プロテオミクスから骨格筋の性別二型

本手順の全体的な目的は、骨格筋のプロテオームプロファイルにおける性別特異的な差異を決定することです。まず、ほとんどのタンパク質を抽出するために、雌雄マウスの上腕二頭筋組織を細切し、十分にホモジナイズします。次に、サンプルを等電点電気泳動（IEF）ゲルストリップに適用し、等電点に基づいてタンパク質を分離します。続いて、SDS-PAGEによる2次元目の分離をサイズに基づいて行い、ゲルの染色およびイメージングを経て、雄および雌の筋肉サンプルのプロテオームプロファイルを比較し、両性の間で存在量に有意な差があるスポットを切り出します。

最後に、ゲルプラグ中のタンパク質をトリプシンで消化します。得られたペプチドをゲルから抽出し、同定のためにナノ液体クロマトグラフィー質量分析に供します。最終的に、二次元ゲル電気泳動と質量分析ベースのプロテオミクスを通じて、2つ以上の実験条件下におけるタンパク質の発現差異を示す結果を得ることができます。

この手法は筋肉の性特異性に関する知見を提供できますが、さまざまな生理学的状態にある他の細胞、組織、器官、または体液にも適用可能です。プロシージャの実演は、スミス大学プロテオミクスセンターのテクニカルディレクターであるKalina Diva博士が行います。マウス骨格筋を分離・洗浄し、組織1gあたり45 µLの抽出バッファー（これおよびその他すべてのバッファーのレシピについては、書面によるプロトコルを参照してください）を用いて細切した後、電動ペストルを使用して、4 °Cで15秒間のホモジナイズを7回行います。なお、各ホモジナイズの間には、氷上で2分間の冷却時間を設けてください。

サンプルを4°Cで15,800 Gsで30分間遠心分離します。上清を回収し、その容量を測定します。3倍量の氷でタンパク質を沈殿させ、ペレットを廃棄します。

上清量と同量の冷やした試薬グレードのアセトンを加えます。チューブを15秒間ボルテックスし、次いで15,800 Gsで10秒間遠心分離してペレットを形成させます。上清を捨て、電動ペッスルとポリプロピレン製撹拌棒を用いてペレットを抽出バッファーに再懸濁し、さらに3倍量のアセトンを加えてタンパク質を2回目に沈殿させます。

ペレットを抽出バッファーで再懸濁した後、タンパク質濃度を測定するか、サンプルを-20 °Cで保存します。タンパク質の等電点電気泳動を行うには、準備済みのIPGストリップを-20 °Cのフリーザーから取り出し、室温で10〜15分間平衡化させます。サンプルをボルテックスし、サンプル再水和トレイのチャネル後端に、両端に約1 cmの間隔を空けて、600〜800 µgのタンパク質を直線状にピペッティングします。

ピンセットを使用して、IPGストリップのプラスチックカバーを剥がします。この際、ストリップの両端のみを持つようにし、ゲルに触れないように注意してください。ストリップの陽極（positive）と記された端を確認し、トレイの左側に配置します。IPGストリップを、ゲル面を下に向けた状態でサンプルの上に置きます。

下に気泡が入らないように注意してください。1時間置いて再水和させます。ストリップの上に2.5 millilitersのミネラルオイルを重ねます。

トレイに蓋をして、一晩再水和させます。翌日、室温でフォーカシング用トレードチャネルの両端にペーパーウィックを配置し、それぞれに10 µLのミリポア水を滴下して濡らします。IPGストリップを取り出し、約10秒間垂直に保持します。

オイルを拭き取るため、プラスチックの支持体をKim wipeで吸い取ります。IPGストリップを、基本電極側を左にしてゲル面を下にして配置します。フォーカシングトレイ内で、ストリップを2.5 millilitersのミネラルオイルで覆います。

トレイをProtean IEFセルにセットし、デフォルトのセル温度を20 °C、ストリップ1枚あたりの最大電流を50 µA、リハイドレーション時間をなしに設定し、3ステップのプロトコルをプログラムします。プログラム完了後、ストリップのゲル面を上にして11 cmの平衡化トレイに移します。チャネルに4 mLの還元緩衝液を加え、緩やかに振盪しながら10分間ストリップを平衡化させます。

