のでなく、皮質、脳幹、及び脊髄における機能地図の組織との接続を解読するのに有用となるステップバイステップのトレースプロトコルを提供しています。

我々は、トレーサーを提供するための実用的なガイドを提供<em&gt; in vivoで</em&gt;とマウスで成功神経回路の解析に不可欠な手順を示すために、モデル系として脊髄小脳路を使用してください。我々は詳細にAlexaの蛍光物質に結合した小麦胚芽レクチン（WGA）を悪用私たちの多彩なトレースプロトコルについて説明します。

神経回路は、機能的なトポグラフィックマップとして構成されています。複雑な回路構造を可視化するため、我々は、確実に...するための手法を開発しました。

本手順では、小麦胚芽グルテニンをAlexa蛍光色素に結合させたものを用いて神経回路を追跡する、汎用性の高いin vivoトレーシングプロトコルについて説明します。まず、下胸部および上腰部に切開を加え、筋膜と浅層の脊髄筋を切断します。次に、背側椎弓切除術を行います。次に、マイクロ電極を準備し、マイクロマニピュレーターに取り付けます。続いて、神経トレーサーを脊髄に圧注入します。本手順の最終ステップとして、回復期間中に適切な術後ケアを行い、トレーサーが標的の神経路全体に輸送されるまで十分な時間を設けます。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法を通じて、小脳皮質、脳幹、および脊髄における地形図の構成と接続性を示す結果を得ることができます。BDAやW-G-A-H-R-Pなどの既存のトレーサーに対するこのトレーサーの主な利点は、WGA Alexaトレーサーが十分に明るいため、トレーシング直後にすべてのマウント標本のイメージングが可能であることです。この手法は、皮質、小脳、脳幹、および脊髄システム内およびシステム間における、複数の地形学的投射の全域的なパターニングの根底にある論理は何であるかといった、システム神経科学分野における重要な疑問に答えるのに役立つと考えられます。手順を開始する前に。すべての操作がIACUCのガイドラインに準拠していること、手術のための滅菌野が確保されていること、および使用するすべての器具が滅菌済みであることを確認してください。動物に承認済みの麻酔剤を投与した後、手術全体を通して滅菌外科的手法を用いてください。足指をつねることで、適切な麻酔深度に達していることを確認してください。動物が完全に麻酔された後は、足底反射が消失している必要があります。バリカンを用いて、手術部位の被毛を剃除します。次に、動物を腹側が上になるように、滅菌ガーゼパッドの上に仰向けに寝かせ、内側から外側に向かって円を描くように配置します。剃除した部位をアルコール綿で2回拭き取り、その後、70%アルコールで希釈したベタジンで拭き取ります。その後、再度アルコール綿で清拭し、適切に準備を整えた動物の上に、小さな穴を開けた滅菌ガーゼパッドを配置して術野を明確に区画します。このようにして手術を進め、適切な無菌的手技を維持してください。ピンセットで皮膚を持ち上げ、下部胸腔および上部腰椎領域の直上の正中線で、はさみを用いて切開します。必要に応じて筋膜および浅層の脊柱筋を切開し、血管を焼灼して止血します。次に、関節突起と背側の棘突起の中点を特定し、脊柱の両側でこの部位の椎弓を切断します。続いて、下部胸髄または上部腰髄の1〜2セグメントの棘突起を除去し、背側椎弓切除術を行います。マイクロメーターシリンジを用いて、プールドガラスピペットにトレーサーを満たします。次に、ガラスマイクロ電極をマイクロマニピュレーターにしっかりと固定します。その後、針に試薬を満たします。プールピペットを脊髄の下部胸髄から上部腰髄領域に0.1〜0.5 mm挿入します。脊髄の中線と外縁の中間点において、wheat agglutinin LOR 複合体（wheat germ agglutinin、西洋わさびペルオキシダーゼ複合体）の2%溶液、または0.5% fast greenを添加したPBSに含まれる10%ビオチン化デキストランアミン約0.5 µLを、3〜5分かけて加圧注入します。