Name: ラットモデルでの経頭蓋集束超音波を用いた血液脳関門のMRI誘導破壊 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶラットモデルにおけるMRI誘導集束超音波による血液脳関門破壊法。マイクロバブル併用で非侵襲的にBBBを一過性に開放し、標的薬物脳内投与を可能にする技術を解説します。

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著者らは、動物のケアとの助けをShawnaリドー·グロスとアレクサンドラガルセスに感謝し、彼女の技術支援のためのPing呉だろう。この作業のサポートは、助成金なしで、米国立衛生研究所によって提供されました。 EB003268、カナダ研究チェアプログラム。

1。超音波やMRIのセットアップ MRI互換性のある3軸集束超音波システム（FUS·インスツルメンツ社、トロント、オンタリオ、カナダ）本研究で使用されています。二つの異なる超音波トランスデューサが使用されています。統合されたとの社内構築551.5 kHzの球状に集束されたトランスデューサーは（曲率半径= 60ミリメートル、外径= 75ミリメートル、内径= 20 mm）、および1.503 MHzで、8セクタの配列単一の要素球状に焦点を当てたトランスデューサー（= 0.8、絞り値= 10センチFN）として駆動PZTハイドロホン（Imasonic株式会社VorayシュルL&#39;Orgnon、フランス）。 MRI互換性PVDF受信機8は、551.5 kHzの振動子を用いた場合アコースティックエミッションを記録するために使用されていました。別の機器が使用されている場合は、次のことが示唆されています。 <ol><li>範囲0.25 MHzの-1.5 MHzの中​​心周波数と1以下のfナンバー（曲/開口部の半径）と適切なキャリブレーション超音波トランスデューサを選択します。 </li><li>水浴FIを配置1.5 Tまたは3 T MRIのベッドの上で暖かく、脱気、脱イオン水でlled。水浴は、動物を保持することができ、トッププレートを持っている必要があります。水面に面しており、MRI互換性のある3軸位置決めステージやシステムの9日にタンク内の超音波トランスデューサをマウントします。 </li><li>浸透パネルを介して超音波駆動装置に変換器ケーブルを実行します。 </li><li>ファンクション·ジェネレータとパワーアンプを使用してトランスデューサの駆動信号を生成します。反映され電力を最小限に抑えるために、外部整合回路を使用しています。 </li><li>トランスデューサの焦点距離を知って、水面でのトランスデューサの焦点を置き、目に見える噴水を生成するために水の表面を超音波処理してください。ステップ1.6および1.7は、生成された噴水を使用してフォーカスを登録する方法について説明します。結果として温度上昇は、MRIで焦点に熱吸収ゲルとイメージングを超音波処理が含まれ、フォーカスを検索するためのより正確な方法は、9に記載されています&lt;/&gt;のsup。 </li><li> MR画像上に表示され、マーカーを使用してフォーカスの位置をマークします。これは、フォーカス上に配置されたときに水でいっぱいになり、中央の穴とプレートを使用して行うことができます。変換器の軸方向の座標が水面から決定することができますが水で満たされた穴は、MRI上に表示されますと2面での焦点の座標を提供します。 </li><li> 3面のローカライザーシーケンスを使用して画像の焦点マーカーとMRI座標系でのフォーカスの位置を記録します。 </li><li>アコースティックエミッションを監視するには、トランスデューサの焦点に向け水浴中で受動的なキャビテーション検出器（PCD）として使用されているMR-互換性のあるハイドロ8をマウントするか、統合されたハイドロフォンのトランスデューサーを使用しています。 </li><li>最大2 Hzの（例えば、ATS460、AlazarTech、ポワントクレア、ケベック州、カナダ）へのPRFが10ミリ秒までのバーストを捕捉するのに十分高速であるスコープのカードにPCDケーブルを実行します。ケーブルはPENEに接地する必要がありますtrationパネルまたはRFシールドは、ノイズを最小限に抑えます。 </li></ol> 2。動物の準備<ol><li>イソフルランガスを使用して動物を麻酔。イソフルランは、BBBの破壊10の効果を持っているので、動物実験の開始前にガスは10分をオフに注意する必要があります。