膜内骨化、仮骨延長術、またはCriticalサイズの欠損の治癒を評価するための剛安定骨折を作成する

本手順の全体的な目的は、安定化した骨折治癒、牽引、骨形成、および分節状欠損の治癒の解析に使用できる、外固定された脛骨を作成することです。まず、固定装置のリングを配置し、滅菌済み昆虫ピンを脛骨の近位および遠位部分に挿入して固定し、次いでリングを滅菌済み昆虫ピンに固定します。次に、脛骨の中央骨幹部に骨折または骨切りを作成します。手順の最終ステップとして、3本目のネジ付きロッドを挿入し、近位および遠位のリングを完全に安定させます。

最終的に、X線、組織学的解析、および分子解析を通じて、骨折治癒、牽引、骨形成、および骨移植のメカニズムを示す結果を得ることができます。本手順の実演は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校サンフランシスコ総合病院整形外科外傷研究所・骨再生研究室のシニアリサーチャーであるDr. Diane、Y Yuu、およびポストドクターのDr. Chelsea Baneyが行います。まず、カスタム設計の外固定装置を組み立てることから始めてください。

固定フレームは、3本のステンレス製ネジ棒、8個の六角ナット、および17本の対応するボルトで固定された2つのアルミニウムリングで構成されています。骨折部位1か所につき2つのアルミニウムリングが必要であり、近位リングの適切な穴に4個の六角ナットと対応するボルトを緩くねじ込みます。遠位リングについても同様に4個のナットとボルトをねじ込みますが、完全に締め付けないでください。次に、固定装置を安定させるための長いネジ棒2本を、遠位リングの12時方向と6時方向にある穴に配置し、2個の六角ナットで取り付けます。

希望の週齢および性別のマウスに、ケタミンおよびキシラジンを腹腔内投与して麻酔をかけます。次に、足指へのピンチテストを行い、完全に麻酔がかかっていることを確認します。除毛および消毒液による洗浄の後、眼潤滑剤を塗布し、その後は処置が終了するまでマウスをヒートパッドの上に置きます。

ナットを遠位側に向けて近位リングを脚に装着し、リングを膝関節の上に移動させます。0.25 millimeterの滅菌昆虫ピン4本をドリルに取り付けて骨に穿孔し、左脛骨の近位および遠位骨端を固定します。ピンは脛骨の長軸に対して垂直に、かつ互いに90度の角度になるように配置し、近位ピンと遠位ピンの間には少なくとも10 millimetersの間隔を空けてください。

脛骨をアルミニウムリングの中央に配置したまま、ピンを近位リングに固定します。2つ目のリングを遠位ピンの下に配置します。2本のロッドを近位リングに固定し、その後、六角ナットを使用してピンをリングに固定します。

前述と同様に、適切な装置を用いて3点曲げにより横骨折を作成します。脛骨の後外側表面をブロック上に置きます。重りをドロップアームに沿ってあらかじめ設定した高さまで上げ、脛骨の前外側面に接触するように重りを落下させます。

鈍的骨折を作成した後、X線で骨折を確認します。次に、遠位端から順に、最後のステンレス製ネジ付きロッドをリングに取り付けます。ロッドを挿入し、遠位リングにナットを締め付けてロッドを固定します。

次に、近位リングが上に来るように、ロッドにもう一つのナットを取り付けます。2つのリングが等距離に保持され、ピンに負荷がかかっていないことを確認してください。3つ目のナットを締め、近位リングをロッドに固定します。

麻酔を回復させるためにアロマゾール（aamaz all）を投与し、鎮痛のためにブプレノルフィンを投与して、動物が反応し歩行可能になるまで観察します。次に、鎮痛目的でブプレノルフィンの皮下注射を行い、標準的な延長骨形成術のために4時間後に再度投与します。このモデルを用いて、脛骨に固定装置を設置し、骨折を作成した後、5日間の潜伏期間を設けて静置します。

5日後、固定ロッドのナットを回して牽引骨形成術を行います。1日1回、4分の1回転を7日間繰り返します。術後は、追加の鎮痛剤が必要かどうか、動物の状態を注意深く観察します。

骨橋形成は牽引終了後10日までに認められ、完全な骨癒合は27日までに認められます。麻酔を投与し、除毛剤で除毛して皮膚を消毒した後、既述の方法で固定具を装着します。マウスを解剖顕微鏡下に配置して脛骨内側を確認し、10番メスを用いて5〜7 mmの切開を加えます。

筋肉を慎重に切開して分離し、脛骨の中央骨幹を露出させます。はさみの先端を用いて、脛骨の3 mmのセグメントをゆっくりと切り出します。この際、大きな機械的な力を加えて骨をずらさないように注意してください。その後、ピンセットで残った骨片を除去します。

手術部位に骨片がないか確認した後、脛骨の鈍端周囲の筋肉を復位させます。6.0ポリモノフィラメントを用いて皮膚の切開部を2〜3針縫合し、その後、3本目のロッドを挿入して外固定装置を安定させます。前述の通り、麻酔から覚醒させ、鎮痛剤を投与し、動物に痛みがないか継続的にモニタリングしてください。

前述のように、適切に適用された外固定装置は、閉鎖性脛骨骨折に対して非常に強固な安定性と優れた整復を提供します。この骨折後の放射線写真に示されているように、矢印で示された骨分節は良好に整列しています。この方法で固定された骨折は、主に膜性骨化を通じて治癒します。ここに示すトリクローム染色を用いた画像では、固定された骨折部位に新生骨が認められます。対照的に、骨折が固定されていない場合は、骨折間隙に大きな軟骨仮骨が形成され、その発達後に軟骨内骨化のプロセスを経て骨に置換されます。この手法は、整形外科分野の研究者がマウスにおける安定した骨折治癒のメカニズムを探索する道を開きました。