酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

この実験は、アセテートキナーゼのアセテート形成活性を直接測定することを目的としています。アセチルリン酸とDP基質を含む反応混合物に酵素を添加して反応を開始します。次に、ヒドロキシラミン塩酸塩を加えて、残りのリン酸アセチルをヒドロキシル酸アセチルに変換します。

アセチルヒドロキシレートを測定可能な着色されたヒドロキシル酸第二鉄錯体に変換する開発ソリューションを追加します。反応結果で消費されるアセチルリン酸基質の量に基づく分光法により、酵素速度論的パラメータの決定が可能になります。この手法が既存の方法よりも優れている点は、TP生産とA DPの還元を分離するのではなく、アセチルリン酸の消費量を直接測定することに基づいています。このアッセイはTP生産に依存しないため、TPの代わりにパワーリンフェクトを生成するアセテートキナーゼの新しいグループに使用できます6〜8ポイントの標準曲線の場合、アセチルリン酸ストック溶液を100ミリモルトリスで希釈し、最終サンプル量300マイクロリットルにもアセチルリン酸を含まないコントロールサンプルが含まれ、摂氏37度のヒートブロックですべてのサンプルを平衡化します。すぐに。

次に、50マイクロリットルの2モルヒドロキシラミン塩酸塩を加え、3回振とうして混合し、摂氏60度のヒートブロックで5分間インキュベートします。次に、3回振とうして100マイクロリットルの現像液混合物を加え、室温で少なくとも1分間発色させます。分光光度計用のプラスチックキュベットを使用してサンプルを遠心分離します。

540ナノメートルでサンプルを測定します。適切なデータ解析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して、540ナノメートルとマイクロモルのアセチルリン酸での吸光度の比較標準曲線を作成します。r の 2 乗値を計算します。

300マイクロリットルのアリコートの反応混合物をマイクロ遠心分離チューブに分配します。酵素平衡チューブを使用せずに、摂氏37度で1分間のコントロール反応を含めることを忘れないでください。複数の反応を行う場合は、特定の時間間隔でチューブに酵素を追加し、すぐに各チューブを摂氏37度のヒートブロックに戻します。

5分後、50マイクロリットルの2モルヒドロキシラミン塩酸塩を加え、60°Cで5分間混合してインキュベートします。次に、100マイクロリットルの現像液を加え、混合して室温で発色します。次に、サンプルを 18 、 000 倍の G で 1 分間遠心分離します。

540ナノメートルでの吸光度の測定に進みます。アセチルリン酸の標準曲線と比較して、存在するアセチルリン酸の量を決定します。データをプロットし、McKayla Cementin方程式に当てはめて、動力学的パラメータを決定することができます。

このアッセイは、アセテート形成方向のアセテートキナーゼ活性を測定するために、アセチルリン酸基質の消費量を決定します。酵素反応中に一定時間後に残ったリン酸アセチルは、オキシベート酸アセチルに変換され、続いてヒドロキシ第二鉄酸錯体に変換され、540ナノメートルで測定できる赤みがかった色をしています。540ナノメートルでの吸光度をプロットしたこの典型的な標準曲線は、マイクロモルのアセチルリン酸に対して、1マイクロモルのアセチルリン酸あたり1.2332の吸光度単位の傾きを持っています。

結果の r 二乗値 0.99 は、データがここに示されているように線形方程式によく適合していることを示しています。このアッセイは、さまざまな酵素調製物のアセチルリン酸のKMを決定するために使用できます。5ミリモルで、メタノールSarina好熱性から精製された組換えアセテートキナーゼのアセチルリン酸の濃度が異なるDPは、各基質の標準的なマッケイラセメンチンのような動力学に従い、0.27プラスマイナス0.01ミリモルのアセチルリン酸の見かけのKMをもたらします。

このダイレクトアッセイは、標準的なカップリングアッセイとは異なり、TP以外の基質を利用したアセテートキナーゼの活性を測定することができます。例えば、ピロリン酸を産生するinba histolyticaアセテートキナーゼによるアセチルリン酸の利用では、反応混合物中のDPの代わりにリン酸ナトリウムが置換されました。結果の曲線は、0.50 プラスマイナス 0.006 ミリモルのアセチルリン酸の見かけの KM 値を示しています。このビデオを見た後、消費されるアセチルリン酸の量を決定することにより、アセテートキナーゼ活性を直接測定する方法について良いアイデアが得られるはずです。

再現性のある結果を得るための重要な要素は、各ステップ、特に酵素の添加と混合ステップで一貫性を保つことです。