Name: PAK2活性化のアミド水素/重水素交換とMALDI - TOF質量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 学ぶMALDI-TOF質量分析によるPAK2のアミド水素/重水素交換解析法。カスパーゼ3切断と自己リン酸化を伴うタンパク質活性化の構造動態を詳細に解明し、タンパク質動態研究に有用な手法です。

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1。 PAK2活性化<ol><li>バッファの12 mg / mlのPAK2の20μlにカスパーゼ3の適切な事前検証済みの金額を追加（pH7.5の50mMトリス- HCl、150mMのNaCl、2 mMのDTT）、34℃でインキュベート℃で30分間完全に切断するとアクティブにPAK2へ。 </li><li> SDS - PAGE（10％）とCoommassieブルー染色により切断産物を分析する。 </li><li> 10 mg / mlのPAK2の最終濃度20μlに、pH7.5の活性化緩衝液B（50mMトリス- HCl、150mMのNaCl、15 mMのMgCl 2、10mMのATP）に切断されたPAK2を追加し、34でインキュベート℃で30分間完全に8サイトで自己リン酸化によってPAK2をアクティブにする。 </li><li>としてSDS - PAGE 10で決定したP34とP27の断片の移行により、PAK2の完全切断を確認してください。自己リン酸化状態の適切な検証は、リン酸化ペプチドを検出するために（32 P）ATPまたは質量分析計を用いた別の実験でオートラジオグラフィーを介して行われる。 </li></ol> 2。識別ペプシン消化PAK2フラグメントの<ol><li>使用するために二回前にアガロースビーズを洗浄するためにpH 2.5の0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を1 mlを追加。その後、ビーズを除去するために2000 × gで15秒間のサンプルを遠心してください。 </li><li> 0.1％TFA 100μlにPAK2（150mMのNaCl2μlの20μgの、pH7.5の50mMのTris - HCl、2 mMのDTT）を追加し、ペプシン - 共役アガロースビーズを30μlと5分間サンプルをインキュベート。 </li><li> pH2.5で0.1％TFAの主溶媒系逆相HPLC C18カラムを平衡化する。 0.2ml /分の流速で0.1％TFAを含む80％アセトニトリル - ペプシン消化物（50μl）を0のリニア、100分の勾配を用いて溶出される。画分を毎2分を集めている。 </li><li> （3時間）速度- VACでHPLC画分を乾燥し、アセトニトリル（5μL）とpH2.5の0.1％TFA（5μl）の溶液中で試料を懸濁します。 </li><li>当初は、各フラクションをMALDI - TOF PerSeptiveバイオシステムズボイジャーDEのSTR（PE Biを用いてペプチドをスクリーニングされosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）。 </li><li>ペプチドを含んだ、16画分はフラグメントを識別するために、Q - TOF質量分析計とQSTAR XL oMALDI MS / MSを用いたタンデム質量分析に供される。 </li><li>各ペプチドの配列は、プロテインプロスペクターのウェブサイト（使用PAK2の一次配列に基づいて理論的なm / zの比を有するタンデム質量分析によって生成された生成物イオンによって検証されます<a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ）11。 </li></ol> 3。アミドH / D交換の測定<ol><li>水浴で25℃、H / D交換のために必要なすべてのソリューションと試薬° Cを保持する。 ATPを水に溶解し、pHは、使用前に7.0に調整されます。 D 2 Oバッファの追加4mmのATPは、希釈後PAK2から解離ATPを防ぐためです。 </li><li> （20μgの2μlのにバッファリングされたD 2 O（50 mMのMOPSのpHは6.98、125 mMのNaCl）を18μlを添加することにより、H / D交換を開始）0時10 mg / mlのおよび7.0のpHのPAK2レベルで、その結果150mMのNaCl、50mMのTris - HCl（pH7.5）及び2mMのDTTを含む緩衝液中PAK2、℃の</li><li> 0、0.5、1、3、5、および10分、または24時間H / D交換の三連でサンプルをインキュベートする</li><li> 200μlの最終容量で2.5にpHをもたらすpHを2.2、氷冷0.1％TFA 180μlを添加して、H / D交換のプロセスを急冷。 