三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

このような細胞遊走などの細胞プロセスは伝統的に二次元、硬いプラスチックの表面に研究されている。このレポートは、直接タンパク質の局在を可視化し、より生理学的に関連する、三次元マトリックスに移行する細胞で蛋白質のダイナミクスを分析するためのテクニックを説明します。

このデモンストレーションは、A 3Dマトリックス中の生細胞内の蛍光タグ付きタンパク質をイメージングすることを目的としています。まず、蛍光タグ付きタンパク質を発現する安定な細胞株を作製します。これらの細胞を3Dコラーゲンマトリックスに播種し、共焦点顕微鏡を使用して移動する細胞のタイムラプス画像を取得します。

最終的に、タイムラプスイメージングとFP解析、タンパク質のダイナミクスとローカリゼーションの観察を3Dおよびリアルタイムで観察することで、移動する細胞内のタンパク質の局在とダイナミクスが明らかになります。細胞移動における基本的な問題に対処するための1つの手段を提供します。例えば、接着性接触は細胞質タンパク質によってどのように制御されているのでしょうか?

また、これらの接触は特定の阻害剤によってどのように攪乱されますか。P 35ディッシュでは、80〜90%coの流暢さで細胞を培養し、メーカーの指示に従って、lipo 2000を使用して目的のプラスミドを細胞にトランスフェクションします。次に、細胞をインキュベーターに入れます。

翌日、細胞を2つのP one 50ペトリ皿に分割し、一晩インキュベートします。G 4 18のミリリットルあたり50マイクログラムを追加するためにメディアを補充します。抗生物質の選択下で2週間培養を続けます。

G 4 18耐性コロニーの培養を調べます。次に、倒立蛍光顕微鏡を使用します。GFP陽性コロニーを同定し、マーキングします。

細胞をPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、マークされたコロニーごとに細胞が乾燥するのを防ぐために、液体の薄い層を残します。滅菌した綿棒で端の周りをできるだけ近くで拭き、コロニーに10マイクロリットルのトリプシンをピペットでつなぎます。

コロニーごとに迅速に繰り返します。次に、プレートを摂氏37度でインキュベートして細胞を剥離させます。顕微鏡で丸みを帯びた外観を確認します。

各コロニーに10マイクロリットルのトリプシンを加え、ピペットでプレートから細胞を完全に剥離します。次に、細胞の各コロニーを24ウェルディッシュ培養の1つのウェルに移し、安定したコロニーを増幅します。次に、標準的なウェスタンブロットと免疫蛍光法を用いて、コロニーのタンパク質発現を評価します。

選択した細胞株をガラスの表面修飾を展開します。下の皿は最適なコラーゲン結合を提供します。300マイクロリットルのサイロ化溶液を、10mmの開口部を持つ各P 35ディッシュのガラス部分にピペットで貼り付けます。

室温で1時間インキュベートします。溶液を吸引し、ろ過した水でそれぞれ10分間3回洗浄します。水を取り除き、摂氏50度のホットプレートに皿を1.5時間置きます。

乾燥させるために、皿の上部を皿から少し離して配置します。乾燥皿がピペットで冷やした後、各皿のガラス部分に2%グルタルアルデヒド溶液の300マイクロリットルを。1時間インキュベートした後、PB S3で各10分間洗浄します。

UVライトに1時間さらして皿の滅菌に進みます。まず、遠心分離により蛍光トレーサー粒子100マイクロリットルをペレット化します。液体を廃棄し、粒子を500マイクロリットルの媒体に再懸濁します。

5回の洗浄を行った後、粒子を30マイクロリットルの媒体に再懸濁します。次に、トリプシンを用いてGFP発現細胞を回収し、1ミリリットル当たり200万個の細胞の懸濁液をeinor tube Pipette 240 μlitersの成長培地に調製する。1モルヒープの12.6マイクロリットル、ろ過水20マイクロリットル、細胞溶液50マイクロリットル、および蛍光粒子10マイクロリットルを追加します。

