Name: 臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ 臨床抗体サンプルの貪食活性測定法。蛍光抗原ビーズとTHP-1細胞を用いたハイスループットフローサイトメトリーにより、抗体依存性貪食を定量化し、HIVやインフルエンザなどの感染症免疫応答を評価する標準化された手法です。

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著者らは、NIH 3R01AI080289 - 02S1、およびNIH / NIAID 2P30AI060354 - 07の下でエイズ研究員フェローシップのためのハーバード大学のセンターからの資金調達を認識したい。

1。文化食細胞<ol><li>文化THP - 1 Tフラスコに固定懸濁液として10％ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640で10セル。細胞密度は、FcγRの発現とアッセイの性能の一貫したレベルを維持するために、0.5 × 10 6 / mL以下に維持されるべきである。 </li></ol> 2。ビオチン化抗原を準備<ol><li>製造元の指示に従って、目的の標的抗原をビオチニル化するために必要なスルホ- NHS LCビオチン試薬キットの量を計算します。 </li><li>水中でのビオチン化試薬を溶解し、すぐに第一級アミンを含まないバッファーで抗原に計算した金額を追加してください。反応が時折混ぜ、室温で1時間進行することができます。 </li><li>タージェを維持するために適切な分子量のカットオフのアミコン遠心濃縮装置に緩衝液交換によって過剰、非抱合型ビオチンを削除します。T抗原。濃縮ユニットの上部チャンバーにサンプルを追加し、15 mLの充填ラインへの総ボリュームを起動するPBSを加える。約1.5 MLSにボリュームをダウンさせるために4000 × gで遠心する。この処理を繰り返すと、二回ビーズに抗原の最大塗膜を確保するための遊離ビオチンの99％が削除されます。 </li></ol> 3。抗原飽和ビーズを準備<ol><li>高速遠心機でスピンダウン後、1 mlの0.1％PBS - BSAで二回1ミリメートル蛍光ニュートラビーズ100μlを洗う。再懸濁し、10のチューブに100μlのPBS - BSA、および一定量のビーズを洗浄した。 </li><li>ビーズを飽和させる抗原のコーティングの条件を決定するために、二倍のステップでビオチン化抗原の濃度を変化させて洗浄したビーズ懸濁液10 ulを組み合わせる。ローテーター上でマイクロ遠心チューブに4℃で一晩インキュベートする。 </li></ol>注：ビーズの彩度を実験的に決定する必要があります。これを達成することができるビーズが続いてコントロールモノクローナル抗体でオプソニンしているときに最大の食作用をもたらすビードコーティングの条件を識別することによって。 <ol start="3"><li>ビーズのペレットになるまで高速で1 mLのPBS - BSAと遠心で洗浄して非結合抗原を削除します。 PBS - BSAを削除して、繰り返します。 </li><li> PBS - BSAに1 mlの最終容量に再懸濁し、抗原をコーティングしたビーズ。ビーズは4℃の週に使用する° Cの前まで保存することができます。 </li></ol> 4。抗体のサンプルを準備する<ol><li>臨床抗体のサンプルは、メーカーの指示に従ってメロンゲルのIgG精製キットを用いて血漿から精製することができる。精製したIgGは4℃で使用直前まで保存することができます。 </li></ol>注：ヒトサンプルを扱うに関する適切な対策を常に取られている必要があります。 <ol start="2"><li> A280の吸光度で精製抗体の濃度を決定し、PBSで1 mg / mlにサンプルを希釈する。 </li><li>置かれているものを準備PBSで1 mg / mlまで希釈して、IVEと負のモノクローナルコントロール抗体。 </li></ol> 5。実験をめっき<ol><li>ボルテックスで上記で調製した洗浄、抗原飽和ビーズ溶液を再懸濁し、そして丸底96ウェルプレートの各ウェルに10μlを移す。ケアは、継続的に蛍光ビーズの等しい数を確保するためにビーズ懸濁液を撹拌するために注意しなければなりません各ウェルに添加されています。 </li><li>各抗体の用量 - 反応曲線を作成し、各ウェルに関心の抗体の濃度を変化させて追加します。最適な濃度が存在する抗体の力価に応じて、サンプル間で異なりますが、0.01から100μg/ mlの最終濃度の範囲は、良好なカバレッジを提供し、関心の濃度範囲の同定が可能になります。抗体を20μlのより大きくないボリュームで追加されていることを確認します。 </li><li> ° Cの抗体がビーズをオプソニン化するために可能にするために37℃で2時間ビーズと抗体のサンプルをインキュベートする。&lt;/ LI&gt; <li> 2.5 × 10 5細胞/ ml、でのTHP - 1細胞の懸濁液を調製し、各ウェルに5 × 10 4 THP - 1細胞の合計で、各ウェルにこの懸濁液200μlを加える。 </li><li> 37℃で一晩インキュベート℃、5％固定インキュベーター内でCO 2、、重力を経由してペレットにできるように、細胞とビーズ。 </li></ol>注：ノイズへの信号が最適なビーズを決定することによって改善する場合があります：抗体：THP - 1特定の抗原と抗体ソースの細胞比。 6。フローサイトメトリー解析<ol><li>各ウェルの細胞ペレットを乱さないように注意してから上清100μlを削除します。サイトカイン分泌の決定または他の分析が望まれる場合上清を保存することができます。 </li><li>固定の場合は、細胞を再懸濁し、混合するために各ウェルにピペットを4％パラホルムアルデヒド100μLを加える。 </li><li>ハイスループットフローサイトメトリー分析は、HTSプレートリーダーを搭載したBD LSR IIを使用して実行することができます。</li><li>プログラムソフトウェアは、各ウェルの3倍（100μlの混合量）を混合し、各サンプル30μlの、または少なくとも2000のセルのイベントを、分析する。 </li><li>収集されたデータは、FlowJoまたは同等のソフトウェアで解析することができます。有用なメトリックは、ビーズ+のパーセント、または蛍光細胞、現在の食細胞の数の尺度を提供するだけでなく、貪食ビーズの数の尺度を提供する食細胞の蛍光強度が含まれています。これらの値を乗算すると、統合された平均蛍光強度、またはiMFIを生成します。 </li><li>それぞれの食細胞によって貪食ビーズの平均数は1ビーズの平均蛍光によってiMFIを割ることによって計算することができます。 </li></ol> 7。代表的な結果影響を受けると影響を受けない被験者からの抗体サンプルの明確な差別があるはずです。図1Aは、HIVネガから抗体サンプルのFACSヒストグラムを提示tive（黒のトレース）とHIVポジティブ（グレーのトレース）の対象、および抗原特異的抗体の存在によって駆動増加食作用を示しています。 アッセイの最適な感度はビオチン化抗原とビーズの飽和に依存しています。図1Bは、抗原の異なる量でコーティングされたビーズが（非結合抗体、三角形含む）3コントロールモノクローナル抗体でオプソニンされたときに観測された貪食を提示し、この抗原に対して飽和濃度として2μg抗原/μLビーズを確立します。 用量 - 反応曲線を図2に提示され、0.05から5μg/ mlの抗体の濃度範囲で貪食を誘導するために対象抗体サンプルの微分容量を示しています。この差の貪食は、IgGサブクラスとグリコシル化状態などの力価又はFcドメインの特性の違いのどちらかによって駆動されることがあります。 THP - 1細胞​​は、私している場合magedは、蛍光顕微鏡により、ビーズ貪食の明確な証拠がある。図3は、抗体の非存在下で貪食取り込みの欠如を示す抗体オプソニン化（緑）と非オプソニン化（赤）ビーズとのインキュベーション後のTHP - 1細胞​​、の二つ63x静止画像を提示。タイムラプス顕微鏡が実行されると、蛍光ビーズの抗体特異的貪食取り込みは（動画1、20倍の倍率）はさらに顕著です。 前の仕事は、セルに関連付けられているビーズの内在化を認識しています、と主単球を用いた実験では、このハイスループットアッセイ（データは示さず）に貪食スコア（iMFI値）とよく一致している。 <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。アッセイの品質管理。 1A、HIV陰性対象（黒のトレース）とHIV陽性被験者（グレーのトレース）から抗体のサンプルの貪食のフローサイトメトリーのヒストグラム。1B：サンプルの抗原のための最適なビードコーティング条件の実験的決定。抗原特異的なモノクローナル抗体（円、正方形）はビーズの&gt; 2μgの抗原/μlでコーティングしたビーズの最大の食作用を示し、対照抗体ながら、（三角形）は貪食能を示していない。 <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。貪食用量-反応曲線。差HIVポジティブ（処理、未処理、および抗レトロウイルス療法の不在下でウイルス複製の制御を示す）とgp120のHIV陰性の被験者のドライブの貪食（HIVのエンベロープ）をコーティングしたビーズから臨床抗体サンプル。 <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。効率的な内部化。非オプソニン化ビーズは、ゾル中に残したまま顕微鏡では、抗体-オプソニン化ビーズ（緑）の内在化を確認ution（63x倍率）。 映画は1。抗体主導貪食のタイムラプス顕微鏡は、14時間かけて行い、ハイスループットアッセイで使用するTHP - 1細胞の貪食能の可視化を可能にした。緑色蛍光ビーズは抗体オプソニンである、赤色蛍光ビーズは、負の制御を提供します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3588/3588movie1.mov">映画を鑑賞するためには、ここをクリック。</a>

