クロス種の移植による神経堤の移行および分化の解析

この手法の全体的な目的は、神経堤細胞の移動と運命を追跡するために、段階を合わせたウズラ胚の背側神経管外植片をニワトリ胚に移植することです。まず、ホストとなるニワトリ胚のIGN膜に小さな穴を開けて神経管にアクセスします。その後、ドナーとなるウズラ胚を卵から取り出し、移植片の切除準備を行います。

次のステップでは、ホスト胚の神経管から関心領域を切り出します。続いて、移植用にドナー神経管から同様の領域を切り出します。次に、ドナー神経管をホスト神経管に移植します。

最後に、キメラ胚を目的のステージまでインキュベートし、選択した器官に到達した神経堤細胞を検出します。最終的に、ホスト胚のさまざまな部位へのドナー由来神経堤細胞の遊走と分化を、免疫蛍光顕微鏡を用いて可視化することができます。微小切除と移植の工程には非常に緻密な手指の動作が必要であり、習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

まず、雛の卵に付着している汚れをぬるま湯で洗い流します。卵をトレイの上に水平に並べ、胚が位置する領域を示すために、上を向いている面に鉛筆で印を付けます。ドナー胚のX ovo調製を行う場合は、ウズラの脚側（鈍端）を下にしてインキュベートしてください。

次に、卵を38 °Cの加湿インキュベーターに入れ、ロッキング機能をオンにします。卵の培養が完了したら、70%エタノールを噴霧し、キムワイプで速やかに拭き取って上部を滅菌します。卵殻からの吸収を防ぐため、滅菌した各卵を、ここに示すように折りたたんだキムワイプを敷いたペトリ皿のような個別の卵ホルダーに置きます。その後、滅菌済みの精密ピンセットを使用して、卵の尖った端にある卵殻の上表面に小さな穴を開けます。

5 mLのシリンジに18.5Gの皮下注射針を装着します。次に、針の刃先を卵の尖った側に向けて、卵殻の穴に垂直に挿入します。吸引によって誤って卵黄を損傷させるのを防ぐため、前述と同様に穴を70% ethanolで洗浄し、スコッチテープで穴を密封します。

次に、double A forcepsを用いて、水平方向の脚の印を付けた上面の、頂点から少しずれた位置に別の穴を開けます。続いて、曲がったiris forcepsの片側を、卵と平行になるように穴に挿入します。その後、殻を挟み込み、円を描くように動かして殻を砕きます。

鶏卵の殻に直径2 cmの窓を開け、取り除いた殻は廃棄します。胚は卵黄の上にある不透明な円盤状に見えるはずです。卵黄表面に小さな白い点があるか、あるいは胚盤（blastoderm）が認められないことで判断される未受精卵は廃棄してください。

適切な保護メガネを着用した状態で、26.5ゲージの皮下注射針の基部から45度の角度に曲げます。曲げた針の針先（ベベル）を上に向けた状態で1 mLシリンジに取り付け、希釈したインディアインクを満たします。ブラスターの外周にある卵黄膜を穿刺し、針先を胚の下、卵黄の表面近くまで滑り込ませます。この際、胚の層に入らないように注意してください。

次に、気泡が入らないように注意しながら、胚の輪郭をなぞるのに十分な量のインクを注入します。針を慎重に抜いてください。ここで、実体顕微鏡と、ここに示す光ファイバーグースネックランプのような熱負荷の低い光源を使用します。

Hamburger-Hamilton法に従って胚のステージを判定します。卵殻にステージを記録してください。その後、脱水と汚染を防ぐため、胚の表面に温めた滅菌リンガー液を2〜3滴滴下します。

次に、パラフィルムを卵の表面に伸ばして貼り、窓を一時的に封鎖します。続いて、移植のためのウズラの卵の準備を行います。卵をインキュベーターから取り出す前に、ペトリ皿にリンガー液を満たしておきます。

次に、湾曲ピンセットを用いて卵の鈍端側を開き、胚を露出させます。解剖用ハサミを使用し、胚の外側にある絨毛膜と胚盤外胚葉を正方形に4箇所切開し、すべての切り口が接するようにします。その後、湾曲アイリスピンセットで切開端の1箇所をそっと掴み、胚を卵から取り出して、準備しておいたペトリ皿に移します。

最後に、5番鉗子を用いて卵黄膜を慎重に除去し、解剖顕微鏡下で胚のステージ判定を行います。ホストとなる鶏胚からパラフィルムを取り除きます。次に、研磨したタングステン針を使用し、神経管の目的領域にある卵黄膜に小さな穴を開けます。

胚にリンガー液を1滴加えます。次に、このビデオで実施しているような片側移植の場合、火工針を用いて、神経管の中脳領域に、管腔を超えないように注意しながら、吻側および尾側の横切開を慎重に行います。その後、神経管の背側と側板中胚葉の間を両側から切断します。

最後に、切り出したX外植片を神経管から慎重に分離し、ガラスマイクロピペットで吸引して胚から取り出します。まず、ステージが一致するウズラ胚を用意します。次に、先ほど示したのと同サイズの神経管領域を切り出し、ドナーのX外植片をリンガー液の入ったガラスマイクロピペットで吸引します。

X explanをニワトリホストの切除領域の隣に移動させます。次に、引き伸ばしたガラス針を用いて、ex explanを慎重に誘導し、切除領域に配置します。脱水を防ぐため、胚にリンゲル液を数滴注意深く加えます。

最後に、パッキングテープで窓を密封し、窓を開けた卵の領域全体が確実に密閉されていることを確認します。その後、目的のステージに達するまで卵をインキュベーターに戻します。キイラ（kyira）を培養する間はロッキング機能をオフにし、生存率を高めるために1日2回、手でゆっくりと卵を回転させてください。発生のより後半のステージを対象とする場合、HH 11まで6時間再培養した後の神経管移植部位の代表的な画像に、移植されたウズラドナー組織がホストであるニワトリの神経管に組み込まれた様子が示されています。HH 11における移植部位のこの横断面では、hnkで標識された神経堤細胞が示されており、そのうちの1つが神経管から外側へと遊走しています。

神経堤細胞の遊走流および神経管に寄与しているウズラ細胞が、QCPNによって明確に標識されています。後の段階では、ウズラ神経堤細胞由来の細胞を最終的な標的組織まで追跡することが可能です。この図に見られるように、QCPN標識細胞は、胚齢5日（E5）のニワトリ胚の上顎突起の間質内に散在しています。QCPN抗体は、他の抗体と容易に組み合わせて使用できるため、ウズラ由来神経堤細胞の分化を解析することができます。

宿主環境内での様子です。ここに見られるように、ウズラの神経堤細胞由来の三叉神経感覚ニューロンが、QCPNおよびT UJ one抗体によって標識されています。この手順に続き、免疫組織化学染色やin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を用いることで、神経堤細胞がどのような組織に分化するのか、また、さまざまな組織へと分化する過程でどのような遺伝子を発現するのかといった、さらなる疑問に対する解析を行うことが可能です。