酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

本実験の目的は、アセテートキナーゼのアセテート生成活性を直接測定することです。アセチルリン酸およびDP基質を含む反応混合液に酵素を添加して反応を開始させます。その後、塩酸ヒドロキシルアミンを添加し、残存するアセチルリン酸をアセチルヒドロキシル酸に変換します。

現像液を添加し、アセチルヒドロキシル体を、測定可能な有色のフェリヒドロキシル錯体へと変換します。反応で消費されたアセチルリン酸基質の量に基づく分光光度法により、酵素反応速度論的パラメータの決定が可能です。既存の手法に対する本手法の利点は、ATP産生とADP還元を共役させるのではなく、アセチルリン酸の消費を直接測定している点にあります。本アッセイはATP産生に依存しないため、ATPの代わりにピロリン酸を産生する新しいグループのアセテートキナーゼにも適用できます。6〜8点の標準曲線を作成するため、アセチルリン酸ストック溶液を100 mM Trisで希釈し、最終サンプル容量を300 µLにします。また、アセチルリン酸を含まないコントロールサンプルも用意してください。すべてのサンプルを37 °Cのヒートブロックで1分間平衡化させます。

次に、2 Mの塩酸ヒドロキシルアミンを50 µL加え、3回振とうして混合し、60 °Cのヒートブロックで5分間インキュベートします。その後、発色溶液を100 µL加え、3回振とうして混合し、室温で少なくとも1分間発色させます。分光光度計用のプラスチックキュベットを用いて、サンプルを遠心分離します。

540ナノメートルで試料を測定します。適切なデータ解析およびグラフ作成ソフトウェアを用いて、540ナノメートルにおける吸光度とアセチルリン酸のマイクロモルの標準曲線を生成します。R²値を算出してください。

反応混合液を300 µLずつマイクロ遠心チューブに分注します。酵素を加えないコントロール反応を含めることを忘れないでください。チューブを37 °Cで1分間平衡化させます。複数の反応を行う場合は、特定の時間間隔でチューブに酵素を加え、直ちに各チューブを37 °Cのヒートブロックに戻します。

5分後、2 Mのヒドロキシルアミン塩酸塩を50 µL加え、混合して60 °Cで5分間インキュベートします。次に、現像液を100 µL加え、混合して室温で発色させます。その後、サンプルを18,000 ×gで1分間遠心分離します。

540 nanometersで吸光度を測定します。アセチルリン酸標準曲線と比較して、存在するアセチルリン酸の量を決定します。得られたデータはプロットし、McKayla Cementin式に当てはめることで速度論的パラメータを決定できます。

本アッセイでは、アセチルリン酸基質の消費量を測定することにより、酢酸生成方向へのアセテートキナーゼ活性を決定します。酵素反応中の一定時間後に残存したアセチルリン酸は、アセチルオキシバテに変換され、続いて赤色を呈するフェリヒドロキシアテ錯体へと変換されます。この色は540 nmで測定可能です。540 nmにおける吸光度をアセチルリン酸のµmol数に対してプロットした標準曲線において、その傾きはアセチルリン酸1 µmolあたり1.2332吸光度単位となります。

得られたR²値が0.99であることは、データがここに示す直線式に良好に適合していることを示しています。このアッセイは、さまざまな酵素調製物におけるアセチルリン酸のKM値を決定するために使用できます。5 mMのDPおよび変動する濃度のアセチルリン酸存在下において、メタノール利用性好熱菌から精製したリコンビナントアセテートキナーゼは、各基質に対して標準的なミカエリス・メンテン型の速度論に従い、その結果、アセチルリン酸の見かけのKM値は0.27 ± 0.01 mMとなりました。

標準的なカップリングアッセイとは異なり、このダイレクトアッセイでは、TP以外の基質を利用するアセテートキナーゼの活性を測定できます。例えば、ピロリン酸を生成する Entamoeba histolytica アセテートキナーゼによるアセチルリン酸の利用においては、反応混合液中の DP をリン酸ナトリウムに置換しました。得られた曲線から、アセチルリン酸の見かけの KM 値は 0.50 ± 0.006 mM であることが示されています。このビデオを視聴することで、消費されたアセチルリン酸量を測定し、アセテートキナーゼ活性を直接的に測定する方法について十分に理解できるはずです。

再現性のある結果を得るための重要な要因は、各ステップ、特に酵素の添加と混合のステップにおいて一貫性を維持することです。