三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

本デモンストレーションでは、3Dマトリクス内の生細胞における蛍光タグ付きタンパク質のイメージングを目的とします。まず、蛍光タグ付きタンパク質を発現する安定発現細胞株を作製します。これらの細胞を3Dコラーゲンマトリクスに播種し、共焦点顕微鏡を用いて遊走する細胞のタイムラプス画像を取得します。

最終的に、タイムラプスイメージングと蛍光タンパク質（FP）解析を通じて、遊走細胞内におけるタンパク質の局在とダイナミクスが明らかになり、3次元かつリアルタイムでタンパク質の動態と局在を観察することが可能になります。これは、細胞遊走における根本的な問いを解決するための一つの手法となります。例えば、接着接点は細胞質タンパク質によってどのように制御されているのか、といった点です。

また、これらの接点が特定の阻害剤によってどのように乱されるかも検討します。P 35ディッシュを用い、コンフルエンシーが80から90%になるように細胞を培養し、メーカーの指示に従ってLipo 2000を用いて目的のプラスミドを細胞にトランスフェクトします。その後、細胞をインキュベーターに入れます。

翌日、細胞を2枚のP105ペトリ皿に分注し、一晩インキュベートします。G418を50 µg/mL添加して培地を補充してください。抗生物質による選択条件下で2週間培養を継続します。

培養物を調べ、G four 18耐性コロニーを確認します。次に、倒立蛍光顕微鏡を用いて、GFP陽性コロニーを特定し、マークします。

細胞をPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、マークした各コロニーが乾燥しないよう、薄い液層を残しておきます。滅菌綿棒を用いてコロニーの縁のできるだけ近くまで拭き取り、trypsinを10 µL、コロニー上にピペットで加えます。

すべてのコロニーに対して迅速に繰り返します。次に、細胞を剥離させるため、プレートを37 °Cでインキュベートします。顕微鏡下で、細胞が球状であることを確認してください。

各コロニーに10 µLのトリプシンを添加し、ピペッティングして細胞をプレートから完全に剥離させます。次に、安定したコロニーを増殖させるため、各細胞コロニーを24ウェルディッシュの単一ウェルに移植します。その後、標準的なウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光染色を用いて、コロニーのタンパク質発現を評価します。

選択した細胞株を拡大培養し、ガラス表面の修飾を行う。底面がガラスのディッシュは、最適なコラーゲン結合を可能にする。開口部 10 mm の P 35 ディッシュ各々のガラス部分に、シリル化溶液 300 µL をピペットで分注する。

室温で1時間インキュベートします。溶液を吸引し、ろ過水で10分間ずつ3回洗浄します。水を取り除き、ディッシュを50 °Cに設定したホットプレートに1.5時間置きます。

乾燥させるため、ディッシュの蓋をわずかにずらして置いてください。乾燥したディッシュが冷却した後、各ディッシュのガラス部分に2%グルタラールデヒド溶液を300 µLピペッティングします。1時間インキュベートし、その後PBSで10分間ずつ3回洗浄します。

UV光に1時間曝露させ、ディッシュを滅菌します。まず、100 µLの蛍光トレーサー粒子を遠心分離してペレット化します。上清を除去し、粒子を500 µLの培地で再懸濁します。

5回洗浄した後、粒子を30 µLの培地で再懸濁します。次に、トリプシンを用いてGFP発現細胞を回収し、1 mLあたり2 million cellsの細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに調製します。成長培地240 µLをピペットで分注します。そこに1 M HEPES 12.6 µL、ろ過水20 µL、細胞溶液50 µL、および蛍光粒子10 µLを加えます。

最後に、167 µLのウシ真皮コラーゲン溶液を加え、溶液を十分に混合します。次に、準備したシロライズドディッシュのガラス部分に80 µLを分注します。ゲルを重合させるため、37 °Cで50分間インキュベートします。

