Name: 遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学ぶ鋤鼻器スライス標本のカルシウムイメージング法。G-CaMP2発現トランスジェニックマウスを用いて、フェロモン刺激に対する神経細胞応答パターンを解析します。この手法は哺乳類の化学的コミュニケーション理解に貢献します。

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動物飼育および技術サービスへの素晴らしいサポートをいただいたAndrea Moran氏およびStowers InstituteのLab Animal Service Facility (LASF) のメンバーに感謝いたします。本研究は、Stowers InstituteおよびNIH (NIDCD 008003) からCRYへの資金提供を受けて実施されました。内容は著者らの責任に帰属し、国立聴覚・その他の通信障害研究所または国立衛生研究所の公式な見解を必ずしも代表するものではありません。tetO-G-CaMP2マウスについては、Stowers Institute、CRY、およびLMによる米国特許が出願中です。

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利害の衝突は宣言されません。

鋤鼻受容体（VRS）の大半は、デュラックとアクセル5で、その発見以来、オーファン受容体として残る。これらの化学感覚受容体と動物の行動を媒介に自らの役割のためのフェロモンリガンドについてはよくわかっていない。今までは、リガンド/受容体の1ペアのみ、ESP1ペプチドおよびその同族体、Vmn2r116（V2Rp5）は、識別し、特定の社会的な情報19,23を伝えることが示されている。別の受容体、V1rb2は、おそらく雌マウス24から尿中に濃縮された2 -ヘプタノン、に対応することが示されている。しかし、この配位子によって伝達具体的な情報は不明なままである。我々はここで開発した方法は、刺激と活性化のパターンの分析の多数にVNOニューロンの応答の特性評価を可能にします。この方法を使用することによって、我々は、細胞が男性または女性の尿に特異的応答を示すことと認識する機能、専用のセルが存在する可能性があることを発見した性別特定のフェロモンの手がかり15。 VRは、これらの細胞に発現して同定されていない。イメージング法だけでな​​く、尿中に存在するフェロモンリガンドの...

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

鋤鼻器官（VNO）は、同じ種の1,2内の個人の、社会的な性と生殖に関するステータスに関する情報を運ぶ化学的感覚信号を検出します。これらの種内の信号を、フェロモンだけでなく、いくつかの捕食者3からの信号は、特異性と感度4の高レベルの鋤鼻感覚ニューロンを（VSNを）活性化する。 G -タンパク質共役型受容体、V1R、V2RとFPR 5月14日 、の少なくとも三つの異なるファミリーは化学的感覚手がかりの検出を仲介するVNOニューロンに発現されています。フェロモン情報はVNOによってエンコードされている方法を理解するために、それは様々な刺激に個々のVSNの応答プロファイルを分析し、これらの応答を仲介する特異的な受容体を識別することが重要です。 VNOのneuroepitheliaは、鋤骨のペアで囲まれています。 VNOの半盲管状の構造は、接続する1つの開放端を（鋤鼻ダクト）がある鼻腔。 VSNをはフェロモン手がかりが樹状ノブで発現する受容体と接触しているVNO、の内腔部分にその樹状突起を延長する。 VSNの細胞体は、頂端及び基底層にそれぞれ6-8を発現しV1RとV2Rを持つ擬似成層を形成する。いくつかの技術が感覚刺激4,12,15-19へのVSNの応答を監視するために利用されている。これらの技術の中で、急性スライス標本では、いくつかの利点を提供しています。最初に、解離VSNを3,17と比較して、スライス標本は、それらのネイティブ形態の神経細胞と細胞の樹状突起が比較的そのまま滞在を維持。第二に、VSNの細胞体は、全体の上皮およびホールマウント標本12,20に比べて電気生理学的試験とイメージング実験を可能にするVNOの冠状スライスに簡単にアクセスできます。第三に、このメソッドは、受容体の同定を可能にするために、分子クローニング技術と組み合わせることができます。感覚刺激が強いのCa 2受容体の活性化4,21の指標であるVSNをで+流入を誘発する。そこで我々は、トランスジェニックマウスを開発しているVSNを15,22を含む嗅覚ニューロンにおける発現するG - CaMP2。感度とプローブの遺伝的性質が大幅にCa 2 +動態のイメージング実験を促進する。このメソッドは、以前の研究4,21で使用される染料ロードプロセスを排除しています。我々はまた、VNOのスライスに様々な刺激の応用を可能にするリガンドの配信システムを採用しています。 2つの手法の組み合わせは、私たちは刺激の大きい数字に対応して同時に複数のニューロンを監視することができます。最後に、我々は画像処理を支援するための半自動解析パイプラインを確立している。