トレーサーがピペットから容易に排出されない場合は、チップをゆっくりと引き戻して組織内に小さなポケットを作製してください。マイクロインジェクションの完了後、再度注入を試みます。創傷クリップと組織用接着剤を用いて、皮膚を優しく閉じます。その後、動物をヒートパッドを設置した回復室に入れます。呼吸数をモニタリングし、動物が動こうとしている兆候を確認します。麻酔から回復した後、動物をホームケージに戻し、水と餌を自由摂取させ、必要に応じて鎮痛剤を投与します。痛み、不快感、または感染の兆候がないか、および十分に飲食できているかを定期的に確認し、コムギ胚芽グルテンおよび共役トレーサーを注射した動物を安楽死させます。マイクロインジェクションから24時間後。BDAで神経投射を完全に追跡し、その結果として脊髄小脳投射の完全なマッピングを行うには、通常より長い生存期間が必要です。そのため、これらの動物は約11日後に犠牲にします。コムギ胚乳グルテニンAlexaトレーサーを、下部胸髄および上部腰髄に注入した。この模式図は、コムギ胚乳グルテニンの起点と終点を示している。Alexa 555でラベル付けされた脊髄小脳路ニューロンである。この図は、成体脊髄の下部胸髄および上部腰髄領域にwheat germ agglutinin Alexa 555を投与した後の注入部位を示しています。このホールマウント像は、wheat germ agglutinin注入後の前角を示しています。Alexa 555を脊髄の下部胸髄および上部腰髄領域に注入します。脊髄レベルはローマ数字で示されています。ここでは、小麦胚芽グルテニンAlexa 555による脊髄小脳路の順行性トレーシングにより、この冠状断組織切片に見られるように、苔状繊維の明確なバンドが確認できます。このマウス小脳の模式図は、脊髄小脳の全体的なパターンをまとめたものである。後方のLOEsを通る冠状断組織切片に見られるように、腰髄の右側にAlexa 555標識小麦胚芽グルテニンを、左側の同一分節にAlexa 488標識小麦胚芽グルテニンを注入した。これにより、苔状繊維帯が可視化されている。両方のWegerアグルチニンAlexaトレーサーは小脳へ輸送され、主に顆粒細胞層（GCLと表記）において、苔状繊維終末の異なるサブセットを正常に標識しました。WegerアグルチニンAlexaトレーサーは、免疫組織化学および組織学的な手法と組み合わせて、ニューロンと投射の三重標識に使用できます。ここでは、WegerアグルチニンAlexa 555がlabial threeの苔状繊維終末に沈着しています。枠で囲まれた領域の高倍率像では、苔状繊維終末が明瞭に標識されていることが示されています。このゼイン2染色の画像では、Lole 3におけるビキニ細胞のストライプ状の配列が明らかになっています。枠で囲まれた領域の高倍率画像では、ビキニ細胞層および分子層におけるビキニ細胞の明瞭な標識が示されています。ここでは、DPI染色によってニューロンおよびグリア細胞の核が示されています。枠で囲まれた領域の高倍率像では、核が密集した顆粒細胞層およびバスケット細胞層の強力なラベル化と、分子層における低密度のラベル化が示されています。ここでは、小麦胚芽凝集剤（Wheatgerm Agglutinin）、Alexa 555、およびDPIを用いた、求心性バンド、バスケット細胞ストライプ、および全般的な細胞構築の三重ラベル化像を示します。最後に、この枠で囲まれた領域の高倍率像は、脳構造の細胞構築を明らかにする本手法の有用性を明確に示しています。この手法を習得し、適切に実施すれば、動物1匹あたり20分で完了させることができます。この操作を行う際は、組織を切断した後すぐにイメージングを行うことが重要である点に注意してください。なお、切断から2日以内にイメージングを行えば、この手順に従ってラベル化された繊維および末端を正常にイメージングすることが可能です。遺伝的に定義された細胞集団の投射パターンや終止パターンはどのようなものであるか、といった追加の疑問に答えるために、遺伝的リネージトレーシングなどの他の手法を用いることができます。

