クロス種の移植による神経堤の移行および分化の解析

本手順の目的は、神経堤細胞の移動と運命を追跡するため、段階を合わせたニワトリ胚にウズラ胚から採取した背側神経管外植片を移植することである。まず、ホストとなるニワトリ胚のIGN膜に小さな穴を開けて神経管にアクセスし、次にドナーとなるウズラ胚を卵から取り出して移植片の切り出し準備を行うことでこれを達成する。

次のステップでは、ホスト胚の神経管から関心領域を切り出します。同様に、グラフト用にドナー神経管からも同様の領域を切り出します。次に、ドナー神経管をホスト神経管に移植します。

最後に、キメラ胚を目的の段階まで培養し、選択した器官に到達した神経堤細胞を検出します。最終的に、ドナー由来の神経堤細胞がホスト胚のさまざまな部位に遊走し分化した様子を、免疫蛍光顕微鏡によって可視化できます。顕微鏡下での剥離および移植の手順には非常に繊細な動作スキルが必要であり、習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

まず、ぬるま湯で雛の卵に付着した汚れを洗い落とします。卵をトレイの上に水平に並べ、胚が位置する領域を示すために、上向きの側面に鉛筆で印を付けます。ドナー胚のX ovo調製を行う場合は、ウズラの脚側（鈍端）を下にして孵化させます。

次に、卵を38 °Cに設定した加湿インキュベーターに入れ、ロッキング機能をオンにします。インキュベーションが完了したら、卵の上面に70% ethanolをスプレーし、Kimwipeで素早く拭き取って滅菌します。卵殻からの吸収を防ぐため、滅菌後の卵をそれぞれ個別の卵ホルダーに置きます。ここでは、折りたたんだKimwipeを敷いたペトリ皿のようなホルダーを使用しています。その後、滅菌済みのAAピンセットを用いて、卵の尖端側の卵殻上面に小さな穴を開けます。

5 mLのシリンジに18.5Gの皮下注射針を取り付けます。次に、針の切端（ベベル）を卵の尖った側に向けて、卵殻の穴に垂直に挿入します。吸引によって誤って卵黄を損傷させないよう、前述と同様に穴を70% ethanolで清浄し、スコッチテープで穴を密封します。

次に、ダブルAピンセットを用いて、水平脚のマークした上面の、頂点から少しずれた位置に別の穴を開けます。次に、曲がったアイリスピンセットの片側を、卵と平行になるように穴に挿入します。その後、殻を挟み込みながら、円を描くように動かします。

鶏卵の殻に直径2 cmの窓を開け、取り除いた殻は廃棄します。胚は、卵黄の上に不透明な円盤状に見えるはずです。卵黄の表面に小さな白い点があるか、あるいは胚盤胞（ブラストデルム）が認められない不妊卵は廃棄してください。

適切な眼保護具を着用した状態で、26.5ゲージの皮下注射針の基部から45度の角度に曲げます。曲げた針の針先（ベベル）を上に向けて1 mLシリンジに取り付け、希釈したインディアインクを針に充填します。ブラスターの外周にある卵黄膜を穿刺し、針先を胚の下、卵黄の表面近くまで滑り込ませます。この際、胚の層に刺入しないように注意してください。

次に、気泡が入らないように注意しながら、胚の輪郭を縁取るのに十分な量のインクを注入します。慎ż重に針を抜いてください。ここで、実体顕微鏡と、ここに示されているファイバー光学グースネックランプのような熱負荷の少ない光源を使用します。

Hamburger-Hamilton法に従って胚のステージを判定します。卵殻にステージを記録してください。その後、脱水と汚染を防ぐため、温めた滅菌リンガー液を胚の表面に2〜3滴滴下します。

次に、パラフィルムを卵の表面に伸ばして張り、窓を一時的に密封します。続いて、ウズラの卵を移植するための準備を行います。卵をインキュベーターから取り出す前に、ペトリ皿にリンガー液を満たしておきます。

次に、曲がったピンセットを用いて卵の鈍端側を開き、胚を露出させます。解剖用はさみを使用し、胚の外側の絨毛膜と胚盤外内胚葉に、すべての切り口が接するように正方形の形で4箇所切開します。その後、曲がったアイリスピンセットで切開端の一方をそっと掴み、胚を卵から取り出して、準備しておいたペトリ皿に移します。

最後に、5番ピンセットで卵黄膜を慎重に取り除き、解剖顕微鏡下で胚のステージを判定します。ホストとなる鶏胚からパラフィルムを剥がします。次に、研磨したタングステン針を用いて、神経管の目的の領域にある卵黄膜に小さな穴を開けます。

胚にリンガー液を1滴加えます。次に、このビデオで行っているような片側移植の場合、引火ガラス針を用いて、神経管の中脳領域に、管腔を越えないように注意しながら吻側および尾側の横切開を入れます。その後、背側神経管と側板中胚葉の間を両側的に切断します。

最後に、切り出したX explanを神経管から慎重に分離し、ガラスマイクロピペットで吸引して胚から取り出します。まず、ステージを合わせたウズラ胚を用意します。次に、先ほど示したのと同様のサイズの神経管領域を切り出し、ドナーのX explanをリンガー液の入ったガラスマイクロピペットで吸引します。

X explanを、ニワトリ宿主の切除領域の隣に移動させます。次に、引き伸ばしたガラス針を用いて、ex explanを慎重に誘導し、切除領域内に配置します。胚の脱水を防ぐため、リンガー液を数滴注意深く加えます。

最後に、パッキングテープでウィンドウを密封します。この際、ウィンドウを設けた卵の領域全体が確実に密封されていることを確認してください。その後、目的のステージに達するまで卵をインキュベーターに戻します。カイラを培養している間はロッキング機能をオフにし、生存率を高めるために、1日2回、手でゆっくりと卵を回転させてください。発生の後期のステージを対象とする場合、HH 11まで6時間再培養した後の神経管移植部位の代表的な画像（図）では、移植されたウズラのドナー組織が宿主のニワトリ神経管に適切に組み込まれていることが示されています。HH 11における移植部位のこの横断面では、hnkでラベルされた神経堤細胞が示されており、そのうちの1つが神経管から外側へ遊走しています。

神経堤細胞の遊走流および神経管に寄与するウズラ細胞が、QCPNによって明確に標識されています。より後期の段階では、ウズラ神経堤細胞由来の細胞を最終的な標的組織まで追跡することが可能です。本図に見られるように、QCPN標識細胞は、胎齢5日のニワトリ胚の上顎突起の正中部に点在しています。QCPN抗体は他の抗体と容易に併用できるため、ウズラ由来神経堤細胞の分化を調べるのに有用です。

宿主環境内において。ここで示されているように、ウズラの神経堤細胞由来の三叉神経感覚ニューロンが、QCPNおよびT UJ one抗体によって標識されています。この手順に続いて、免疫組織化学やin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を用いることで、神経堤細胞がどのような組織へと分化するのか、また、様々な組織へと分化する過程で神経堤細胞がどのような遺伝子を発現するのかといった、さらなる疑問を検討することが可能です。