鋤鼻器（VNO）は、社会的および生殖的情報を伝える種内化学信号を検出します。我々は、VNO組織にG-CaMP2を発現させた遺伝子組換えマウスを用いて、Ca2+イメージング実験を行いました。このアプローチにより、多数のフェロモン刺激に対する鋤鼻ニューロンの複雑な応答パターンの解析が可能になります。

鋤鼻器（VNO）は、集団内の個体の社会的、性的、および生殖状態に関する情報を運ぶ化学感覚信号を検知します。

本手順の目的は、MRO鼻器官ニューロンにおけるフェロモン応答のイメージングに向けて、生体組織切片を調製する方法を説明することです。まず、遺伝的カルシウムインジケーターであるGCaMP twoを発現するマウスから、MRO鼻器官またはVNOの生体組織切片を調製します。次に、切片の維持、刺激の適用、およびイメージングを行うため、顕微鏡ステージ上に灌流システムを構築します。反応の確認を行います。次に、さまざまなフェロモン刺激を用いてタイムラプスイメージング実験を行い、得られたイメージング結果のデータ解析を行います。最終的に、異なるフェロモン刺激に対するVNOニューロンの反応パターンが得られます。本手法の最大の利点は、カルシウムダイ（calcium D）ローディングや解離細胞を用いたイメージングなどの既存手法とは異なり、細胞の完全な形態を維持でき、切片の健全性をより高く保つことができ、さらに強力な信号が得られることです。この手法は、リガンドとその受容体の同定や、個々の線虫鼻腔ニューロンの応答プロファイリングなど、線虫鼻腔系の研究におけるいくつかの重要な疑問を解決するのに役立ちます。また、本手法は嗅覚系、血清、または脳のサイアローシス（psoriasis）などの他の系にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、良好な乾癬（psoriasis）の確保や灌流システムの構築に困難を感じる場合があります。本手順を開始する前に、付属の原稿に従って、マウス、人工脳脊髄液リンガー液、4%低融点アガロース、およびフェロモン刺激を含む必要な溶液を調製してください。その後、低融点アガロースを入れた2本のチューブをヒートブロックに設置します。温度を60 °C以上に設定し、アガロースを融解させます。ゲルが液状になったら、チューブを37 °Cのヒートブロックに移します。これでVNOスライスの準備が整います。安楽死させたGCaMP twoマウスを斬首した後、鋏で下顎骨を切断して下顎を取り除きます。次に、しわ状の上顎口蓋組織を剥がして、鼻腔を露出させます。その後、2本の前切歯の間に外科用メスを挿入し、顎骨を分離させます。下顎骨を慎重に除去し、VNOを露出させます。この時点で、尾骨部分を持って、鼻腔からVNO全体を持ち上げます。VNOを、冷やして酸素化したマウス用CSF溶液に移します。解剖顕微鏡の下で直ちに、ピンセットの先を鼻中隔骨の壁に沿ってそっと滑らせ、2つのvnoを分離します。VNO組織を包んでいるvulner boneを剥がします。その後、骨腔からVI NO組織全体をそっと持ち上げます。このステップでは、神経上皮を損傷させないよう細心の注意を払ってください。次に、組織表面に残っている小さな骨片を完全に除去します。残った断片を包埋する前に。組織がカッティングブレードに引っかかると、組織がアロスブロックから引き出されることがあります。その後、ピンセットでVNO組織の後端を保持し、溶融したアロスの中にゆっくりと浸します。チューブを氷上で速やかに冷却してください。arosを凝固させるため、包埋および冷却工程は2分以内に完了させてください。次に、VNOを含むarosブロックをトリミングし、組織ホルダーに接着します。続いて、組織ホルダーを金属シリンダーに挿入し、残りのチャンバーに低融点arosを追加して満たします。低融点アガロースが氷上で凝固したら、直ちに切片作成に移行します。組織スライサーの切片作成チャンバーに酸素供給済みのマウスA CSFを供給し、各切片を180〜200 micronの厚さで切断します。その後、切片を回収してインキュベーションチャンバーに移します。切片は、室温の酸素供給済みマウスA CSF中で6〜8時間生存可能です。本手順では、まずVNOスライスを灌流チャンバーの中央に配置し、スライスアンカーでスライスを固定します。アンカーの糸がスライスの低融点アガロース部分のみに当たり、VNO組織には当たらないようにしてください。次に、インレットポートから酸素飽和させたマウスA CSFを、約100 µL/secの速度で灌流チャンバーに供給します。液体を流出口ポートから吸引針を通じて排出し、マウスAのCSFを連続的に流します。次に、30 mLのシリンジにリンガー液を満たし、シリンジポンプに固定します。ポンプの速度を300〜600 µL/minに設定します。スライスにリンガー液を連続的に供給するために、リンガー液の出口をA-H-P-L-Cインジェクションループに接続します。インジェクションループの制御には2つの流路があります。