カプセル化された細胞凝集体の中で低酸素シグナルの追跡
December 16th, 2011
架橋PEGハイドロゲル中の細胞の写真 - カプセル化する方法について説明する。カプセル化されたマウスインスリノーマ（MIN6）集合内の低酸素シグナルが蛍光マーカーシステムを用いて追跡されます。このシステムは、ハイドロゲル骨格と細胞表現型の変化と低酸素シグナル伝達の相関関係にあるセルの連続検査が可能になります。
この手順の全体的な目標は、PEGカプセル化細胞凝集体における低酸素症に対する細胞応答をモニタリングすることです。最初のステップでは、分散した細胞をマーカーウイルスに感染させ、次にシェーカーで培養して凝集体の形成を可能にします。次に、リニアペグが機能化され、PEG DMライマーが精製されます。
次に、細胞凝集体をPEG DMハイドロゲルにカプセル化します。最後に、ハイドロゲルをさまざまな酸素条件で培養しながら、低酸素マーカーシグナルを蛍光で監視します。最終的に、生存可能なカプセル化された細胞凝集体内の低酸素誘導因子活性の位置と程度は、単純な蛍光顕微鏡で視覚化できます。
この方法は、低酸素症が3D培養内のどこで発生するのか、細胞の生存と機能にどのように影響するのかなど、細胞カプセル化および細胞ベースの治療送達分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、凝集およびカプセル化された組織における低酸素症の主要な影響のために、再生医療のアプローチと、給付金糖尿病などのホルモン欠乏症の治療にまで及びます。低酸素誘導因子1の活性は、ベータ細胞からのインスリン分泌の大幅な減少と相関することが示されており、一次アイレットを解離して疑似アイレットに再形成する試みを動機付けています。
直径を小さくする骨材。当社のマーカーは、緩んだカプセル化材料内の細胞レベルの凝集体による低酸素誘導因子活性を示すことができます。PEGは、その良好な転写特性、細胞適合性、および機能修飾の容易さから、カプセル材料として選択されました。
約308マイクロリットルの覚醒剤、アクリル、無水物で40ミリリットルのガラスバイアルに2グラムのPEGを秤量した後、硬質プラスチックキャップでバイアルをゆるく閉じます。バイアルを標準的な家庭用電子レンジで2分間強火で加熱します。次に、耐熱手袋を着用し、バイアルを完全にボルテックスし、溶液をさらに5分間高温で電子レンジで加熱します。
バイアルを取り扱うのに十分なほど冷ましてから、バイアルを回転させながらキャップを外します。塩化メチレンをゆっくりと混合し、必要に応じてサンプルをボルテックスして、溶液が透明で均一になるまでします。次に、溶液を200ミリリットルの攪拌した冷たいダチルエーテルに滴下して、PEG dmを沈殿させます。
次に、真空ろ過でPEG DMを回収し、乾燥させます。PEG DMが乾燥したら、約100〜150ミリリットルの脱イオン水に溶解します。次に、透析後分子量カットオフが 1000 ダルトンの透析チューブで、脱イオン水に対して溶液を 5 日間透析します。
溶液を適切な容器に雄弁に詰め、摂氏マイナス80度で一晩冷凍します。次に、溶液を4日間凍結乾燥して精製された白色PEG DM粉末を生成し、処理した培養フラスコ表面から細胞を放出します。まず、培地を吸引し、37°CのCELsカルシウム、マグネシウムフリーHBSSで細胞をすすぎ、HBSSを吸引します。
次に、2ミリリットルの37°CトリップとEDTA溶液を加え、細胞を37°Cで3分間インキュベートします。次に、フラスコの側面をしっかりとジャーにして、細胞を摂氏37度の8ミリリットルでノックし、フラスコに中程度にして、細胞懸濁液を上下に激しくピペットで動かします。気泡が入らないように注意してください。
細胞溶液を滅菌済みの15ミリリットル遠心チューブに移した後、ヘモサイトメーターで細胞をカウントし、感染する細胞の総数を決定します。6つの井戸懸濁液培養プレートの井戸に井戸当たり400、000細胞を達成するために必要な量の細胞懸濁液を添加し、1.8ミリリットルのマイクロ遠心チューブに感染する細胞の井戸当たり50マイクロリットルのHBSSを分注する。次に、調製したHBSSに適切な量のウイルス懸濁液を慎重にピペットで移します。
次に、各ウェルに希釈したウイルスを適切な量で添加して目的のMOIを達成し、次に各ウェルに培地を追加して総量を最大1.7ミリリットルにします。最後に、プレートをオービタルシェーカーに置きますインキュベーター内で、シェーカーを約100 RPMの低設定に設定して、培地がウェルの周りを穏やかに洗浄し、細胞が24〜36時間凝集できるようにします。まず、1ミリリットルのプラスチックシリンジの先細りの先端を切り取り、開いてラックに置き、ヒドロゲルが形成される容器を作成します。
次に、20マイクロリットルの光活性PEG DM溶液をシリンジの開放端にピペットで注入し、プランジャーの表面全体をボリュームが覆っていることを確認します。プランジャーを少しずつ調整して、平らな流体表面を実現します。次に、ピペットをラックに戻し、ラックをUVランプの下に約8分間配置して、ハイドロゲルの架橋を可能にします。
この間、所望の数の細胞と凝集体を含むピペット容量を1.8ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。チューブにキャップをし、細胞と凝集体を130 gで5分間遠心分離します。その後、マイクロピペッターを使用して、チューブの先端にある細胞ペレットを乱さないように慎重に上清を取り除きます。
培地ヘッドがペレットに近づいたら、より細い10マイクロリットルのピペットチップを使用します 細胞凝集体をゲル前駆体溶液全体に均一に分散させながら、それらが完全にカプセル化されていることを確認します。これは、この手順の最も難しい部分です。この手順を実行するときは、ペレットをやさしく砂で磨き直して移すように注意してください。
次に、細胞ペレットを20マイクロリットルの光活性PEG DM溶液に穏やかに再懸濁します。広口ピペットチップを使用し、架橋ヒドロゲル部分の上のシリンジに細胞懸濁液を追加し、シリンジをさらに8分間のUV光にさらして、ハイドロゲルの構築を完了します。終了したら、細胞は円筒形のハイドロゲル内に完全にカプセル化する必要があります。
