カプセル化された細胞凝集体の中で低酸素シグナルの追跡

この手順の目的は、PEG封入細胞凝集塊における低酸素に対する細胞応答をモニタリングすることです。まず、分散させた細胞にマーカーウイルスを感染させ、シェーカーで培養して凝集塊を形成させます。次に、リニアPEGを機能化し、PEG DMプライマーを精製します。

次に、細胞凝集体をPEG DMハイドロゲルに封入します。最後に、ハイドロゲルをさまざまな酸素条件下で培養し、低酸素マーカー信号を蛍光モニターします。これにより、生存している封入細胞凝集体内における低酸素誘導因子の活性部位と範囲を、単純な蛍光顕微鏡で視覚化することができます。

この手法は、3D培養内のどこで低酸素状態が発生し、それが細胞の生存や機能にどのような影響を与えるかといった、細胞カプセル化および細胞ベースの治療薬送達分野における重要な疑問への回答に役立ちます。凝集組織やカプセル化組織において低酸素状態が大きな影響を及ぼすため、この技術の意義は、再生医療アプローチや、糖尿病などのホルモン欠乏症の治療にまで及びます。低酸素誘導因子1（HIF-1）の活性は、ベータ細胞からのインスリン分泌の著しい低下と相関することが示されており、これが初代膵島を分散させ、擬似膵島として再形成させる試みを促進しています。

凝集体の直径を縮小させます。当社のマーカーは、緩んだ封入物質内の細胞レベルでの凝集体における低酸素誘導因子活性を示すことができます。PEGは、優れた移行特性、細胞適合性、および機能的に修飾しやすいことから、カプセル材料として選定されました。

40 mLのガラスバイアルに2 gのPEGを量り取り、約308 µLのメタクリル酸無水物を加えて、ハードプラスチックキャップでバイアルを軽く閉じます。標準的な家庭用電子レンジを用い、強モードで2分間加熱します。次に、耐熱手袋を着用してバイアルを十分にボルテックスし、さらに強モードで5分間加熱します。

バイアルを扱いやすい温度まで短時間冷却した後、バイアルを回転させながらキャップを開けます。塩化メチレンをゆっくりと加え、溶液が透明で均質になるまで、必要に応じてサンプルのボルテックスミキシングを行います。次に、撹拌した冷エチルエーテル 200 milliliters に溶液を滴下し、PEG dm を沈殿させます。

次に、吸引ろ過によってPEG DMを回収し、乾燥させます。PEG DMが乾燥したら、約100から150 millilitersの脱イオン水に溶解させます。その後、分画分子量1000 Daltonsの透析チューブを用い、脱イオン水に対して5日間透析を行います。

溶液を適切な容器に分注し、-80°Cで一晩凍結させます。その後、溶液を4日間凍結乾燥させ、処理した培養フラスコの表面から細胞を遊離させるための精製された白色のPEG DM粉末を作製します。まず、培地を吸引し、37°Cのカルシウム・マグネシウムフリーHBSSで細胞を洗浄し、HBSSを吸引します。

次に、37 °Cに温めたトリプシンおよびEDTA溶液を2 mL加え、細胞を37 °Cで3分間インキュベートします。その後、フラスコの側面を強く叩いて細胞を剥離させ、37 °Cに温めた培地を8 mL加え、細胞懸濁液を激しくピペッティングして混ぜ合わせます。この際、気泡が入らないように注意してください。

細胞懸濁液を滅菌済みの15 mL遠心チューブに移した後、ヘモサイトメーターで細胞数を計測し、感染させる全細胞数を決定します。6ウェル懸濁培養プレートの各ウェルに、1ウェルあたり400,000個の細胞となるように必要な量の細胞懸濁液を分注します。次に、感染させる細胞あたりのHBSS 50 µLを1.8 mLマイクロ遠心チューブに分注します。続いて、調製したHBSSに適切な量のウイルス懸濁液を慎重にピペットで加えます。