ロード位置において、ハミルトン精密シリンジを用いてマウス尿サンプルをサンプルループにロードします。過剰なサンプルはサンプルループを通り、廃液口から排出されます。シリンジポンプによって注入されたリンゲル液はサンプルループをバイパスし、注入位置にある灌流チップに接続された出口へ直接流れます。ポンプ溶液がサンプルループ内を流れ、フェロモン刺激を出口へと押し出します。イメージング実験の前に、灌流液がスムーズに流れるよう気泡を除去します。次に、5倍または10倍の対物レンズ下で灌流チップを調整し、チップの先端がvien Oスライスから約1 mm離れるようにします。サンプル遅延時間および蛍光色素負荷時間を測定するため、0.1%rho domine six G dyeをサンプルループに導入します。次に、バルブを注入位置に切り替えます。画像取得開始の5秒後から、10秒から30秒の間で蛍光信号を検出します。蛍光信号の滑らかな曲線は、浸漬レンズの下で乱流がほとんど発生しておらず、酸素化されたマウスA CSFがスライスに十分に灌流されていることを示しています。当研究室では、GAMP2信号を検出するためのタイムラプスイメージングに、10xまたは20xの水浸漬レンズを備えたZeiss Axio scope FS two顕微鏡を使用しています。フィルターには、450から490 nanometersの標準的なGFPバンドパスフィルターを使用します。エピ蛍光画像は、GCaMP twoの発現レベルに応じて、1×1または2×2のビニングを用いたCCDカメラで取得します。まず、取得速度を1秒あたり1フレームに設定します。GCaMP two信号の退色および細胞への光損傷を最小限に抑えるように、光強度を調整してください。次に、一連の実験においてすべての試行で一定の時間遅延が得られるよう、特定の時点でバルブを注入位置に切り替えます。ここで、リンゲル液を刺激としてテストランを行い、サンプル注入中にモーションアーティファクトが生じる場合は、灌流セットアップを再調整します。その後、異なるサンプル間の相互汚染を防ぐため、1対100に希釈したマウス尿を用いてポジティブコントロールランを行います。刺激物を1回ロードした後、ハミルトンシリンジをリンゲル液で少なくとも3回洗浄してください。同様に、異なる刺激物を適用する前に、サンプルループをリンゲル液で少なくとも3回洗浄してください。1つの切片から取得したすべての画像のレジストレーションを行うため、次の刺激を適用するまで、MRO鼻腔感覚ニューロンが回復するまで4～10分間待機してください。このプロセスを自動化するために、Avisionでカスタム作成されたVBAスクリプトが使用されます。この場合、同一実験内のすべての画像フレームを、弾性変形（elastic）を用いて任意に選択した共通のリファレンスフレームにレジストレーションし、画像差分法を行うことで応答細胞を特定します。また、このプロセスを自動化するために、ImageJバージョン1.42のカスタム作成マクロが使用されます。各スタックに対して最小投影画像を作成し、元のスタックから最小投影画像を差し引くことで、反応した細胞を抽出します。次に、差し引いた後のスタックから関心領域（ROI）を特定し、Image Jのmulti mesureプラグインを用いてROI座標を取得します。その後、1つの実験におけるすべてのスタックを処理し、すべてのROI座標をROIマスターリストに保存します。続いて、自作のマクロとImage Jのmulti mesureプラグインを使用して、ROIマスターリストに基づき元の画像スタックから細胞反応を測定します。最後に、Matlabで反応曲線とヒートマップをプロットします。ここでは、4匹の個体マウスから採取した尿サンプルを用いたVNOイメージング実験の例を示します。約80個の細胞が少なくとも1つの尿刺激に対して反応を示しており、それらの反応のΔF/F値がヒートマップにプロットされています。ここでは、尿刺激による活性化のタイムコースを示す細胞1、2、および3の応答波形を示します。細胞1は、雌の尿サンプルの両方に反応していますが、雄のサンプルには反応していません。対照的に、細胞2は反対の活性化パターンを示し、雄の両方のサンプルに反応します。細胞3のみが、個々の雄および雌の両方のサンプルによって活性化されます。一度マウントすれば、スライスは30分で調製でき、適切に行えばピアノニューロンを6〜8時間生存させることが可能です。この手法を試みる際は、組織培養グレードの試薬を使用し、組織標本に組織固定試薬が接触しないようにすることが重要です。このビデオを視聴することで、G Campを発現するマウスを用い、Viennaニューロンにおける熱応答をイメージングするための生組織切片の調製方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は生きているの触角葉で匂い誘発カルシウム応答を測定し、分析するための確立された技術を記述する...