最後に、167マイクロリットルのウシ真皮コラーゲン、1つの溶液を十分に混合溶液に加えます。次に、準備したサイロ化された皿のガラス部分に80マイクロリットルを移します。ゲルが重合するまで、摂氏37度で50分間インキュベー

次に、2ミリリットルの成長培地を慎重に追加します。顕微鏡チャンバーを摂氏37度の定常状態の温度に平衡化し、細胞培地を補充します。DICイメージング用の中性pHを維持するには、ディッシュの上部をパラフォームの薄いストリップを備えたガラストップに交換します。

油浸対物レンズの蒸発を防ぐために、皿の側面を覆います。対物レンズの位置に1滴の液浸液を置きます。顕微鏡ステージ上のディッシュを含むコラーゲンゲルは、ディッシュが浸漬液と接触します。

サンプルに焦点を絞り、イメージングする目的の細胞を検索して、ステージドリフトを最小限に抑えます。皿が落ち着くまで約45分待ちます。長時間のキャプチャを開始する前に、阻害剤添加実験の画像取得のパラメータを指定します。

薬物を添加した培地を所望の作業濃度で調製します。細胞培地を補充して中性pHを維持しますが、パーフィルで密封しないでください。サンプルを顕微鏡に移し、薬物治療時のイメージングを進めます。

画像を一時停止し、皿を邪魔することなく、皿の上部をキャプチャして慎重に取り外します。メディアを吸引し、メディアを含む薬物を皿にピペットで移します。次に、皿を慎重に交換します。

トップ frap のセットアップはシステムによって異なります。したがって、製造元の指示を参照してください。まず、ライブセルイメージングのパラメータを設定します。

光退色用。これらのパラメータを練習用細胞でテストして、細胞を損傷することなく蛍光シグナルを光退色するのに十分なレーザー出力を得ます。次に、少なくとも5フレームを取得するサンプルで画像キャプチャを開始します。

次に、関心のある領域を光退色します。リカバリ時間にわたってキャプチャを続けます。統計解析ソフトウェアを使用して、光退色前後の光漂白領域の平均蛍光強度を経時的に測定します。

回復曲線を指数方程式に当てはめます。指数関数的近似曲線から半減時間と最終強度のパラメーターを取得します。次に、最終蛍光強度と初期蛍光強度の比を取ることにより、移動画分を計算します。

これらの3Dライブセル画像は、GFPアクチンを発現する健康な上皮細胞を示しています。4日間の培養後、これらの細胞は3Dコラーゲンマトリックス中に嚢胞を形成しました。一部の細胞は嚢胞の表面に沿って移動し、他の細胞は嚢胞の内部に移動しました。

移動する細胞によって加えられる牽引力の結果としてのマトリックス変形は、周囲のマトリックスに埋め込まれたトレーサー粒子の変位を通じて分析されます。ROキナーゼ阻害が牽引力に及ぼす影響を以下に示します。トレーサー粒子の動きは、異なる時点の最大投影画像として表示され、各時点は擬似色付けされます。

あるいは、個々のトレーサー粒子の画像がモンタージュとして表示され、トレーサー粒子の動きを示すこともできます。時間の経過とともに、このトレーサー粒子は、Y 2 7 6 3 2の添加前と後に、それぞれ移動するセルの後縁に近づいたり遠ざかったりしました。FRAP分析は、GFPアクチンを発現する細胞が3次元マトリックス中を移動するときに追跡し、典型的な蛍光回復を示します最適化されたレーザー設定での光退色実験後、関心領域の蛍光強度は、健康で損傷を受けていない細胞を維持しながら、バックグラウンドレベルと比較して目に見えて減少します。

このグラフは、指数関数による回復曲線の適合を示しています。マスターすると、マトリックス内の細胞の播種には1時間かかる場合があります。3つのアミノプロピルトリメチルを扱うことは非常に危険であることを忘れないでください。

ですから、ケミカルフードでの作業など、予防策を講じてください。また、3Dマトリックスで細胞を扱う際には、無菌状態を維持することも忘れないでください。