乾燥や他の傷害から角膜を保護するために、麻酔の開始時に各目の場所の眼潤滑剤軟膏。 </li><li>動物の頭と首の上から毛を剃る電気かみそりを使用して、その後脱毛クリーム（例えばNairさんは、教会＆ドワイト社、プリンストン、ニュージャージー州、米国）を使用して、残りの毛を除去し、穏やかな石鹸で頭皮をすすぎ、水。 </li><li> bridine洗浄に続いてbetadineスキンスクラブと尾を準備します。尾静脈を可視化するために、アルコールとの最終wipedownを実行します。 </li><li>尾静脈に3方活栓と22ゲージのカテーテルを挿入し、血栓形成を防止するために、ヘパリン/食塩水混合物（33 U / mL）でフラッシュカテーテルインチ</li><li>筋肉内注射により、注射麻酔薬（40〜50 mg / kgのケタミン、10 mg / kgのキシラジン）を提供し、イソフルランから動物を削除します。 </li><li>トッププレート（図1）の穴を通して水浴の接触の頭の上で超音波測位システムにおける麻酔動物を仰臥位に置きます。超音波ゲルの少量多分トラップairbubblesの可能性を最小限に抑えるために動物の頭の上に適用されます。 </li><li>位置決めシステムへのテープの足を。頭のいずれか一口バーを使用して、場所で開催された、利用可能な場合、またはテープがあご全体にしっかりと置かれるかもしれません。 </li><li>タオルで動物をカバーし、それを暖かく保つために水の毛布を循環させる。 </li></ol> 3。標的選択<ol><li>ベースラインの軸方向のT 2-Tと重み脳の1加重MR画像を取得します。 1.5 T MRIと専用のヘッドサイズのRF-受信表面コイル、適切なSCを使用している場合パラメータは次のようになります。 加重T 2：FSE、TE = 60ミリ秒、TR = 2000ミリ秒 加重T 1：FSE、TE = 10ミリ秒、TR = 500ミリ秒</li><li>心室、脳の正中線を避けて、中脳の深さを選択し、T 2-加重スキャンからターゲットを選択します。 </li><li>ターゲットの場所にトランスデューサのフォーカスを移動します。 </li></ol> 4。マイクロバブルの準備 DEFINITYマイクロバブル（Lantheusメディカルイメージング、MA、米国）がBBBD 2,5,7を誘発したマイクロバブル媒介FUSのために、いくつかのグループによって使用されます。他のマイクロバブルの種類の適切な投与量は、文献11,12に記載されています。 <ol><li>のDefinityマイクロバブルを活性化し、徐々に18ゲージ針を用いて1 mLシリンジに小さな音量を上げて描画します。 </li><li>軽く前後にプランジャーを移動することによってシリンジから閉じ込められた空気を削除します。これは気泡を破ることができるように注射器をタップしないでください。 </li><li>正常な内のDEFINITYを希釈<html>徐々に生理食塩水のシリンジにDEFINITYの必要量を注​​入することによりDefinty〜10:1生理食塩水の割合で生理食塩水。注入配信が使用されている場合、DEFINITYは、50:1または100:1、さらに希釈することができる。 </li><li>優しくても外観が達成されるまで、徹底的にのDefinityと生理食塩水を混ぜて注射器を反転させます。気泡が懸濁液からフロートを開始した場合、直ちに注入前にシリンジの緩やかな反転が必要になることもあります。 </li><li>のDefinityの0.02 ml / kgの、または溶液（10:1希釈）0.2 ml / kgの用量に基づいて、必要な量を計算します。 </li></ol> 5。超音波配信<ol><li>低デューティ·サイクルのバーストではなく、連続波sonicationsを使用して、超音波処理パラメータを設定します。 0.5 MHzで、適切な超音波処理パラメータは、 その場の圧力0.23 MPaで、1 HzのPRF、2分間で10ミリ秒のバーストです。合計超音波処理時間。 その場の圧力は 1.5 MHzでの適切な0.45から0.5 MPaの周りに分類されます。 </li></ol>_content &quot;は&gt;異なる周波数で適切な圧力は、0.46 13の機械的なインデックスを使用して推定することができます。 <ol start="2"><li>動物の頭はまだ水に結合されていることを確認してください。 </li><li>尾静脈カテーテルにゆっくりとマイクロバブルを注入し、0.5 mLの生理食塩水で洗い流してください。注入開始と同時に超音波処理を開始します。 </li></ol> 6。治療成績のMRI評価<ol><li>超音波処理後、0.5 mLの生理食塩水フラッシュに続いて、尾静脈カテーテルを介して（例えば0.2ミリリットル/ kgのOmniscan、GEヘルスケア）MRI造影剤を注入します。 </li><li>コントラストのピークが経過するまで、T 1強調画像を実行します。首尾よく破壊された超音波のサイトが周囲の組織よりも大きい増強が表示されます。 </li><li>浮腫を確認するためにT 2強調画像を実行します。超音波処理現場での高信号は、浮腫の指標である。 </li></ol> 7。代表者結果 MRI造影剤は正常に集束超音波とマイクロバブル循環を使用して、BBBを介して配信することができます。図2は、典型的なプリおよびポストFUS T 1-Wの画像を示しています。図2Bは、4つの超音波処理した場所で異なった焦点距離の開口部とは対照的に強化された（CE）T 1-Wイメージを示しています。超音波位置1と2は特に明るい強化を示しています。図の位置1と2にも浮腫を示し、T 2-W高信号に対応するように見ることができます。 T 2-wの浮腫の程度は、時には矢状スライスに、より簡単に視覚化することができます。図4は、CE-T 1-wとT 2は、-w矢状スライス超音波位置1〜3を示しています。浮腫は位置1ではなく位置3で表示されます。 キャプチャされたアコースティックエミッションデータ（図5）のスペクトル解析では、高調波の排出量および/または安定したキャビテーションが発生している超/サブハーモニックの排出量が表示される場合があります。ハーモンsubとultraharmonic排出量はバブルのアクティビティ14の結果としてのみ発生することができますがICはまた、組織の非直線性から生じる可能性があります。より高い圧力で慣性キャビテーションを示す広帯域の排出量も検出することができます。しかし、これらは、慣性キャビテーション11なしsonicationsより赤血球extravasationsと微小損傷の大きい量に関連付けられている。 小さな焦点スポットサイズに起因する多くのローカライズされた開口部に高い超音波周波数を使用した結果。図6は、高い周波数は、開口部の小さな領域を作成するために使用できることを示しています。これは、より少ない近い頭蓋骨の影響と効果半ば脳の調査を可能にします。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig1.jpg" /> 図1実験セットアップ。 <spクラス= &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig2.jpg" /> 図2。前（左）と後（右）の治療法T 1-W 4超音波の位置で強化を示すラットの脳の画像。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig3.jpg" /> （3）前（左）と後（右）の治療法T 2-Wラットの脳の画像（図2と同じ動物）は、超音波位置1と2で、T 2は、-w浮腫を示す図 。 <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig4.jpg" /> 図4後処理矢T 1-W（左）とT 2-W（右）同じラットの脳からの画像は、図。 2と3。位置1の開口部（左）T 2-wの浮腫（右）と相関しています。場所3は、開口部（左）がないT 2は、-w浮腫を示しています。 </P&gt; <img alt="図5。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig5.jpg" /> 図5：551.5 kHzで1つの10ミリ秒のバースト中に捕捉したデータから周波数スペクトル。基本周波数（f 0）と同様に高調波（2 F 0）とultraharmonics /サブ（0.5 F 0、1.5 F 0）が表示されます。 <img alt="図6。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig6.jpg" /> 図6治療後CE-T 1-W軸（左）と1.503 MHzで4箇所に超音波処理したラットの脳から矢（右）の画像。この周波数でのBBBの開口部は、よりローカライズされたように見られている。

