プルダウンカルモジュリン結合タンパク質の

この手順の全体的な目的は、カルシウム依存的にCal Modlinに結合するタンパク質を試験することです。これは、まず目的のタンパク質を回収し、次にタンパク質結合用のカルモジュリンセロビーズを調製することによって達成されます。

次に、タンパク質をカルモジュリンビーズとともにインキュベートします。最後に、カルシウム依存的に結合するタンパク質を溶出させます。最終的に、ウェスタンブロッティング解析を通じて、カルシウムの存在下または不在下でカルモジュリンに結合するタンパク質を示す結果を得ることができます。

この手法の、カラムクロマトグラフィーや免疫沈降などの他の既存手法に対する主な利点は、必要となるタンパク質量が少なく、時間も短縮できる点にあります。この方法は、どのようなタンパク質がカルシウム依存的にcow modlinに結合するのか、また、翻訳後修飾がcow modlinへの結合にどのような影響を与えるのかなど、cow modlinシグナリング分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。ビーズのハンドリングステップが不可欠であり、ビーズの再懸濁と回収についての記述は実際に見なければ理解しにくいため、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

組織を準備し、目的の組換えタンパク質を発現するプラスミドを含むウイルスを、均質な注入・器官培養海馬スライスに導入します。本例では、組換えタンパク質としてGFPタグ付きNeuro Grandinを使用します。ウイルス注入後、約12～18時間のオーバーナイトで組織にタンパク質を発現させた後、シャーレに1 mLの解剖バッファーを加えます。

インサートに入った培養組織をペトリ皿に移し、メスを用いて、組織が浸るようにインサートに2 mLの解剖バッファーを加えます。逆向きのパスツールピペットでインサート膜から組織を静かに掻き出し、5〜10枚の海馬オルガノタイプ組織切片を回収します。懸濁した組織を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

次に、サンプルを1500 RCFで1分間遠心分離します。組織を解剖バッファーから分離させるため、上清を吸引して慎重に除きます。その際、ペレットを乱さないように注意してください。

使用する各スライスについて、先端を切断した1 mLピペットを用いて組織を30～60 µLのホモジナイズ緩衝液に加え、ペッスルで十分にホモジナイズした後、ホモジナイズ液を元のチューブに戻します。細胞残渣を除去するため、残りのホモジナイズ液を1100 RCFで10分間遠心分離し、ペレットによる混入を避けながら吸引して上清を慎重に回収します。上清の10%をインプットサンプルとして分注します。

cal seroビーズの使用準備を行う間、残りの上清は氷上で保存します。その後、各プルダウンにおいて、懸濁させたcal Modlin Seroビーズ400 µLを、インキュベーション中の表面積を最大化し溶液とビーズの相互作用を高めるため、底面が比較的平らな2 mLマイクロ遠心チューブにピペットで分注します。マイクロ遠心チューブを横にして回転させてビーズを濡らし、次いでビーズを21,000 ×gで30秒間遠心分離します。

そして、吸引によって上澄みを注意深く除去します。ビーズを乱さないように注意しながら、それぞれのホモジナイズバッファー 100 µL でビーズを洗浄します。このバッファーには、カルシウム・カルモジュリン結合タンパク質をプルダウンするために使用するビーズの場合は 2 mM calcium chloride を、アポカルモジュリン結合タンパク質をプルダウンするために使用するビーズの場合は既知のカルシウムキレート剤である 2 mM EDTA を含ませます。

チューブを軽く叩いて再懸濁します。ビーズを懸濁させ、1500 RCFで1分間遠心分離します。プルダウンのためにカルモジュリン・スフェロスにタンパク質を結合させるため、ビーズを乱さないように注意しながら、吸引によって上清を慎重に取り除きます。

まず、SNATを2等分します。各分注の条件に応じて、塩化カルシウムまたはEDTAを上清に加え、最終濃度が2 mMとなるように調整します。その後、この上清を、適切なホモジナイズ緩衝液に入った洗浄済みビーズに加えます。

チューブを軽く叩いて混ぜ合わせます。サンプルをシェーカーで4 °Cにて3時間インキュベートします。結合効率を高めるため、30分おきにビーズを再懸濁させます。

次に、サンプルを1500 RCFで3分間遠心分離します。未結合タンパク質のサンプルとして上清を50 µL分取し、残りの上清をアスピレーションで慎重に除去して廃棄します。前述と同様に、適切なホモジナイズバッファー100 µLを用いて、ビーズを3回洗浄します。

本手順において最も困難なステップは、標的タンパク質を効率的に溶出させることです。成功させるための最善の方法は、ビーズの損失を最小限に抑えるために適切な種類のチューブを使用し、あらかじめ加温した溶出バッファーでビーズを適切に再懸濁させることです。溶出バッファーを事前に温めておくことも、溶出効率を大幅に向上させることができます。ビーズに50 µLの溶出バッファーを加えてタンパク質を溶出させます。

カルシウムを含むバッファーでホモジナイズおよび結合させたサンプルはEDTAを含むバッファーに、EDTAを含むバッファーを使用したサンプルはカルシウムを含むバッファーにそれぞれ置換します。シェーカーを用いて、ビーズを室温で30分間インキュベートしてください。約5分おきにチューブを軽く叩いて、ビーズを混ぜ合わせます。

ビーズを1500 RCFで3分間遠心分離し、結合タンパク質サンプルとなる50 µLのSNATを吸引により慎重に除去します。このとき、ビーズを乱さないように注意してください。SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを行い、対照条件において目的タンパク質がポジティブコントロールとして同定されるかを確認します。

Prop Proタンパク質はCal Modlinに結合することが知られています。この図は、内因性neuro Grandinと比較して、GFP TAG Neuro GrandinのCal MODLIN結合能を検証したCal Modlinプルダウンアッセイの一例を示しています。均質入力（homogenous input）は、内因性neuro Grandinの既知の結合に基づいた予想通り、内因性neuro grandinおよびカルシウム・カルモジュリン依存性キナーゼIIに加えて、GFP neuro Grandinが発現していたことを示しています。

GFPタグ付きNeuro Grandinは、カルシウム不在下で溶出した一方、カルシウム存在下では結合しませんでした。対照的に、コントロールとして用いたカルシウム・カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIは、カルシウム存在下でのみ溶出し、不在下では未結合でした。この結果は、カルモジュリンビーズが適切に機能しており、EEUが効率的であったことを示しています。

最も重要な点は、GFP-neurograninが内因性フォームと同様の様式でApo-Calmodulinに結合することを示しており、GFPタグが組換えタンパク質の機能を変化させなかったことが示唆されることです。この手法を習得すれば、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析を除き、適切に行えば6時間以内に完了させることができます。本手順を実施する際は、カルシウム濃度のわずかな変動が実験全体に影響を及ぼす可能性があるため、すべてのサンプルとチューブに適切な条件を明記したラベルを貼ることが重要です。このビデオを視聴することで、特定のタンパク質がカルシウム依存的にCALモジュールに結合する能力を効率的に判定する方法について、十分な理解を得ることができるはずです。

目的のタンパク質を回収し、適切に調製した共変調剤SROとインキュベートした後、結合したタンパク質を溶出し、ウェスタンブロット解析を用いて試験します。