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皮質回路の理解に根本的な問題は、ネットワークが異なる皮質層に感覚情報をエンコードする方法です。ここでは、皮質の層を識別するために、単一のユニットと局所電場電位と現在の分析を記録するマルチコンタクト層電極を利用した電気生理学的手法を説明します。...

マルチ連絡ラミナーの電極の録音を使用してローカルネットワークの処理を検討

本稿では、限られた抑制性ニューロン集団でGFPを発現するトランスジェニックマウスにおける細胞全体の録音でレーザ走査光刺激を組み合わせたアプローチを紹介します。手法は特異的な阻害皮質ニューロンの局所シナプス回路の広範なマッピングと定量分析が可能になります。...

レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

神経回路は、地形的に特定の分子プロファイルを持つ機能的なコンパートメントに編成されています。ここでは、多彩なwholemount免疫組織化学的染色のアプローチを使用してグローバル脳の地形を明らかにするための実用的かつ技術的な手順を提供しています。我々はよく理解され細胞構築、小脳の回路を用いる方法の有用性を示しています。...

複雑な脳の地形を明らかにするためWholemount免疫組織化学

方法は新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける蛍光色素でニューロンを標識に記載されている。まず、内因性シグナル光学イメージング、機能マップを得るために使用されます。その後、2光子顕微鏡は、マップのミクロドメイン内でラベルとイメージニューロンに使用されます。...

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

このプロトコルは、選択的ニューロン集団の大規模な再構成を説明し、蛍光マーカーを発現する修正された狂犬病ウイルス、および独立した、公平なクラスタとラベルされた次の逆行性感染症は、それが明確なニューロンのサブクラス間の形態学的評価指標の包括的な特性評価を可能に分析します。...

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

ここでは、自由に動くマウスの複数の皮質層にわたる細胞 - 解像度で大規模なCa 2+イメージングを行うための手順を提示する。移植されたプリズムプローブと結合された小型頭部装着型顕微鏡を使用して、数百の活性細胞を同時に観察することができる。...

多層皮質Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。...

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

新皮質の主要な感覚野は、発達中に独特の自発的な活動を示します。この記事では、 in...

新生児マウス感覚皮質における自発的活動の単一ニューロン分解能でのin vivo可視化

本研究では、HD-MEAを用いて、特に海馬、嗅球回路、ヒト神経回路における大規模な神経集団の計算ダイナミクスを掘り下げます。時空間活動を捉え、計算ツールと組み合わせることで、ニューロンのアンサンブルの複雑さに関する洞察を得ることができます。この手法は、脳機能の理解を深め、神経疾患のバイオマーカーや治療法を特定できる可能性がある。...

CMOS集積高密度微小電極アレイにおけるマルチモーダル大規模神経集団ダイナミクスの記録と解析

ここでは、ラットとマウスの高密度微小皮質電位法(μEcoG)記録のための2つのプロトコル(外科手術、移植、記録方法を含む)を紹介します。μECoG記録は、ラット聴覚皮質における層流ポリトロード記録、またはマウス体性感覚皮質における神経活動の光遺伝学的操作と組み合わせて行われます。...

げっ歯類における層流ポリトロードと光遺伝学とマイクロ皮質電図法の統合による皮質処理のマルチスケール研究

学ぶ WGA-Alexaトレーサーを用いたマルチカラー神経回路可視化法。マウスの脊髄に圧力注入し、小脳・大脳皮質・脳幹の投射パターンを高速かつ鮮明にマッピングする技術です。

マルチカラーで神経回路の地形を明らかにし

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