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</ol>

K. HynynenとR.チョプラがFUS·インスツルメンツの共同設立者であり、株式会社R.チョプラ、A. WaspeとK. HynynenはFUSインスツルメンツでは株主である株式会社K. HynynenはFUSの楽器、（株）からの研究支援を受け

動物とマイクロバブルの準備は、この手順の中で最も重要な側面です。動物の頭の毛は完全に超音波ビームの減衰を避けるために削除する必要があります。 BBBは、イソフルラン麻酔下で中断される可能性があります、しかし、それは一貫性のある開口部を達成するために難しくなります。 マイクロバブルは、常にそれらを壊すことを避けるために、策定時に大径の針を使用する必要があり、ケア、小さなゲージで処理する必要があります。同様に、合理的に尾静脈に使用することができる最小のゲ​​ージのカテーテル（22ゲージをお勧めします）を採用する必要があります。小さいカテーテルを静脈内に適切な配置を達成するために必要されている場合、余分なケアがマイクロバブル注入時に注意する必要があります。マイクロバブル注入は常に徐々に行う必要があります。 バーストモードsonicationsは、常に使用すべきである。連続波sonicationsが使用されている場合はバブルが補充されません<html>にトランスデューサの焦点とBBBDの船舶が達成されることはありません。 CE-T <...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>小さな動物集束超音波システム</td><td> FUS·インスツルメンツ株式会社</td><td> RK-100 </td></tr><tr><td> DEFINITY </td><td> Lantheusメディカルイメージング</td><td></td></tr><tr><td> Omniscan </td><td> GEヘルスケア</td><td></td></tr></tbody></table>

ラットモデルでの経頭蓋集束超音波を用いた血液脳関門のmri誘導破壊

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

血液脳関門（BBB）の集束超音波（FUS）の中断は、BBB 1-5を回避するためのますます調査手法である。それは小さいサイズ6で約500 Daより分子に脳組織に血管系からの分子の通過を制限するようにBBBは、脳疾患の医薬治療への重要な障害である。 FUS誘導BBBの中断（BBBD）は一時的かつ可逆的4であり、高度にローカライズされていることBBBD誘導の化学的手段利点があります。 FUS誘導BBBDそれ以外の場合は十分な濃度の組織への成果物ではありません脳、上の治療薬の広い範囲の影響を調査するための手段を提供します。超音波パラメータの広い範囲がBBB 2,5,7中断することで成功を収めているが、正確なターゲティングに成功した混乱を確保するための実験手順で、いくつかの重要なステップがあります。この機能実装オールアウトラインはどのように重要な動物の準備と実験のマイクロバブル処理の手順に焦点を当てて、ラットモデルでBBBD誘導されるMRIガイド下FUSを実現しています。

血液脳関門（BBB）のマイクロバブル媒介集束超音波の乱れは、脳の非侵襲的な標的薬物送達のための有望な技術です。<sup&gt; 1月3日</sup&gt;。このプロトコルは、ラットモデルにおけるMRI誘導頭蓋BBBの中断のための実験手順を説明します。

ラットモデルでの経頭蓋集束超音波を用いた血液脳関門のMRI誘導破壊

集束超音波（FUS）による血液脳関門（BBB）の破壊は、BBBを回避するための手法として研究が進んでいる技術である1-5。BBBは...