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官（VNO）によって媒介される。ここでは、カルシウムイメージングを行うためのVNOの急性組織のスライス標本が記載されている。この生理学的アプローチは、生体組織に集団および/または個々の神経細胞の観察を可能にし、受容体 -...

マウス鋤鼻急性組織スライス標本のイメージングフェロモンセンシング

このプロトコルでは、カルシウムイメージングの最近の進捗状況を更新...

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

プロトコルビデオは、マウスの鋤鼻器官(VNO)の感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立について説明しています。蛍光標識された感覚ニューロンを備えた冠状VNOスライスを記録セットアップに配置します。標識されたニューロンは、化学刺激に応答して電気生理学的記録のために、全細胞構成の記録ピペットでパッチされます。...

鋤鼻感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

ここでは、マウスの鋤鼻器官の急性冠組織切片における感覚ニューロンの定義された集団の同定と詳細な分析を可能にする生理学的アプローチについて説明します。...

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

このプロトコルでは、線虫みみずの動作における神経活動の変更を記録する遺伝子にエンコードされた Ca2...

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

ここでは、ショウジョウバエの学習と記憶の文脈で、前および/または後のカルシウムを視覚化できるプロトコルを提示する。シナプス的に局在するカルシウムセンサを用いた生体内カルシウムイメージングでは、この種の連想学習の根底にあるシナプス可塑性が決定され得るように、古典的な嗅覚調節パラダイムと組み合わされる。...

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

ここでは、生きた麻酔薬用マウスのジェニュー酸神経節を暴露する方法と、カルシウムイメージングを使用してこれらのニューロンのアンサンブルの応答を測定して刺激を味わう方法を紹介し、異なる覚醒剤を用いた複数の試験を可能にする。これにより、どのニューロンがどのタスタントに反応するかを深く比較することができます。...

マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

我々は、腹側から成虫マウスの脳幹を暴露するプロトコルを提示する。ミニチュア顕微鏡で傾斜屈折率レンズを用いることで、インビボでのオリーブ神経ソマタの活性を調べるためにカルシウムイメージングを用いることができる。...

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

このプロトコルは、無傷の三叉神経節(TG)ニューロンの in vivoGCaMPカルシウムイメージングを記述します。この説明には、TG 曝露手術、TG ニューロンの in vivo 共焦点顕微鏡イメージング、TG ニューロン顕微鏡イメージング中の体細胞刺激の適用、および in vivo GCaMP カルシウム イメージング...

インビボ 無傷の三叉神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

学ぶ鋤鼻器スライス標本のカルシウムイメージング法。G-CaMP2発現トランスジェニックマウスを用いて、フェロモン刺激に対する神経細胞応答パターンを解析します。この手法は哺乳類の化学的コミュニケーション理解に貢献します。

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

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