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここに記載のアッセイは、長い貪食のプロセス10とプレートベースの自動フローサイトメトリーを研究するために利用さ単球細胞株を利用することにより、臨床抗体サンプルの貪食能のハイスループット分析を可能にします。このアッセイではないだけ別の科目から、疾患特異的抗体によって駆動される食作用の違いの研究を可能にする、正確に抗原特異的抗体のサブセットを特徴づ​​けるために、その能力で他の人よりも有利ですが、また、同じサブジェクトに複数の抗原特異性の研究。単球や他の抗原提示細胞を含む生来のエフェクター細胞の抗体の採用が強く疾患の転帰11-13影響、およびFcドメイン14から16のAsparagine297で抗体の幾何学、IgGサブクラス、およびグリコシル化に応じて生物学的に可変なので、この方法はのために用意されていますアクションの重要な抗体機構の評価。さらに、抗体 - メディためated貪食が感染7,17,18の過程でいくつかの病原体によって悪用され、このアッセイは抗体依存性向上のプロセスの評価の可能性を秘めています、そして潜在的に保護だけでなく、潜在的に有害として食作用の二面性を強調抗体活性。 記載のアッセイは、患者集団の、だけでなく、ワクチン接種の臨床サンプルから抗体を分析するために利用することができる、という精製IgGより血清利用するために適合させることができる。さらに、食作用への応答におけるサイトカインの分泌は、培養上清から分析することができます、そして特定のFcRの影響は、FCR -ブロッキング抗体を用いて決定することができる、洞察力と決定される貪食能にだけではないの違いが、下流のシグナル伝達事象を、可能機構に、そしてこの免疫機構の理解を解決し、精度を高めることができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> EZ -リンクマイクロスルホ- NHS - LC -ビオチン化キット</td><td>サーモScientfic </td><td> 21935 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracel - 50膜によるアミコンウルトラ- 15遠心フィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td> UFC905024 </td><td>フィルターユニットのサイズは、抗原のサイズによって異なります</td></tr><tr><td> FluoSpheresニュートラビジンは、ミクロスフェア、1.0μmの、黄緑色の蛍光（515分の505を）というラベル</td><td>インビトロジェン</td><td> F - 8776 </td><td>メーカーは様々な色で本製品を生み出す</td></tr><tr><td>メロンゲルのIgG精製キット</td><td>サーモ</td><td> 45212 </td><td>ケアは、SDS - PAGEによる抗体試料の純度を検証するために注意が必要です。 </td></tr></tbody></table>

臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

抗体主導貪食は、専門の食細胞上のFc受容体の関与を介して誘導され、クリアランスだけでなく、病気の病理学の両方に貢献することができます。抗体の可変ドメインのプロパティが長く生体機能のために重要と考えられているが、それらのFcドメインを介して自然免疫細胞を募集する抗体の能力は、両方の組換えの設定で、その有効性の主要な要因としてますます感謝になっているだけでなく、モノクローナル抗体療法、自然感染またはワクチン接種1-3の経過インチ重要なのは、一定のドメインとして、その命名にもかかわらず、抗体のFcドメインは、一定の機能を有していない、およびIgGサブクラス（IgG1の- 4）とアスパラギン297 4-6のグリコシル化によって強く変調される。したがって、臨床サンプル中の抗原特異的抗体の機能の違いを研究するためには、このメソッドは、貪食ポットの相関関係を容易にする病気の状態、感染症への感受性、進行、または臨床転帰に対する抗体の動。 さらに、このエフェクター機能は、Fc受容体主導の貪食7を介して宿主細胞に病原体へのアクセスを提供することで感染を強化するために抗体の文書化能力の光の中で特に重要です。また、免疫複合体の貪食取り込みが免疫応答8のTh1/Th2分極に影響を与えることができるいくつかの証拠がある。 ここでは、差動IgGサブクラス、Asn297における糖鎖構造だけでなく、ハイスループットな方法で抗原特異的抗体の免疫複合体を形成する能力によって発生する可能性がある抗体誘発性食作用の違いを、検出するように設計されたアッセイを説明。この目的のために、1μmの蛍光ビーズを蛍光抗原特異的免疫複合体を生成し、臨床抗体サンプルとインキュベート、抗原でコーティングされています。これらantiboDY -オプソニン化ビーズを抑制し、活性化の両方を含む複数のFcγRsを発現する単球細胞株とインキュベートされる。アッセイの出力は、貪食能、サイトカイン分泌、およびFcγRsの使用状況のパターンを含めることができ、この感染症とワクチンを介する保護9の両方でこの抗体依存性エフェクター機能の解析の違いのため非常に有用なシステムとなって、標準化された方法で決定される。

我々は、蛍光抗原をコーティングしたビーズと標準化で複数のFc受容体は、提供する受容体の使用量と貪食能の測定を表す単球細胞株を利用し、臨床検体から抗原特異的抗体の食作用活性を決定するためにハイスループットフローサイトメトリーアッセイを提示し、興味のある任意の抗原のための再現可能なファッション。