最後に、24ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルのHBSSを、別のウェルに1ミリリットルの培地を加えます。次に、シリンジからハイドロゲルをHBSSに排出して、ゲルを短時間洗浄します。ゲルを培地に移し、所望の条件下でプレートを培養する。
培養中の任意の時点で、蛍光顕微鏡を使用して細胞をイメージングし、低酸素シグナル伝達場所である24ウェルプレートを顕微鏡ステージに開始し、ウェルとハイドロゲルを対物レンズの下に配置して開始することができます。シグナルは、個々のシグナル伝達細胞を同定するのに十分な特異性を持っていますが、細胞内シグナルの局在を決定するには分解能が不十分な場合があります。シグナル伝達細胞では、シグナルは通常、細胞質全体で均一に観察されます。
この図は、ゲルセル内のPEGハイドロゲルにカプセル化されたminx凝集体の代表例を示しています。骨材は、ここで見られるように、マトリックスに完全に囲まれ、均一に分布して、より良い栄養素の輸送を可能にする必要があります。架橋ゲルが全体的に固体であり、反応が行われた容器の形状をとっていることに注意してください。
この図では、PEG DMハイドロゲル中の凝集した最小6個の細胞における代表的な蛍光低酸素シグナル伝達が、カプセル化され、次いで20%酸素で44時間インキュベートされた細胞が示されている。左の写真は、カプセル化された細胞を2%酸素で44時間インキュベートしている間、低酸素シグナル伝達を示さなかった。右のディスプレイに示されているように、クリアなユビキタスシグナル低酸素症は、他の細胞タイプでも追跡できます。
この図は、カプセル化された間葉系幹細胞凝集体における代表的な低酸素シグナル伝達を示しています。左端の図に見られるように、蛍光シグナルは2%酸素中で12時間で検出できず、中央の図に見られるように、24時間後には2%酸素でより顕著になります。そして最後に、右側に見られるように、この手順に続いて96時間後に2%の酸素が高発現します。
Elizaのような他の方法、分泌タンパク質の分析、および細胞生存率アッセイは、低酸素シグナル伝達を細胞表現型と相関させるために実行できます。この開発により、この技術は、組織工学および細胞ベースの治療送達の分野の研究者が、足場およびカプセル化材料内の細胞の生存機能と分化を探求するための道を開く可能性があります。
概要
この記事では、架橋PEGハイドロゲルにおける細胞の光封入法について説明し、封入されたマウスのインスリノーマ集合体の低酸素シグナリングの追跡を可能にします。この技術により、ハイドロゲルスキャフォールド内の細胞の連続的な観察が可能となり、低酸素シグナリングと細胞表現型の変化とを相関させます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞封入
- 低酸素シグナリング
- 再生医療
背景
- 低酸素は3D培養における細胞の生存と機能に影響を与えます。
- PEGは、その優れた転移特性と細胞適合性のために選択されます。
- 低酸素の理解は、ホルモン欠乏症を対象とする治療法にとって重要です。
- 低酸素誘導因子の活性は、ベータ細胞からのインスリン分泌と相関します。
研究の目的
- PEG封入集合体における低酸素に対する細胞応答を監視すること。
- 生存可能な細胞集合体内での低酸素誘導因子の活性を可視化すること。
- 細胞ベースの治療薬送達への影響を探ること。
使用した方法
- 分散細胞への蛍光マーカーウイルスの感染。
- シェーカー上で集合体を形成するための細胞培養。
- 直鎖PEGの機能化と精製。
- PEG DMハイドロゲルにおける細胞集合体の封入。
主要な結果
- ハイドロゲル内での細胞の成功的な封入。
- 様々な酸素条件下での低酸素マーカーシグナルの蛍光モニタリング。
- 細胞レベルでの低酸素誘導因子の活性の可視化。
- 細胞の生存と機能に対する低酸素の影響に関する洞察。
結論
- この方法は、3D培養における低酸素の研究に貴重なツールを提供します。
- 再生医療と糖尿病治療に応用できる可能性があります。
- さらなる研究により、細胞ベースの治療法の理解を深めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Monitoring hypoxic signaling in encapsulated cell aggregates addresses a critical challenge in cell-based therapies: ensuring functional viability of transplanted tissues under diffusion-limited conditions. This method enables early detection of oxygen deprivation impacts on insulin-producing cells, supporting predictive confidence in therapeutic efficacy. By correlating HIF-1α activity with functional readouts, it aids in de-risking encapsulation strategies for diabetes and regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking hypoxia-inducible factor activation to functional decline in insulin secretion.
