無傷の網膜におけるGFP発現細胞集団の電気生理学的特性

本手順の全体的な目的は、特定の細胞型にのみ蛍光マーカーを発現するマウス系統を用い、無傷の網膜における単一ニューロンの光応答および形態を解析することである。まず、眼球を解剖して網膜を単離する。次に、網膜を共焦点レーザー走査顕微鏡に設置し、二光子赤外励起によって細胞を可視化する。

次に、マイクロピペットを用いてホールセルパッチクランプ構成を形成し、記録および色素充填を行います。最終的に、この調製により光刺激に対する細胞応答の記録が可能となり、共焦点顕微鏡によって記録した細胞の形態を明らかにすることができます。網膜からの非誘導的なパッチクランプ記録のような既存の手法に対する本手法の主な利点は、励起光で網膜を刺激することなく、蛍光標識された細胞に向けて視覚的に記録を誘導できる点にあります。

この手法は、特定の細胞集団が視覚情報の処理にどのように寄与しているかなど、網膜研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これは、たとえその細胞集団の密度が低く、同定を容易にする明確な形態学的特徴を持たない場合であっても可能です。本実験を開始する前に、マウスを少なくとも3時間暗順応させてください。

その間に、付属の論文に記載されている通りに細胞外液を調製し、室温でカーボゲンをバブリングします。次に、マウスを安楽死させ、湾曲した虹彩剪刀を用いて眼球を摘出します。摘出した眼球を細胞外液を満たしたディッシュに移します。

次に、スプリングシザーを用いて、それを解剖顕微鏡下に配置します。 Ora serrata（鋸状縁）に沿って眼球を開き、角膜と毛様体を除去します。水晶体を取り出し、網膜を色素上皮から慎重に分離します。

その後、網膜と色素上皮の間で視神経を切断します。眼杯から網膜を取り出します。丸まった網膜の内側が神経節細胞側であることに注意してください。

外側が光受容器側です。続いて、木製爪楊枝を用いてそっと引き剥がし、網膜内表面から硝子体を除去します。その後、組織を平坦化しやすくするため、網膜の周囲に沿って短い切開を加えます。

次に、網膜を光受容体側を下にして記録チャンバーに移動させます。細い筆を用いてガラス底面に広げ、ステンレス製のナイロン糸付きフレームで固定します。記録チャンバーを正立型レーザー走査顕微鏡の下の暗所に設置します。

網膜標本に、1分間に5 mL以上の速度で絶えず超灌流を行います。35 °Cに加熱し、酸素飽和させた細胞外液を用い、顕微鏡はファラデーケージ内の振動吸収エアテーブル上に設置します。電磁遮蔽のため、また標本を暗所に保つため、ケージを不透明なカーテンで覆ってください。

また、赤色の透過フィルムを用いてコンピュータモニターからの光を遮断します。赤外線レーザーを850〜870 nmまたはそれ以上の長波長に調整します。モードロック状態に切り替え、二光子励起を用いてGFP発現細胞を可視化します。

パッチクランプ記録を行うために、付属の原稿に記載されている通り、蛍光プローブを含む細胞内溶液をホウケイ酸ガラス製マイクロピペットに充填します。次に、マイクロピペットをホルダーに挿入します。参照電極が記録室内の細胞外溶液に接触していることを確認してください。

次に、40倍の水浸対物レンズを用いて、マイクロピペットを標的のA GFP発現細胞に押し当てます。Omicron細胞体は、神経節細胞層および内境界膜の近位部分に位置しています。マイクロピペットが標的細胞に接触する前に、網膜表面の内境界膜を貫通させます。貫通に成功すると、マイクロピペットの先端から細胞内液が押し出され、内境界膜がその下の網膜組織から剥離します。細胞内液に含まれる蛍光色素により、目的の細胞に接近している際のマイクロピペットの位置を2光子画像で確認できます。

次に、マイクロピペットの圧力を解除し、ホールセルパッチクランプ構成にします。カレントクランプモードにおいて、有効な記録では膜電位が-50から-55 mVであり、少なくとも20分間維持される必要があります。その後、コンピューターモニターで作成した視覚刺激を提示します。

ビーム光路にニュートラル密度フィルターを挿入して刺激強度を調整し、刺激の空間的位置を記録対象細胞の中心に合わせて調整します。次に、刺激プロトコルを開始し、光応答を記録します。刺激ジェネレーターを使用して記録ソフトウェアをトリガーしてください。

刺激のタイミングを記録するため、ビームパス内にフォトダイオードを設置してください。マイクロピペットを後退させる際、細胞体を引き出さないよう注意してください。色素充填が完了したら、蛍光剤が記録細胞に拡散するまで30〜45分間待機させます。

こちらは、プロモーター下でGFPを発現させた網膜フラットマウントの例です。チロシン水酸化酵素の場合、GFP信号の強度によって2つの細胞集団を区別できます。図Aの矢頭で示されているように、内顆粒層に位置するタイプ1のドーパミン作動性細胞は、弱い蛍光を発現しています。タイプ2の細胞は強烈に標識されており、その細胞体は図Aの矢印で示されるように内顆粒層にあるか、あるいは図Bに示されるように神経節細胞層に偏在しています。図Cは、内網状層の第3層におけるタイプ2細胞の樹状突起の層状構造を示しています。ここでは、トレーサーであるニューロビオチンを注入したタイプ2細胞の形態例を示しています。

その後、トレーサーを蛍光標識したストレプトアビジン（ここではマゼンタ色で表示）に結合させることで可視化しました。ここでは、神経節細胞層に位置するタイプ2細胞の、白色光に対する異なる応答パターンを示します。この手順に従い、刺激の開始時および終了時の応答成分をより明確に区別するために、3秒間の長時間刺激を用いました。

網膜回路における特定の細胞型の機能的な役割など、さらなる疑問を解決するために、薬理学的実験、カルシウムイメージング、または免疫化学などの他の手法を実施することができます。