動作げっ歯類の可動シリコンプローブによるニューロンの大規模なレコーディング

こんにちは、シェーン。Bija研究室のモンティです。今日は、覚醒して行動しているラットにおいて、シリコンプローブを用いてユニット活動と局所フィールド電位の高密度電気生理学的記録を行う方法を説明します。小型のマイクロドライブの製作方法、そこにシリコンプローブを固定する方法、そして慢性的な記録のためにプローブを脳内に植え込む方法について解説します。

このプロセスは非常にシンプルですが、いくつかの手順を含みます。それでは始めていきましょう。こちらが、私たちが長年にわたって設計・作製してきた、複数のシングルワイヤー、テトロード、およびシリコンプローブ用のラットおよびマウス向けマイクロドライブの小規模なコレクションです。

シリコンプローブは、硬質のプリント基板または柔軟なポリアミドケーブルに取り付けることができます。ここでは、この4シャンクプローブをマイクロドライブに固定する方法を説明します。ドライブを準備するには、真鍮プレート、55番および65番のドリルビット、タップ、シングル列ピンヘッダ、0-0-90ネジと対応するナット、ドリルビットホルダー、およびドライバーが必要です。

最初のステップは、ヘッダーから3ピンのパーツを切り離すことです。中央のピンをゆっくりと引き抜き、65サイズのドリルビットで穴を広げるように穴あけします。その後、タップを使用してネジ山を切り出します。

真鍮板から2片を切り出します。Dremelドリルで板の端を研磨し、55番のドリルビットを用いて両方の片の中央に穴を開けます。真鍮板がピンに接するようにドライブを仮組み立てし、アセンブリが安定するまでネジを軽く締めます。

ピンの両端を出し、真鍮プレートにハンダ付けします。マイクロドライブがほぼ完成しました。ネジの突出した端をやすりで削り、ネジにハンダ付けします。これで、超軽量のマイクロドライブが2つ完成しました。

時計回りに回すと、プラスチックブリッジが上昇します。シリコンプローブは2つの部品でドライブに取り付けることができます。シルクガードエラストマーを計量します。

各成分を10：1の比率で混合します。先端を鋭くした綿棒を用いて、このガードをプローブの上端に塗布します。60 °Cに予熱したオーブンで、少なくとも2時間乾燥させます。

記録部位にデブリ（不要物）が付着していないことを確認するため、チップを洗浄する必要があります。Contra洗剤を4倍希釈で調製してください。プローブを63 °Cの洗剤に少なくとも2時間浸漬させます。

プローブをドライブに固定する前に、蒸留水に繰り返し浸して洗剤を洗い流してください。各記録部位のインピーダンスをカミソリの刃を用いて確認します。2台のマイクロマニピュレーターを使用して、ブリッジに複数の溝を切り、粗い表面を作成します。

プローブをドライブのブリッジに合わせます。次に、手術前にグリップセメントを用いてプローブをブリッジに固定します。基準電極および接地電極を準備します。

被覆銅線の片端を約1 mmはんだ付けします。針を用いて0.090ステンレス製ネジの頭部を削り、そこに銅線をはんだ付けします。はんだがネジの溝に流れ込まないよう、細心の注意を払ってください。

銅メッシュから台形に切り出したピースを用意します。これらのピースを組み立ててヘッドステージを保護します。手術器具および準備は、多くの小動物手術で使用されるものと同様です。

このビデオで示されている手術は、視認性と撮影上の都合によるデモンストレーション目的のみであることをご了承ください。いくつかの準備ステップ、手術上の注意点、および術後処置はここでは示されていません。齧歯類の手術については、適切なガイドラインを参照してください。

手術全体は、無菌条件下でガス麻酔および全身麻酔を用いて行われます。正中線に沿って皮膚を切開した後、皮膚と骨膜を除去し、頭蓋骨を洗浄して乾燥させます。ブレグマとラムダの位置およびそれらの間の距離を測定し、頭蓋骨を開ける前に、座標 X および Y を決定して標記します。

プローブを留置するため、骨に数本のネジを半分までねじ込みます。電極を挿入するため、孔の上部および側面の両方に準備を行います。長期的な慢性実験において、ヘッドステージを頭蓋骨に固定するには、複数のネジを使用することが不可欠です。極小のブラシを使用し、頭蓋骨の表面全体にメタクリネート・デンチン活性剤を塗布します。

その後、生理食塩水で洗浄します。次に、歯科用セメントを慎重に塗布し、チェーンコースクルーを覆います。続いて、4つの銅製フラップをこの頭蓋骨のグリップセメントで固定します。

いよいよ手術の最も重要な段階に入ります。ラウンドヘッドドリルビットを用いて、プローブ埋込部位の準備を行います。ドリリングは複数回に分けて行い、骨には頻繁に生理食塩水で灌流します。

骨片を慎重に除去し、表面を洗浄してズラを取り除きます。2つの器具が必要です。昆虫ピンから作成したフックと鋭利なメスを用いて、骨片を持ち上げて切除します。わずかな出血は生理食塩水による洗浄で処置できます。

重大な出血が発生した場合、または新皮質が何らかの形で損傷した場合は、手術を中止し、別の動物を準備することを検討すべきです。次に、シリコンプローブを植え込みます。プローブは、血管のない領域に挿入してください。軽微な出血がある場合は、バイラインを用いて止血します。

プローブを、目的の標的の約1 mm上に配置します。パラフィンとミネラルオイルの温めた融液を塗布して、穴を塞ぎます。ドライブの下部は、グリップセメントを用いてCortesの頭蓋骨に固定します。

プローブの接続部は同様に頭蓋骨に固定します。手術の最終かつ極めて重要な段階は、銅メッシュのフラップを組み立てて、プローブとドライブの周囲に保護シリンダーを作成することです。このシリンダーは、環境ノイズや、帯電したひげによって生じる緩徐波アーチファクトに対する電気シールドとしての役割も果たします。

行動中の動物において、高さは余分な材料を切り取ることで調整できます。参照電極からのワイヤーとグランド線は、コネクタの適切なピンにハンダ付けします。また、グランドは銅メッシュにもハンダ付けします。

銅製のメッシュフラップをはんだ付けで接続し、セメントで補強します。手術の最後に、ドライブスクリューの動きを再度テストします。術後の適切なケアの後、ゴム手袋から切り出した一片をヘッドステージの頂部に被せます。翌日、動物は健康で協力的であり、良好な状態です。

動物が自由に活動できるように、超軽量で超柔軟なマルチトレンドワイヤの使用を推奨します。この細いケーブルは、最小限のカウンターバランスで済み、制限のない自由な動きを可能にします。記録の品質は、ホームケージ内で毎日テストされます。

記録部位の位置は、ユニットの発火パターンと局所フィールド電位の形状の両方によって推定されます。本動画では単一のシリコンプローブの刺入を示していますが、練習を積めば、複数のプローブとドライブを用いた多部位記録も容易に実施可能です。また、マウスの脳にシリコンプローブを刺入するために、同様のより小型のドライブも使用しています。

最後に、シリコンプローブによる記録は、光遺伝学実験における神経組織への局所的な光刺激と効果的に組み合わせることができます。ご視聴ありがとうございました。