ATP、pHは2.2で氷冷0.11％TFA 180μlを含むサンプルの場合は焼入れ状態で2.5のpHを維持するために使用されます。 </li><li>活性ペプシン-共役アガロースビーズを30μlに各急冷試料のアリコート（100μlの）を追加します。ペプシン消化は5分間氷上に進行させると、サンプルは30秒ごとにボルテックスしている。 </li><li> 4℃で5000 × gで15秒間のサンプルの遠心分離により消化を終了° Cは、ペプシンを削除する。 </li><li>急速に3回以上の-80℃で液体N 2と店舗でサンプルを凍結するMALDI - TOF分析に先立って日。 </li><li> MALDIのマトリックスは、5 mg / mlのα-シアノ-4 - ヒドロキシアセトニトリル、エタノール及びpH 2.5の0.1％TFA溶液（午前1時01分01秒）に溶解し、0℃で開催された酸（CHCA）です。 </li><li>部分的に迅速に各サンプルを解凍し、4℃MALDIのターゲットプレート上にマトリックスとスポットの1μlを各サンプルを1μlを混合。 </li><li>前のMALDI - TOF分析に30秒のスポットを乾燥させるプレートに適度な真空を適用します。サンプルの融解とスペクトルの取得との間の時間は3分程度です。 </li><li> PerSeptiveバイオシステムズボイジャーDEのSTRとMALDI - TOF質量スペクトルを取得する。 20,000 Vの加速電圧、および180 nsのパルスの遅延と遅延抽出を使用して65％グリッド電圧で、10万のデータチャンネルで、2 GHzのサンプリングレートでデータを取得する。百スキャンは2分で平均化されています。 MALDI - TOF装置はあらゆるブランドや特定のソフトウェアに限定されるものではありません。 </li><li> calculにデータExplorer 4.0のコンピュータプログラムを使用して、各フラグメントの重水素化を食べた。 </li><li> N -末端アミド（ 図1）を除き、バックボーンのアミド類である可能性のあるすべての交換可能なサイト、で割ったH / D交換の24時間での実際の組み込まれた重陽子の数の比に基づいて、バックの交換を計算する。 </li></ol> 4。代表的な結果： カスパーゼ切断と自己リン酸化は、SDS - PAGE Commassie染色によって検証されます。非アクティブなPAK2は58 kDaの単一バンドです。 PAK2のカスパーゼ切断が完了し、別々に移行する二つの断片、P27とP34を生成します。自己リン酸化p27のとP34を示し、完全にリン酸化されたp27の断片（ 図2）の遅滞マイグレーションによるゲル上でのオーバーラップの移行。 H / D交換実験は、0〜10分（ 図3）の間に複数回行われている。例として、M / ZPに重水素結合の時間経過時間をかけて大量の封筒のシフトで示されるように非アクティブPAK2のEAK 1697.85は、複数の同位体のピークで構成されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> 図1重水素化の計算のための方程式。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> 図2自己リン酸化とPAK2のカスパーゼ切断。カスパーゼ切断されたPAK2（左車線）、無傷の非アクティブPAK2（中央車線）とカスパーゼ切断された自己リン酸化PAK2（右レーン）をSDS - PAGEとCoommassieブルー染色により分析した。スー、YHら2から適応。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" />非アクティブなPAK2用重水素結合の時間経過の図3。質量スペクトル。非アクティブなPAK2は、H / D exchaに供した00〜10分間のゲイン誤差とMALDI - TOFで分析。 H / D交換の時間経過時のピークのm / z 1697.85のMALDI - TOFの拡張同位体分布の例が示されている。赤い点線は、大量のエンベロープの平均値を示し、大量の封筒のシフトは、ペプチドの重水素化を示しています。