次に、目的のMOIとなるように、希釈したウイルスを適切な量ずつ各ウェルに添加し、続いて各ウェルの全量が1.7 millilitersになるように培地を添加します。最後に、プレートをインキュベーター内のオービタルシェーカーに設置し、培地がウェル内で穏やかに流れるよう、シェーカーを約100 RPMの低速に設定して、細胞を24から36時間凝集させます。まず、1 milliliterのプラスチック製注射器の先端を切り落とし、開口部を上にしてラックに配置して、ハイドロゲルを形成させるための容器を作成します。

次に、光活性化PEG DM溶液 20 µLを、プランジャーの上にシリンジの開口端からピペットで注入し、溶液がプランジャー表面全体を覆っていることを確認します。プランジャーをわずかに調整して、液面を平らにします。その後、ピペットをラックに戻し、ハイドロゲルの架橋を行うため、ラックをUVランプの下に約8分間配置します。

この間に、目的の細胞数および凝集体を含む容量をピペットで 1.8 mL マイクロ遠心チューブに分注します。チューブにキャップをし、細胞と凝集体を 130 ×g で 5 分間遠心分離します。次に、マイクロピペットを用いて、チューブ底部の細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を慎重に取り除きます。

メディアヘッドがペレットに近づいたら、より細い10 µLのピペットチップを使用して、細胞凝集塊が完全に包接されるようにしながら、ゲル前駆体溶液全体に均一に分散させます。ここがこの手順で最も難しい部分です。このステップを行う際は、ペレットを慎重に再懸濁し、転送するように注意してください。

次に、細胞ペレットを20 µLの光活性PEG DM溶液で穏やかに再懸濁します。口径の広いピペットチップを使用して、架橋済みハイドロゲル部分の上のシリンジ内に細胞懸濁液を加え、シリンジにさらに8分間UV光を照射してハイドロゲルの構築を完了させます。完了すると、細胞は円筒形のハイドロゲル内に完全に封入されます。

最後に、24ウェルプレートの1つのウェルにHBSSを1 mL、別のウェルに培地を1 mLずつ加えます。次に、シリンジからハイドロゲルをHBSSの中へ押し出し、ゲルを短時間洗浄します。その後、ゲルを培地へと移し、目的の条件下でプレートを培養します。

培養中の任意の時点で、蛍光顕微鏡を用いて細胞をイメージングし、低酸素シグナリングの開始を追跡することができます。24ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、ハイドロゲルを含むウェルを対物レンズの中心に合わせます。このシグナルは個々のシグナリング細胞を特定できるほど十分な特異性を有していますが、細胞内でのシグナルの局在を決定するには解像度が不十分な場合があります。シグナリング細胞において、シグナルは通常、細胞質全体に均一に観察されます。

この図は、ゲルセル内のPEGハイドロゲルに封入されたminx凝集体の代表例を示しています。ここで示されているように、栄養輸送を効率化するため、凝集体はマトリックスに完全に封入され、均一に分散している必要があります。架橋ゲルが全体的に固形であり、反応を行った容器の形状に従っていることに注目してください。

この図では、PEG DMハイドロゲル内で凝集したmin six細胞における代表的な低酸素シグナルの蛍光像を示しています。左側の画像は、カプセル化後に20% oxygenで44時間インキュベートした細胞であり、低酸素シグナルは示していません。一方、右側の画像は、カプセル化後に2% oxygenで44時間インキュベートした細胞であり、明確で普遍的なシグナルを示しています。低酸素状態は、他の細胞種においても追跡可能です。

この図は、カプセル化された間葉系幹細胞凝集塊における代表的な低酸素シグナリングを示しています。一番左の図に見られるように、2% oxygenの12時間後では蛍光シグナルは検出されませんが、中央の図に見られるように、2% oxygenの24時間後にはより顕著になります。そして最終的に、右の図に見られるように、本手順に従い2% oxygenで96時間後には高度に発現しています。

低酸素シグナリングと細胞表現型の相関を明らかにするために、ELISAや分泌タンパク質の解析、細胞生存率アッセイなどの他の手法を実施することができます。このような展開により、本技術は、組織工学や細胞ベースの治療薬デリバリー分野の研究者が、スキャフォールドや封入材料内における細胞の生存機能や分化を探索するための道を開く可能性があります。