この手順の全体的な目的は、血液脳関門を局所的に破壊し、通常は脳血管内に限定されている分子を組織内へ透過させることです。これは、まず動物を準備し、集束超音波トランスデューサおよび3軸トランスデューサポジショニングシステム上のウォーターバスに仰向けに配置することで達成されます。手順の第2段階では、ポジショニングシステムにターゲット情報を供給するためにMRI画像を取得します。手順の3番目のステップは、マイクロバブル溶液を調製し、注入することです。手順の最終ステップは、超音波パラメータを設定し、超音波を照射することです。最終的に、造影剤増強T1強調MRIを通じて、超音波照射部位における血液脳関門の透過性を示す結果を得ることができます。この技術の意義は、脳および中枢神経系（CNS）疾患の治療へと広がります。なぜなら、血液脳関門を局所的かつ再現性よく破綻させることができるため、これまで薬物療法への反応が悪かった疾患に対する薬理学的介入の検討が可能になるからです。一般的に、この手法に不慣れな方は、気泡が標的に到達する前に壊れるのを防ぐため、気泡の取り扱いと注入に忍耐と細心の注意が必要となるため、苦労することがあります。動物の準備手順については、後半で実演します。当研究室の技術者が、適切に校正された超音波トランスデューサを選択します。次に、1.5 Teslaまたは3 TeslaのMRIベッド上に、脱気された脱イオン水で満たされた水槽を設置し、水面に向いたMRI対応の3軸ポジショニングステージまたはシステムを用いて、水槽内に超音酸トランスデューサを取り付けます。水槽には、動物を固定するためのトッププレートを備えている必要があります。イソフルランガスで麻酔をかけた後、頭頂部と首の被毛を剃毛します。次に、除毛クリームを使用して残りの被毛を除去します。尾静脈に3方活栓付きの22ゲージカテーテルを挿入し、カテーテル内での血栓形成を防ぐためにヘパリン生理食塩水混合液でフラッシュします。注射用麻酔薬を筋肉内注射し、動物をイソフルランから出します。実験開始の10分前に、気泡が混入する可能性を最小限にするため、動物の頭頂部に少量の超音波用ジェルを塗布します。次に、麻酔をかけた動物を超音波ポジショニングシステムの上に仰向けに配置し、トッププレートの穴を通して頭頂部をウォーターバスに接触させます。頭部は、バイトバー（利用可能な場合）または顎にしっかりと貼ったテープを使用して固定します。次に、脚をポジショニングシステムにテープで固定します。動物をタオルや毛布で覆い、保温します。実験の過程において、適切なスキャンパラメータを用いて、脳のベースラインとなる軸方向の T2 強調および T1 強調 MR 画像を取得します。T2 強調スキャンから、脳室と脳正中線を避け、中脳の深さを選択してターゲットを決定します。トランスデューサーのフォーカスを標的部位に合わせます。メーカーのプロトコルに従って定義的マイクロバブルを活性化し、1 mLシリンジに少量をゆっくりと吸い上げます。18Gの針を使用し、プランジャーを軽く前後に動かして、タッピングせずにシリンジ内の気泡を取り除きます。マイクロバブルが破壊される可能性があるため、生理食塩水が入ったシリンジに必要量のマイクロバブルをゆっくりと注入し、生理食塩水とマイクロバブルの比率が10:1になるように希釈します。シリンジを静かに反転させ、外観が均一になるまでマイクロバブルと生理食塩水を十分に混合します。必要投与量は、マイクロバブルとして0.02 milliliters per kilogram、または溶液として0.2 milliliters per kilogramに基づき算出してください。10倍に希釈します。超音波処理のパラメータは、連続波ではなく、低デューティサイクルのバーストを用いて設定してください。動物の頭部が依然として水に接触していることを確認します。マイクロバブルを尾静脈カテーテルにゆっくりと注入しながら、同時に超音波処理を開始します。その後、超音波処理に続いて0.5 millilitersの生理食塩水でフラッシュします。尾静脈カテーテルからMRI造影剤を注入し、続いて0.5 milliliterの生理食塩水でフラッシュします。コントラストのピークが過ぎるまで、T1強調画像撮影を行います。超音波照射を行います。正常に破壊された部位は、周囲の組織よりも強い造影増強を示します。超音波照射部位に高信号（ここでは浮腫を示す）があるかを確認するため、T2強調画像撮影を行います。ここには、一般的なFUST施行前後のT1強調MR画像を示します。明瞭な局所的な開口部を伴う造影T1強調画像です。4箇所の超音波照射部位が示されており、特に部位1と2において強い造影効果が認められます。部位1および2においても、FUS後のT2強調画像で高い信号強度が見られ、浮腫が示されています。T2強調による浮腫の範囲は、矢状断スライスの方が視覚的に捉えやすい場合があります。ここでは、ソネーション部位を通過するT1強調およびT2強調の矢状断スライスを示します。部位1および3が示されており、部位1ではFUS後の浮腫が確認できますが、部位3では見られません。捕捉した音響放出データのスペクトル解析では、安定空洞現象が発生している場合に、高調波放出、および／または低調波および超高調波放出が認められることがあります。551.5 kilohertzで10 millisecondの単一バースト中に捕捉されたデータは、基本周波数のほか、高調波、ならびに低調波と超高調波の両方を示しています。ここで示されているように、より高い超音波照射周波数を使用すると、焦点スポットサイズが小さくなるため、より局所的な開口が得られます。より高い周波数を使用することで、より小さな開口領域を作成でき、頭蓋骨近傍の影響を抑えて中脳の調査を行うことが可能になります。この手順を行う際は、良好な結果を得るためにマイクロバブルを慎重に取り扱うことが極めて重要であるという点に留意してください。この手法を精緻化できれば、脳内の特定の標的に治療薬を届ける際の有効性はどの程度か、といった他の疑問への回答に取り組むことができるようになります。

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JoVE Journal

Medicine

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