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
<li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li>
<li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2%2B-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li>
<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ペプシン消化断片の同定は、H / D交換実験の重要なステップです。ペプチドの不正確な同定は、間違った結論を導くことができる。ペプシン消化PAK2は、きれいなバックグラウンドを得るために、逆相HPLC C18カラムに通して溶出させる。我々の実験では、40画分の合計を集め、MALDI - TOFに供した。複数のペプチドは、各画分で同定することができた。ペプチドはその配列を同定するためにタンデム質量分析計（Q - TOF MS / MSとoMALDI MS / MS）を行った。ペプチドのMS / MSスペクトルはペプチドの同定を確認するために少なくとも3つの製品のイオンを持つ必要があります。 データエクスプローラ4.0のコンピュータプログラム（アプライドバイオシステムズ）は、初期のベースライン補正やノイズフィルタを実行します。各スペクトルは2つのシークエンスピークに基づいて校正する必要があります。我々は、923.45と1697.84ですundeuteratedのm / zの理論的質量によって私達のスペクトルを校正。 T彼は、キャリブレーション後の質量精度は10ppmに達することができる。重水素化されると、モノ同位体は、より高い質量にシフトする場合があります。これらのm / zの比にユニタリステップの増加は、重水素化に関連付けられている強化された大衆が得られた。大量の封筒のピーク強度は、重水素化のレベルには影響しません。しかし、特定の質量の封筒の同位体ピークのピーク強度は、平均的な質量の計算のための非常に重要です。取り込まれた重陽子の計算の最初のステップは、重水素化サンプルから非重水素化試料のペプチド質量を引いている。他の3つの要因は、D 2 O希釈、側鎖に残留重陽子とバックの交換は、さらに計算（ 図1）で考慮する必要があります。 D 2 Oの希釈は、H / D交換を開始するサンプルとD 2 Oのバッファを混合後、D 2 Oの希釈率です。ペプシン消化物の側鎖中の残留重陽子（4.5％）EDのペプチドは、減算する必要があります。バックの交換は、質量測定のプロセスのすべての重水素とペプシンで消化されたペプチドの重水素化の必然的な損失です。 H / D交換の24時間後にほとんどの溶媒にアクセス可能なペプチド（m / zの= 1105.60）は、完全な重水素化の領域を表します。ペプチドの各々に対して組み込ま重陽子の数は、重水素化や非重水素化PAK2消化ペプチドの重心の差です。最も高度に重水素化ペプチドのm / z 1105 PAK2は、H / D交換の24時間にいたときには完全な重水素化を表すために選ばれました。戻る交換比率は、ペプチドのm / z 1105のすべての可能な交換可能なサイトで割ったH / D交換の24時間で実際の組み込まれた重陽子の数によって算出した。

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td>アルドリッチ</td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-シアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸</td><td>シグマ</td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI - TOF </td><td> PEバイオシステムズ</td><td>ボイジャーDEのSTR </td><td></td></tr><tr><td> Q - TOF質量分析計</td><td> Q - TOFアルティマ - グローバル</td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>データエクスプローラ4.0のコンピュータプログラム</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td></td><td></td></tR&gt; </tbody></table>

