腫瘍の4DライブセルイメージングのためのMAMEモデル：微小環境の相互作用に影響を与える悪性進行

本手順の全体的な目的は、乳腺構築および微小環境工学（MAM）と呼ばれる3D共培養モデルを構築し、細胞間相互作用のリアルタイムライブセルイメージングに利用することです。これはまず、カバーガラスをフィブロネクチン消光（DQ）コラーゲンI、すなわちDQコラーゲンIマトリックスでコーティングすることで達成されます。

次に、DQクエンチコラーゲンIV（DQ quenched collagen IV）を準備します。凝固したDQコラーゲンIVの上に、再構成基底膜マトリックス（reconstituted basement membrane matrix）を添加し、線維芽細胞を埋め込んだコラーゲンIマトリックスを作成します。3番目のステップとして、上皮細胞または腫瘍細胞の懸濁液をカバースリップの上に層状に添加し、細胞をDQコラーゲンIVおよび再構成基底膜マトリックスに接着させた後、培地を添加します。

最後に、共焦点顕微鏡を用いて4Dイメージングを行い、生きた乳がん共培養系の3次元的な空間表現に時間軸を加えた解析を行います。最終的に、4Dイメージングによって、乳がん細胞と腫瘍微小環境内の他の細胞との動的な相互作用を可視化および解析することができ、これが浸潤性表現型への進行に及ぼす影響を検討することが可能になります。生体内イメージングなどの既存の手法に対する本手法の大きな利点は、観察対象となる相互作用が、例えばヒト腫瘍細胞とマウス基質細胞の間ではなく、ヒト腫瘍細胞とヒト腫瘍随伴細胞という同一種の間で生じている点にあります。

一般的に、この方法に不慣れな方は、メインコア培養物の組み立てをまず視覚的に理解し、その後、成功させるために中程度のスキルと練習が必要となるため、苦労することがあります。まず、アルコール滅菌した長方形のプラスチックカバーを1枚配置します。それを35 mm培養皿に滑り込ませるか、IBI tree社の35 mm mu皿を使用してください。

次に、所定数の線維芽細胞をDQコラーゲンと混合します。続いて、100 µLマイクロピペッターを用いて、線維芽細胞含有DQコラーゲン（1コラーゲン1マトリックス）70 µLをカバースリップの全表面に注意深く分注し、広げます。その後、培養皿を二酸化炭素を含まない37 °Cの加湿インキュベーター内に30分間置きます。マトリックスが凝固した後、5%二酸化炭素を含む37 °Cのインキュベーター内で10分間平衡化させます。

その後、室温に戻るまでディッシュをフード内に置きます。固まったDQ collagenの上に、60 µLのDQ collagen 4 reconstituted basement membrane matrix、および線維芽細胞を組み込んだcollagen 1 matrixを添加します。次に、ピペットチップを使用して、線維芽細胞を含むDQ collagen 1 collagen 1 matrixを傷つけないように注意しながら、DQ collagen 4 reconstituted basement membrane matrixを均一に広げます。

次に、皿とカバースリップを5%二酸化炭素を含む37 °Cのインキュベーターに10分間戻します。その間に、DQ collagen IV再構成基底膜マトリックスを凝固させ、トリプシン処理した眼細胞を回収し、共培養用の細胞数をカウントします。次に、50 µLの細胞懸濁液をコーティング済みカバースリップ上に滴下し、細胞をDQ collagen IV再構成基底膜マトリックスに接着させるため、皿を5%二酸化炭素を含む37 °Cのインキュベーターに40〜60分間置きます。細胞がマトリックスに接着した後、2%再構成基底膜を含む培養液2 mLを35 mm皿に加えます。

その後、PBSで洗浄した後、MEGM培地を用いて5 µMのCellTracker Orangeで、37 °C、5% CO₂インキュベーター内で45分間共培養物をインキュベートし、目的の期間までインキュベートしてからイメージングを行います。インキュベーション後、共培養物を再度PBSで洗浄し、あらかじめ温めておいたMEGM培地を用いて37 °C、5% CO₂インキュベーター内で30分間インキュベートします。共培養物を低倍率でライブイメージングします。例えば、共焦点顕微鏡の水浸対物レンズ（10x）を用い、構造全体の深さ方向にわたって10 µm間隔で光学切片をキャプチャします。

Velocityソフトウェアまたは同様のプログラムを用いて、光学切片から画像を3D再構成します。構造、細胞間相互作用、および周囲のマトリックスとの相互作用を可視化するために、3D再構成のムービーを作成してください。このメイン共培養の代表的な概略図では、IBI処理されたμ-dishをまずコラーゲンでコーティングし、一方はDQコラーゲンを含み、もう一方はここにマゼンタ色で示されているように線維芽細胞を含んでいます。

次に、DQ collagen fourを含む再構成基底膜の2層目を添加しました。続いて、赤色で示される腫瘍細胞を、2%の再構成基底膜の上に播種し、培養しました。

クリーム色の点で示される培地は、培地交換のたびに重ねられました。DQ collagen oneおよびfourの蛍光切断産物は緑色で示されています。この代表的なMCF 10 DCISとWS 12 TIの共培養の23日間において、本図および以降の図で赤色で示される細胞の増殖と、本図および以降の図で緑色で示されるDQ collagen fourおよびoneの分解が観察され、共培養物の体積減少によりコラーゲンマトリックスの分解が示されました。

同様の生細胞共培養を23日間にわたって観察し、共培養の3日目、16日目、および23日目に共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影しました。Mame共培養における相互作用はダイナミックであり、時間とともに変化します。例えば、共培養3日目の細胞mamのこの3Dモデルに見られるように、この時点では細胞がマトリックス内で増殖し始めたばかりであり、緑色の蛍光が見られないことから、まだ非常に安定していることがわかります。

しかし、16日目までになると、細胞の増殖が継続するにつれて、マトリックス構造の分解も始まります。ここでは、緑色で示されるDQコラーゲンの1番および4番の切断産物によってその様子が観察でき、マトリックスと細胞が黄色に共蛍光している箇所では、細胞によるマトリックスの能動的な分解が起きていることがわかります。23日目までには、急速に増殖する細胞によってマトリックスのほぼ半分が分解されました。共培養の体積が110,000 cubic micrometersであった3日目と比較すると、16日から23日目にかけて、体積はこの日でわずか46,250 cubic micrometersまで減少しています。

16 共培養において、赤色で示されるDCIS細胞の表面でのDQ collagen fourのタンパク質分解と、白色の線維芽細胞近傍の領域におけるDQ collagen oneの拡散的なタンパク質分解が観察されます。この共培養で用いられた分画染色により、分化後の2種類の細胞の明確な遊走および増殖パターンの観察も可能になります。この手法は、がん細胞と周囲のストローマ細胞との間の動的な相互作用をライブセルイメージングで捉えることで、乳がん分野の研究者が腫瘍のマクロ環境ががんの進行に及ぼす影響を探索する道を開きました。