抗体介在性食作用は、専門的な食細胞上のFc受容体の結合を介して誘導され、除去および...の両方に寄与し得る。

本実験の目的は、臨床検体中の抗原特異的抗体の食作用活性を高スループットで決定することである。まず、目的の抗原で蛍光ビーズをコーティングし、複雑な臨床抗体サンプル中に存在する抗原特異的な抗体画分を捕捉できるようにする。次に、食細胞であるTHP-1細胞を抗原結合蛍光ビーズと共にインキュベートし、結合した抗体の数およびFcドメインの特性に応じて、細胞にビーズを食作用させる。次に、サンプル中に存在する抗体の食細胞活性を定量化するため、ハイスループットプレートベースフローサイトメトリーを用いてTHP-1細胞の蛍光強度を測定します。最終的に、抗体タイターの変動または食細胞に発現している抗体受容体による認識能の変動に伴う、オプソニン化蛍光ビーズの取り込み量の差に基づき、サンプル中の抗原特異的抗体が食作用を誘導する能力を評価することができます。一次食細胞を使用するなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、スループットが向上し、標準化が改善されることです。この手法は、異なるワクチン接種計画が異なる活性を持つ抗体を誘導するかどうかなど、適応免疫応答の基礎免疫学に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。抗体は効果的な防御免疫応答の構築に大きく寄与するため、この技術の意義は感染症の治療にまで及びます。我々はこの方法を用いて、進行性HIV感染およびワクチン接種における抗体活性に関する知見を得てきましたが、インフルエンザ、自己免疫疾患、デング熱など、抗体が保護的に働くのではなくむしろ疾患を悪化させる可能性のある他の疾患状態にも適用可能です。まず、一次アミンを含まないバッファーで抗原を希釈します。次に、sulfa NHS lc, biotin試薬を水に溶解させます。続いて、水和させた試薬を直ちに抗原に添加し、混合しながら室温で1時間反応させます。反応が完了したら、遠心濃縮ユニットの上部チャンバーにサンプルを加え、バッファー交換によって過剰な未接合ビオチンを除去します。次に、PBSを加えて全量を15 milliliterの充填線まで調整します。最後に、サンプルの容量が約1.5 millilitersになるまで、4 °Cで4,000 ×g、5分間遠心分離します。遊離ビオチンのほぼ定量的な除去を達成するため、この工程を3回繰り返します。1 µmの蛍光ストレプトアビジンビーズ100 µLをマイクロ遠心機を用いて13,000 ×gで5分間遠心分離した後、ビーズを1 mLの0.1% PBS-BSAに再懸濁し、同様の遠心分離手順で洗浄します。その後、洗浄したビーズを100 µLのPBS-BSAに再懸濁し、再びビーズを10本のマイクロチューブに分注します。次に、洗浄したビーズ懸濁液10 µLを、段階的に希釈した異なる濃度のビオチン化抗原と混合します。その後、ビーズと抗原の懸濁液をマイクロ遠心チューブに入れ、ローテーターを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、PBS-BSA 1 mLで懸濁液を2回洗浄して未結合の抗原を除去し、前と同様に高速遠心分離してビーズをペレット化します。最後に、melon gel IgG精製キットを用いて血漿から臨床抗体サンプルを精製し、抗原コーティング済みビーズを最終容量1 mLのPBS-BSAで再懸濁します。製造元の指示に従い、280 nmにおける吸光度で精製抗体の濃度を測定します。次に、抗体をPBSで1 mg/mLに希釈し、陽性および陰性のモノクローナル対照抗体のサンプルも同様に準備します。続いて、抗原飽和ビーズ溶液をボルテックスで再懸濁し、その溶液を10 µLずつラウンドボトム96ウェルプレートの各ウェルに分注します。この際、各ウェルに等数の蛍光ビーズが添加されるよう、ビーズ懸濁液を絶えず攪拌するように注意してください。各対照抗体について、目的の抗体を20 µL以下の量で異なる濃度で添加し、用量反応曲線を作成します。次に、抗体がビーズに結合するように、ビーズと抗体のサンプルを37°Cで2時間インキュベートし、ビーズの調製を完了させます。THP-1細胞のサンプルを培地中で2.5×10⁵ cells/mLに希釈します。その後、各サンプルに細胞懸濁液を200 µLずつ添加します。最後に、抗体コートビーズとともに細胞を37 °C、5% carbon dioxideの静置インキュベーター内で一晩インキュベートし、重力によって細胞とビーズを沈降させます。翌日、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、各ウェルから上澄みを100 µL取り除きます。4% paraformaldehyde 100 µLで細胞を固定し、その後ピペッティングして細胞を再懸濁し、混合します。次に、プレートをハイスループットフローサイトメーターのHTSプレートリーダーにセットし、自動データ収集を行います。HTHP 1細胞の蛍光強度が捕捉され、記録されます。この蛍光強度を用いて、各細胞によって食作用されたビーズ数を決定し、それにより試験中の抗体サンプルの食細胞活性を定義します。罹患した被験者と罹患していない被験者の抗体サンプルの間には、明確な差異が認められるはずです。この図において、HIV陰性被験者の抗体サンプル（黒色のトレース）とHIV陽性被験者の抗体サンプル（灰色のトレース）のファクトヒストグラムは、抗原特異的抗体の存在によって貪食作用が増強されることを示しています。このアッセイの最適な感度は、ここで示されているように、ビオチン化抗原によるビーズの飽和に依存します。この抗原において、ビーズ1 µLあたり2 µgの抗原が飽和濃度であると決定されました。この用量反応曲線は、0.05から5 µg/mLの抗体濃度範囲において、被験抗体試料が食作用を誘導する能力に差があることを示しています。この差次的な食作用は、力価の違い、またはIgGサブクラスや糖鎖付加状態などのFCドメイン特性の違いによって引き起こされる可能性があります。TP one細胞を蛍光顕微鏡で観察すると、ビーズの食作用の明確な証拠が見られます。抗体でオプソニン化したビーズ（緑色）および非オプソニン化ビーズ（赤色）とともにインキュベートした後のTP one細胞の静止画では、緑色のビーズのみがTP one細胞によって細胞内に取り込まれており、抗体がない場合には食作用による取り込みが起こらないことが示されています。タイムラプス顕微鏡観察を行うと、蛍光ビーズの抗体特異的な食作用による取り込みがより顕著に現れます。ここで見られる緑色蛍光ビーズは抗体イオン化されています。赤色蛍光ビーズは陰性対照として用いています。この手順に続き、感染やワクチン接種に対する抗体応答の特性に関するさらなる疑問を解決するために、抗体機能の他の試験を実施することができます。このビデオを視聴することで、ハイスループットフローサイトメトリーを用いて抗体サンプルの食作用活性を決定する方法について十分に理解できるはずです。臨床血液および血漿サンプルを扱う際は非常に危険が伴うため、本手順を実施する際は、適切な個人用保護具の着用や安全な取り扱い手順の遵守など、常に予防策を講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

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臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する

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