還元緩衝液を除去し、4 mLのアルキレーション緩衝液をチャネルに加え、さらに10分間振盪してストリップを平衡化させます。IPGストリップを1×SDS泳動緩衝液に短時間浸してすすぎます。次に、ストリップのゲル面を上にして、11 cm Criterionのバックプレート上に配置します。

10.5〜14% Tris-HCl-SDS プレキャストポリアクリルアミドゲルを、SDSゲルに完全に密着するようにゆっくりと押し込みます。2つのゲルの間に気泡が閉じ込められていないことを確認してください。IPGストリップの上に1 mLの溶融アガロース溶液を重ね、5分間静置して凝固させます。

次に、5 µLのプロテインマーカーを単一のウェルにロードします。SDSバッファーを用い、室温または4 °Cで200 Vにてゲル電気泳動を行います。泳動色素がゲルの底部に達したら、プラスチック製キャストからゲルを取り出し、クマシーブリリアントブルー中で緩やかに振盪しながら一晩染色します。

ゲルを脱色液1で3時間ずつ2回、次いで脱色液2で一晩振とうします。分析のため、ゲルを7% 酢酸中に保存します。ゲルのイメージング後、ゲル間のスポットパターンの比較分析を行い、目的のスポットを切り出します。ゲルプラグに200 µLの脱色液を加え、ボルテックス後、室温で30分間振とうしながらインキュベートします。

その後、溶液を慎重に取り除いて廃棄し、この操作を繰り返します。ゲルプラグの入ったチューブに、調製したばかりの還元バッファーを30 µL加え、60 °Cで10分間インキュベートします。その後、サンプルを冷却させます。

次に、バッファーを取り除いて廃棄します。30 µLのアルキル化バッファーを加え、サンプルを室温の暗所で1時間インキュベートします。その後、アルキル化バッファーを取り除いて廃棄します。各チューブに200 µLの脱色溶液を加え、37 °Cで15分間インキュベートしてゲルプラグを洗浄します。

脱色溶液を除去して廃棄し、洗浄を繰り返します。次に、ゲルプラグに50 µLのアセトニトリルを加え、室温で10分間インキュベートして収縮乾燥させます。その後、アセトニトリルを慎重に除去し、ゲルの断片を回収します。

白く小さく見えるはずです。濃縮機を用いて、ゲル片を10分間乾燥させます。活性化トリプシン溶液を10 µL添加し、ゲル片を膨潤させます。

室温で15分間インキュベートします。チューブに25 µLの消化バッファーを加えます。サンプルを室温で一晩振盪しながらインキュベートし、10分間ソニケーションを行った後、遠心分離して上清を新しいチューブに移します。

ペプチドをさらに抽出するために、プラグに0.1%ギ酸を10 µL加え、室温で5分間振とうしながらインキュベートし、サンプルを10分間超音波処理します。上清を回収し、 previously saved の上清と合わせます。その後、タンパク質の脱塩を行い、HPLC結合質量分析法に供することが可能です。運動させていない雌雄の鏡像骨格筋を抽出し、二次元マップに分離しました。

筋肉の比較プロテオームの第1段階を高解像度デジタルイメージングで可視化したところ、ここに見られるように、それぞれに約800個のタンパク質スポットが検出されました。雄のプロテオームマップを基準とすると、雌のプロテオームにおいて発現量が変化しているスポットが多数存在することが分かります。雌で2倍以上に増加したスポットは赤色の円で囲まれ、2倍以上に減少したスポットは青色の円で囲まれています。2倍以上の増減があり、マウス5匹（N=5）で統計的に有意であったタンパク質スポットの同定は、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）を用いたアミノ酸配列解析によって行われます。

このプロットにおいて、x軸は運動前の雌マウスを、y軸は単回運動後の0時間時点のグループを表しています。結果から、雌では糖エネルギー代謝、酵素、および筋肉における異なるエネルギー供給系であるクレアチンキナーゼ酵素アイソフォームの大幅な減少が示されました。ヒトと動物のいずれにおいても、安静時および運動後の血清CK値は雄の方が高い値を示しますが、血清CK値が必ずしも筋原線維量と相関するわけではありません。

上腕二頭筋におけるCKの細胞含有量に見られるこの性差は、新たな知見であり、血清CK値の生理的な差異を説明し得る可能性があります。本手順の後、結果を検証するために定量的イムノブロッティングなどの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、差分的プロテオームプロファイリングのためのサンプルの調製および分画方法について十分に理解できたはずです。