pak2活性化のアミド水素/重水素交換とmaldi - tof質量分析

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

質量分析法と相まってアミド水素/重水素交換（H / D交換）が広くタンパク質 - タンパク質相互作用、タンパク質立体構造の変化、タンパク質のダイナミクスとタンパク質 - リガンド相互作用のインターフェースを分析するために使用されています。バックボーンアミドポジションのH / D交換は、質量分析法1,2,3によってタンパク質のマイクロの領域の重水素化率を測定するために利用されている。この方式の分解能は、通常30から20残基の範囲であるペプチドへの関心の重水素化タンパク質のペプシン消化によって決まります。質量分析法により測定されたH / D交換の決議は、NMRの異種単量子コヒーレンス（HSQC）法で測定した1残基の解像度よりも低いですが、H / D交換の質量分析の測定は、のサイズによって制限されていませんタンパク質4。 H / D交換は、タンパク質の立体構造を維持する水溶液中で実施される。我々は、util、そのメソッドを提供する代わりに、HPLC / ESI（エレクトロスプレーイオン化）- MSシステム5,6の検出2のMALDI - TOFを、izes。 MALDI - TOFは、この場合プロテインキナーゼPAK2（また、γ- PAKと呼ばれる）で、​​消化タンパク質のペプチドの精密質量の強度データを提供します。パック2のタンパク質分解は、オフラインペプシン消化で行われる。ユーザーは、質量分析に接続されているHPLCおよびペプシン列へのアクセス権を持っていない、またはHPLCでのペプシンの列には、例えば、最適な消化のマップでは発生しません場合は、この代替法、、重く、ジスルフィド結合分泌ホスホリパーゼA 2 （SPLA 2）。この方法を利用して、我々は成功したカスパーゼ3切断と自己リン酸化7,8,9によってPAK2の活性化中に重水素化レベルの変化をモニターした。

MALDI - TOF質量分析法は、正常にプロテインキナーゼPAK2活性化のアミド水素/重水素交換を監視するために利用された。

PAK2活性化のアミド水素/重水素交換とMALDI - TOF質量分析

アミド水素・重水素交換（H/D交換）と質量分析の組み合わせは、タンパク質間相互作用の界面を解析するために広く用いられてきました。

本実験では、タンパク質に関連する水素・重水素交換をモニタリングするために、質量分析法をどのように利用するかを実演します。活性化状態に至る構造変化を解析するため、まず caspase 3 を用いて protein kinase PAK2 を切断し、次に ATP を基質として用いた自己リン酸化により PAK2 を活性化させます。その後、Pepsin で PAK2 を消化し、タンパク質 PAK2 フラグメントをタンデム質量分析法で解析します。続いて、各 PAK2 フラグメントの重水素レベルをモニタリングすることにより、PAK2 の水素・重水素交換パターンを解析します。mD-analysis を用いた水素・重水素交換の正確なレベルの解析は、caspase 3 による PAK2 の切断および自己リン酸化に関する重要な知見を提供します。この手法は、タンパク質の構造変化、タンパク質-リガンド相互作用、およびタンパク質-タンパク質相互作用といったタンパク質ダイナミクスに関する疑問を解決するのに役立ちます。HD交換LCQ質量分析などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、装置面におけるものです。この手順では、HD交換の結果を分析するためにHPLC連結質量分析計を必要とせず、0.6 µgのPAC twoを切断するための操作も容易です。caspase 3を加え、反応液を34 °Cで30分間インキュベートします。SDS-PAGEによる生成物の分析を行い、PAC 2およびPAC 2の完全な切断を確認します。活性化反応には、切断したPAC 2を20 µLの活性化バッファーBに加え、34 °Cで30分間インキュベートします。P 34およびP 27フラグメントの移動により、自己リン酸化をSDS-PAGEで確認します。まず、プリン結合aroビーズを1 mLの0.1%トリフルオロ酢酸で2回洗浄します。10 mg/mLのパック2を0.1% TFAで2 µL希釈し、100 µLに調整します。洗浄したプリン結合aroビーズ 30 µLを加え、5分間インキュベートします。逆相HPLC C18カラムを、pH 2.5の0.1% TFAで平衡化します。次に、Pepin Digestをロードし、100分の線形グラジエントを用いて希釈します。HPLC画分をSpeedVacで乾燥させた後、2分ごとに分画を回収します。サンプルを5 µLのアセトニトリルおよび0.1% TFA（pH 2.5）に懸濁します。初期スクリーニングとして、各フラクションをMALDIで分析し、ペプチドが含まれるすべてのフラクションを特定します。タンデム質量分析法によりフラグメントを同定します。Protein ProspectorのMSプロダクト機能を使用して、娘イオンをPAC twoの一次配列に基づく理論的なm/z比と照合します。まず、水素・重水素交換用のすべての溶液および試薬を平衡化させます。18 µLの重水バッファー（buffer D₂O）を2 µLの10 mg/mLのタンパク質溶液に加え、水素・重水素交換を開始します。反応は、タイムコースに沿って3回繰り返し（triplicate）実施します。180 µLの氷冷した0.1% TFA（pH 2.2）を加え、水素・重水素交換反応を停止させます。次に、水素重水素の100 µL分注液を分注します。活性化pepin結合凝集ビーズ30 µLに対し、2つずつ加えてください。このpepin消化を氷上で5分間インキュベートします。30秒ごとにボルテックス処理を行い、遠心分離によってPepsinを迅速に除去することで、消化反応を効果的に停止させます。分析まで、サンプルを液体窒素で凍結保存します。マトリックスを準備して0°Cで保存し、各サンプルを迅速に部分解凍します。1 µLのサンプルと1 µLのマトリックスを混合し、分析の30秒前に4 °Cに冷却したターゲットプレート上にスポットします。プレートに中程度の真空を適用して乾燥させます。スポットあたり平均100回のスキャンを行い、2分間で質量分析スペクトルを取得し続けます。Data Explorer 4.0コンピュータプログラムを使用して、各フラグメントの持続時間を算出します。次に、24時間後の水素重水素交換による実際の取り込み数を、末端アミドを除く主鎖アミドであるすべての交換可能な部位の数で除した比率に基づき、バックエクスチェンジを算出します。この例では、CASP Bayの切断および自己リン酸化がSDS-PAGEのクマシー染色によって確認されています。非リン酸化の状態にある不活性型PAC2は、58 kilodaltonsの単一のバンドとして検出されます。自己リン酸化に伴い、PAC2の切断が完全に進行すると、制御ドメインであるP27と触媒ドメインであるP34の2つの断片が生成されます。タンパク質ゲル上の自己リン酸化P27およびP34の泳動位置は、非リン酸化PAC2と比較して完全にリン酸化されたP27断片の泳動が遅延するため、互いに重複して現れます。このマススペクトルは、不活性なPAC twoにおける重水素取り込みのタイムコースを示しています。m/zピーク1697.85は、マスエンベロープのシフトに示されるように、複数の同位体ピークで構成されています。時間の経過とともに、赤色の点線がマスエンベロープの平均を示し、マスエンベロープのシフトはペプチドが完全に修飾されるまでの時間を示しています。この手法は、適切に行えば2日間で完了できます。液体窒素の使用は極めて危険であるため、1.5 mL EOLチューブを液体窒素に入れる前に、キャップに穴を開けるなどの予防策を講じることを忘れないでください。

