コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

この手順の全体的な目的は、長さ100 nanometersの短いDNA分子を、適切に校正された一定の光学的力で操作することです。これは、DNAの一端をカバーガラスに、もう一端をポリスチレンマイクロビーズに係留させることで達成されます。次に、光ピンセットのアライメントと校正を行います。

次に、マイクロ球に作用する勾配力と散乱力の組み合わせにより、DNAを表面から引き延ばします。最後に、ビーズをポテンシャルの線形領域でトラップすることで、DNAを伸展させます。このプロトコルは、DNAの機械的特性やDNA-タンパク質結合キネティクスの研究に使用されており、さらに、短いDNA構築物の弾性における境界条件の重要性を解明するのに有用であることが示されています。

一般的に、この手法に不慣れな方は、定力光ピンセットの光軸合わせとキャリブレーションが困難かつ複雑であるため、苦労することがあります。この光ピンセットでは、1064 nanometerのレーザー光を直交偏光した2つのビームに分割して使用します。一方はバイオ分子の操作に使用され、もう一方はキャリブレーションに使用されます。

操作ビームの強度は、AO光学デフレクターまたはODによって制御されます。その後、ビームは別の偏光ビームスプリッターで再結合されます。これらのビームは、Plan APO 60 x 1.4油浸顕微鏡対物レンズによって試料セル上に強く集光されます。このピンセット装置は、自作の明視野顕微鏡と組み合わせており、ハロゲンランプからの照明がコンデンサーによって試料室上に集光されます。

明視野像はダイクロイックミラーによってレーザー光から分離され、2台のCCDカメラで撮像されます。一方のCCDはデータ取得の主要な手段として機能し、正確なサンプリングレートを得るためにソフトウェアでトリガーされます。もう一方のCCDは、固定された単一のリファレンスマイクロ球を撮像するために使用され、その位置を顕微鏡のドリフトを補正するためのフィードバック制御システムとして利用します。

XYステージによって対物レンズに対してサンプルを粗定位し、その後、組み込まれた3次元pisoステージによって精密に定位させます。前方に散乱および透過したレーザー光を明視野コンデンサーで集光し、光検出器に集光させてビーズのサイズを校正します。リン酸緩衝生理食塩水で希釈した直径800 nanometerのポリスチレン微粒子分散液をサンプルチャンバーに充填します。10〜15分間静置した後、緩衝液で軽くフラッシュします。

過剰なマイクロスフェアを除去するため、カバーガラスにランダムに付着しているマイクロスフェアを特定し、マイクロスフェアが焦点から約1 µm下に位置するまでサンプルチャンバーの高さを調整します。LabVIEWを用いて像の見かけのサイズを測定するためのデフォーカス画像を作成するには、まず幾何学的パターンマッチング機能を使用してマイクロスフェアの中心を特定します。次に、360度平均を取ることで、マイクロスフェアの放射状強度プロファイルを生成します。

各断面の中心付近において、明視野画像の各白いリングに対応するラジアルプロファイルを2次関数でフィッティングします。輝度のピークを特定し、このピークと中心との距離を、キャリブレーション済みのpisoステージを用いたビーズの見かけのサイズの尺度として使用します。マイクロ spheres の軸方向の位置を徐々に変化させ、各位置でCCDカメラを用いて画像を取得します。連続する各画像に対して画像解析を繰り返し、マイクロ spheres の見かけのサイズと軸方向の位置との相関を調べます。

本手法で得られる軸方向分解能は約1.4 nanometersです。操作ビームの光ポテンシャルをマッピングするには、まず操作ビームをオフにした状態で、操作ビームとキャリブレーションビームの同軸合わせ（coline）およびアライメントを行います。次に、より拘束力の強いキャリブレーションビームのトラップ内に自由微小球を閉じ込めます。その後、操作ビームをオンにします。

校正ビームよりもはるかに弱いため、マイクロスフィアの軸方向の位置はわずかに変動します。その結果生じる軸方向位置の変化は、既述のとおり、脱焦点明視野像から測定できます。軸方向のフォーカスを移動させてこれを繰り返し、校正ビームのフォーカス位置に対する変位 delta X をプロットします。

マイクロ spheres の最大変位に対応する軸方向の位置によって、光学トラップの線形領域の中心が決定されます。DNAサンプルのストレッチを行うには、表面にテザリングされたDNA分子を含むチャンバーをマウントし、明視野像を観察しながら、望遠鏡を調整して操作ビームの焦点が伸展前のマイクロ spheres のわずかに上に位置するようにします。次に、マイクロ spheres のいずれか一つがトラップされるまでステージの位置を調整します。マイクロ spheres を光学トラップのXY平面の中心付近に配置し、LabVIEWで一連の方形波を生成してAODに送信し、レーザービームを繰り返しオン・オフさせます。

トラップのオン・オフを繰り返し切り替えながら、マイクロスフィアを観察します。そして、X方向およびY方向でマイクロスフィアの位置を繰り返し調整し、レーザーによってマイクロスフィアの運動に特定の方向性が誘発されるかを確認してください。ピエゾステージを制御することで、レーザーがオンのときは運動が著しく制限されますが、X-Y平面におけるマイクロスフィアのランダム運動は等方的になるはずです。

次に、ビーズをZ方向に調整します。ここでも、レーザービームをパルス状にオン・オフさせます。この際、マイクロスフィアの軸方向の変位を同時にリアルタイムで測定します。

ステージを線形領域の中心、すなわちDNAランプを伸展させた際にZ方向の変位が最大となる点に合わせます。A ODに0 Vから0.5 Vまで0.025 V刻みで電圧信号を送り、レーザー強度を調整します。100 fpsで400フレームを記録し、それらを平均化して軸方向の変位を求めます。最後に、力-伸長曲線をプロットし、修正WLC（worm-like chain）モデルにフィットさせます。

ここに示されているのは、1塩基対、298塩基対、および247塩基対の長さの短鎖DNAにおける2D NA配列の力-伸長曲線です。従来の Worm-like Chain（WLC）モデルでは、これらの長さスケールにおいて有限サイズ効果および境界制約に起因する零力伸長を考慮する必要があるため、力-伸長関係を完全に説明することはできません。したがって、力-伸長測定値は修正WLCモデルを用いてフィッティングさせる必要があります。このモデルでは、補足資料に詳述されている通り、有効持続長と零力伸長がフィッティングパラメータとして設定されています。

D-S-D-N-Aの輪郭長が十分に長い場合、有効持続長は単に公称持続長の約50 nanometersとなり、修正WLCフィットにおいて零力伸長は無視することができます。有効持続長は、1,298 base pairのDNAでは35 nanometers、247 base pairのDNAでは25 nanometersでした。この手法の開発により、調節タンパク質が媒介するDNAループの形成および崩壊のキネティクスに関する研究を含む、DNAおよびDNA-タンパク質複合体のさまざまなナノ機械的測定への道が開かれました。