無傷の網膜におけるGFP発現細胞集団の電気生理学的特性

この手順の全体的な目標は、特定の細胞タイプでのみ蛍光マーカーを発現するマウスラインを使用して、無傷の網膜における単一ニューロンの光応答と形態を研究することです。これは、最初に目を解剖して孤立した網膜を得ることによって達成されます。2番目のステップは、網膜をレーザー走査型顕微鏡の下に置き、2光子赤外線励起によって細胞を視覚化することです。

次に、マイクロピペットを使用して、記録および色素充填のための全細胞パッチクランプ構成を取得します。最終的に、この調製物は、光刺激に対する細胞応答の記録を可能にし、共焦点顕微鏡法によって記録された細胞の形態を明らかにする。網膜からのガイドなしパッチクランプ記録のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、励起光で網膜を刺激することなく、蛍光標識細胞に視覚的に記録を向けることができることです。

この方法は、視覚情報の処理に対する特定の細胞集団の寄与は何かなど、網膜研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。細胞集団の密度が低く、同定を容易にする可能性のある明確な形態学的特徴を持たない場合でも。この実験は、実験の少なくとも3時間前にマウスを暗闇に適応させることから始めます。

その間に、添付の原稿に記載されているように細胞外溶液を調製し、室温でカルボゲンで泡立てます。次に、マウスを犠牲にし、湾曲した虹彩ハサミで目を核形成します。それらを細胞外溶液の皿に移します。

次に、スプリングハサミで解剖顕微鏡の下に置きます。オーラセラタに沿って眼球を開いて、角膜と毛様体を取り除きます。レンズを取り出し、網膜を色素上皮から慎重に分離します。

その後、網膜と色素上皮の間の視神経を切断します。アイカップから網膜を取り外します。カールした網膜の内側が神経節細胞側であることに注意してください。

外側は視細胞側です。その後、木製のつまようじを使用して硝子体をそっと引き抜くことにより、網膜の内側表面から硝子体を取り除きます。次に、網膜周囲に沿って短い切開を適用して、組織の平坦化を促進します。

次に、視細胞側を下にして網膜を記録室に移します。細かいブラシでガラスの底に広げ、ステンレス鋼のナイロン張られたフレームで固定します。記録チャンバーを暗闇の中、直立したレーザー走査型顕微鏡の下に置きます。

網膜製剤を毎分5ミリリットル以上で連続的に融合させます。車内に酸素を含んだ細胞外溶液を摂氏35度に加熱した顕微鏡は、ファラデーケージ内の衝撃吸収エアテーブル上に置かれています。電子シールドの場合は、ケージを不透明なカーテンで覆い、準備と暗さを保ちます。

また、パソコンのモニターからの光を赤い透明フィルムで遮蔽します。赤外線レーザーを850〜870ナノメートル以上の波長に調整します。モードロック状態に切り替え、2光子励起を使用してGFP発現細胞を可視化します。

パッチクランプ記録の場合は、添付の原稿に記載されているように、ホウ素ケイ酸ガラスマイクロピペットに蛍光プローブを含む細胞内溶液を充填します。次に、マイクロピペットをホルダーに挿入します。参照電極が記録チャンバー内の細胞外溶液と接触していることを確認してください。

次に、40倍水浸対物レンズを使用してマイクロピペットターゲットA GFP発現細胞に圧力を加えると、オミクロン細胞体は、標的細胞とのマイクロピペット接触が網膜表面の内部制限膜を貫通する前に、神経節細胞層およびインタークリア層の近位部分に位置しています。浸透の成功は、マイクロピペットの先端から排出される細胞内溶液と、その下にある網膜組織からの内部制限膜の剥離によって認識されます。細胞内溶液中の蛍光色素は、目的の細胞に近づきながら、2光子像のマイクロピペット位置を明らかにすることができます。

次に、マイクロピペットから圧力を解放し、全細胞パッチクランプ構成を取得します。電流クランプモードでは、使用可能な記録は、マイナス50〜マイナス55ミリボルトの膜電位を与え、少なくとも20分間持続するはずです。その後、作成した視覚刺激をコンピューターのモニターに提示します。

ビームパスに減光フィルターを挿入して刺激強度を調整し、刺激の空間位置を記録された細胞の中心に調整します。次に、刺激プロトコルを開始し、光の反応を記録します。刺激発生器を使用して、録音ソフトウェアをトリガーします。

ビームパス内にフォトダイオードを含めて、刺激タイミングを記録します。マイクロピペットを引っ込める際は、細胞本体を引き抜かないように注意してください。染料の充填が完了したら、蛍光剤を記録された細胞に30〜45分間拡散させます。

これは、それらのプロモーターの下の網膜フラットマウントで細胞を発現するGFPの例である チロシンヒドロキシラーゼの場合、2つの集団はGFPシグナルの明るさによって区別できる。インタークリア層に位置するタイプ1のドーパミン作動性細胞は、矢印で示されているように弱い蛍光を発現します。図Aでは、タイプ2細胞は強く標識され、図Aの矢印で示されるように層に細胞体を持つか、図Bに示すように神経節細胞層に変位し、図Cは、内側のフジツボ層の層3におけるタイプ2細胞の樹状突起層別化を示しており、ここに示されているのは、トレーサーニューロビオチンを注入されたタイプ2細胞の形態の一例である。

トレーサーは、蛍光標識されたストレプトアビジンに結合することにより、後で視覚化されました。これは、ここではマゼンタで示されています。これは、神経節細胞層に位置する2型細胞の白色光に対するさまざまな応答パターンです。この手順に続いて、刺激、開始、およびオフセット時の応答成分をより明確に区別するために、3秒間の長時間の刺激が使用されました。

薬理学的実験、カルシウムイメージング、免疫化学などの他の方法を実行して、網膜回路における特定の細胞タイプの機能的役割などの追加の質問に答えることができます。