モデリングとイメージング、3次元の集団細胞浸潤

この実験系は、特定のタンパク質が浸潤過程に果たす寄与を明らかにすることを目的としています。まず、目的の蛍光タンパク質をレトロウイルスを用いて細胞に導入します。また、トランスウェルインサート内にMatrigelタンパク質による3Dマトリックスを作成し、適切な希釈倍率で細胞懸濁液を調製します。

Matrigelトランスウェルシステムを用いて、試験薬または処置による化学誘引物質への遊走応答を測定し、続いて共焦点顕微鏡により細胞浸潤を可視化および解析します。最終的に、これらの結果から、三次元タンパク質マトリックスへの細胞浸潤の程度および様式を決定できます。従来のトランスウェル浸潤アッセイのような既存の手法に対する本手法の強みは、三次元タンパク質マトリックスへの細胞浸潤に関する定量的なデータと定性的なデータの両方を得られる点にあります。

共同研究者のDiane Creightonが、レトロウイルスパッケージング細胞を10% FBS含有DMEMで48時間培養する方法について実演します。製造元の指示に従って、レトロウイルスDNAを細胞にトランスフェクションしてください。24時間インキュベートし、ウェルを培地で2回洗浄した後、1ウェルあたり1.5 millilitersの10% FBS-DMEMを加え、さらに48時間インキュベートしてパッケージ化されたレトロウイルスを回収します。

組織培養培地を2 mLマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離して細胞をペレット化させた後、上清を清潔なチューブに回収します。このレトロウイルスストックを-80 °Cで保存してください。次に、細胞をレトロウイルスで形質導入するため、一晩培養した培地を除去し、Polybreneを添加したレトロウイルスストック1 mLを加えます。

6時間のインキュベーション後、ウェルに10% F-B-S-D-M-E-Mを2 mL加え、プレートを37 °Cのインキュベーターに入れます。一晩置いて培地を補充し、24時間後に適切な選択培地を加えます。細胞がコンフルエントになったら細胞を回収し、非導入細胞をリファレンスとして蛍光ソートを行います。非導入細胞よりも高い蛍光を持つ細胞を回収し、分注して-80 °Cで凍結保存し、後で使用します。

この手法は、可視化のために蛍光タンパク質の発現を利用しており、個々の細胞の寄与に関する知見を得ることが可能です。Matrigelを氷上で融解し、氷冷したPBSで1対1に希釈します。次に、コーティングされていないトランスウェルを24ウェル組織培養プレートに挿入します。

次に、希釈したMatrigel 100 µLをウェルに注意深く分注し、37 °Cで凝固させます。その間に、通常の増殖培地を用いて蛍光標識した細胞懸濁液を調製します。Matrigelが凝固したら、トランスウェルを反転させ、フィルターの出力側である下面に細胞懸濁液 100 µLを分注します。

24ウェル組織培養プレートの底面を、細胞懸濁液の各ドロップに接触させるようにして、トランスウェルを慎重に覆います。細胞を接着させるため、プレートを逆さまにした状態で4時間インキュベートします。その後、プレートを正立させ、各トランスウェルを1 mLの無血清培地に2回浸して洗浄します。

次に、薬剤または処理試薬を含む3番目のウェルにトランスウェルを配置します。化学誘引物質を含む培地 100 µL を、凝固したMatrigel PBS混合物の上に載せる形でトランスウェル内に緩やかにピペッティングします。37 °C、5% CO2条件下で3〜5日間インキュベートし、Matrigelに浸潤した非蛍光細胞をイメージングします。

トランスウェルを新しい24ウェルプレートに配置し、4 µMのcalcium AM溶液1 mLを各Matrigelプラグの上からピペッティングします。この際、溶液が側面に溢れ出し、上側と下側の両方から染色されるようにしてください。5% CO₂加湿雰囲気下、37 °Cで1時間インキュベートします。その後、共焦点顕微鏡で撮像します。

この最初のライフスタイル染色法により、浸潤様式の可視化が可能になります。各トランスウェルを新しい24ウェルプレートに移し、4%パラホルムアルデヒドおよび0.2%Triton X 100を1 mL加え、室温で30分間インキュベートします。1 mLのPBSで3回洗浄した後、0.01 mg/mLのRNase Aを加えて30分間処理し、その後PBSで2回洗浄して可視化を行います。

PBSで希釈したプロピジウムヨード液を加え、室温・暗所で30分間静置します。PBSで3回洗浄します。この段階で、プロピジウムヨードで染色したトランスウェルは、室温・暗所にて少なくとも1ヶ月間保存することが可能です。

2番目の細胞染色法では固定が必要になりますが、浸潤のより迅速な定量化が可能です。倒立共焦点顕微鏡を用い、少量のPBSが残った状態でトランスウェルを大きなカバーガラスの上に配置し、非浸液式20倍対物レンズを使用して、Matrigelプラグの底部から10〜15 µmごとに光学切片をキャプチャします。個々の光学スライスを用いて浸潤の程度を定量化してください。また、Velocityなどの適切なソフトウェアを用いて、これらの光学スライス系列から3次元オブジェクトを構築します。なお、本手法において細胞はCalcium AMで染色されました。

予想通り、フィルターから上方へ浸潤する細胞数は、距離とともに減少します。この浸潤は定量化することが可能です。細胞浸潤の3次元再構築により、浸潤様式を視覚的に描写することができます。

蛍光タンパク質の発現によって細胞が標識されている場合、この側面図に示すように、各色の細胞の位置を3次元再構築によって視覚化できます。さらに、再構築した像の断面を確認することで、分子メカニズムに関する知見を得ることができます。このビデオを視聴することで、標準的な手法よりも詳細な浸潤プロセスの情報を得るために、この細胞浸潤アッセイをどのように活用すべきかについて十分な理解が得られるはずです。