次に、2 mLの成長培地を注意深く加えます。顕微鏡チャンバーを37 °Cの定常温度に平衡化し、細胞培地を補充します。DICイメージングのために中性pHを維持するには、ディッシュの上部をパラフィルムの細いストリップを貼ったガラスカバーに交換します。

油浸対物レンズを使用する場合、蒸発を防ぐためにディッシュの側面を覆います。対物レンズの位置に浸漬液を1滴滴下します。ディッシュに入ったコラーゲンゲルを顕微鏡ステージ上に配置し、ディッシュが浸漬液に接するようにします。

サンプルのフォーカスを合わせ、ステージドリフトを最小限に抑えるために、撮影対象となる細胞を検索します。ディッシュを約45分間静置して安定させます。長時間キャプチャを開始する前に、阻害剤添加実験の画像取得パラメータを指定してください。

目的の常用濃度で薬剤を添加した補充培地を調製します。中性pHを維持するために細胞培地を補充しますが、パーフレックス（perfil）で密封しないでください。サンプルを顕微鏡に移し、薬剤処理のタイミングでイメージングを開始します。

画像を一時停止し、ディッシュを動かさないように注意しながら、ディッシュの蓋を慎重に取り除きます。培地を吸引し、薬剤を含む培地をディッシュにピペットで分注します。その後、慎重に蓋を戻します。

FRAPの最適なセットアップはシステムによって異なります。したがって、製造元の取扱説明書を参照してください。まず、生細胞イメージング用のパラメータを設定します。

光退色を行うため。細胞を損傷させることなく蛍光信号を光退色させるのに十分なレーザー出力を得るため、これらのパラメータを練習用細胞でテストしてください。次に、サンプルの画像キャプチャを開始し、少なくとも5フレームを取得します。

次に、関心領域を光退色させます。回復時間を通してキャプチャを継続してください。統計解析ソフトウェアを用いて、光退色の前後における光退色領域の平均蛍光強度を時間経過とともに測定します。

回復曲線を指数関数にフィットさせます。指数近似曲線から、半減期と最終強度のパラメータを求めます。その後、初期蛍光強度に対する最終強度の比を算出することで、可動分画を計算します。

これらの3D生細胞画像は、GFPアクチンを発現している健全な上皮細胞を示しています。4日間の培養後、これらの細胞は3Dコラーゲンマトリックス内でシストを形成しました。一部の細胞はシストの表面に沿って移動し、 l他の細胞はシストの内部で移動しました。

遊走細胞によって加えられる牽引力に起因するマトリックスの変形は、周囲のマトリックスに埋め込まれたトレーサー粒子の変位を通じて分析されます。ここでは、ROキナーゼ阻害が牽引力に及ぼす影響を示しています。トレーサー粒子の動きは、異なる時点における最大投影画像として表示され、各時点に擬似カラーで色付けされています。

あるいは、個々のトレーサー粒子の画像をモンタージュとして表示し、トレーサー粒子の動きを示します。時間の経過とともに、このトレーサー粒子は、Y 2 7 6 3 2の添加前後にそれぞれ、遊走細胞の後縁に向かって、あるいは後縁から離れるように移動しました。FRAP解析では、3次元マトリックス内を遊走するGFP actin発現細胞を追跡し、典型的な蛍光回復を示します。最適化されたレーザー設定での光退色実験後、細胞の健全性と無傷な状態を維持しつつ、関心領域の蛍光強度が背景レベルに比べて明らかに減少しています。

このグラフは、指数関数を用いた回収曲線のフィッティングを示しています。習熟すれば、マトリックスへの細胞播種は1時間で完了します。3-アミノプロピルトリメチルスルホニウムを扱う際は極めて危険であることに注意してください。

したがって、化学薬品用フード内で作業するなど、十分な予防措置を講じてください。また、3Dマトリックス内で細胞を扱う際は、無菌状態を維持することを忘れないでください。