- Operational Value: Provides a quantifiable fluorescent readout for pathway clarification in encapsulated beta-cell models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying oxygen thresholds that compromise cell function prior to in vivo testing.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized hydrogels with encapsulated aggregates for reproducible oxygen-gradient screening.
- Quantitative Output: Enables spatial and temporal mapping of hypoxic signaling via fluorescence microscopy.
- Platform Utility: Facilitates assay standardization across oxygen conditions to evaluate encapsulation material performance.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models the avascular microenvironment encountered by encapsulated pancreatic islets in type 1 diabetes therapy.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase hypoxia assessment to preclinical validation of graft survival and function.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs material selection and geometric design to mitigate hypoxia-induced functional loss in therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypoxia assessment after aggregate formation and prior to functional screening, supporting lead identification of encapsulation formulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on oxygen-dependent pathways in encapsulated beta-cell aggregates.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible hydrogels for evaluating compound or material effects under controlled hypoxia.
- Analytics: Provides HIF-1α-driven fluorescence as a quantitative biomarker for comparing oxygen conditions and encapsulation efficacy.
- Translational Research: Connects in vitro hypoxia signaling to preclinical outcomes by correlating marker activity with insulin secretion data.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for evaluating encapsulation materials across cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing ambiguity in hypoxia-mediated functional decline.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined encapsulation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying hypoxia-related risks early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of encapsulation strategies based on functional preservation under low oxygen.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, cell culture, and hydrogel fabrication.
- Depends on UV crosslinking infrastructure and fluorescent microscopy capabilities.
- Necessitates standardization of oxygen-controlled culture systems for cross-team comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the hypoxia reporter to primary or stem cell-derived aggregates.
- Practical limitations include signal resolution constraints for subcellular localization and dependency on viral transduction efficiency.