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このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

ランチペプチド合成酵素は、ペプチド天然物の生合成中に多段階反応を触媒する。ここでは、ランチペプチド合成酵素の立体ダイナミクス、ならびにペプチド天然物生合成に関与する他の同様の酵素を研究するために使用できる、連続的なボトムアップ、水素重水素交換質量分析(HDX-MS)ワークフローについて述べています。...

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

前駆体同位体標識とアイソバリックタグ(cPILOT)は、利用可能なアイソバリックタグで同時に分析できるサンプル数を増やすことができる、強化されたサンプル多重化戦略です。ロボットプラットフォームの組み込みにより、実験のスループット、再現性、定量的精度が大幅に向上しました。...

組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cPILOT)を使用した自動サンプル多重化

無傷の細胞における候補阻害剤による標的関与を評価する能力は、創薬にとって極めて重要である。このプロトコルは、野生型SHP2またはその発癌性変異体を標的とする阻害剤の細胞標的関与を確実に検出する384ウェルフォーマットの細胞熱シフトアッセイについて説明する。...

SHP2(PTPN11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。...

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

学ぶMALDI-TOF質量分析によるPAK2のアミド水素/重水素交換解析法。カスパーゼ3切断と自己リン酸化を伴うタンパク質活性化の構造動態を詳細に解明し、タンパク質動態研究に有用な手法です。

PAK2活性化のアミド水素/重水素交換とMALDI - TOF質量分析

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