個々の準備ショウジョウバエエッグチェンバース

次の実験の目的は、生きているショウジョウバエのUサイトにおける動的プロセスを記録することです。これは、最初に、十分に栄養を与えられた2日齢の雌のハエから無傷の卵巣を分離することによって達成されます。第2ステップとして、個々のアンテナを卵巣から抽出して、卵子室を画像化します。

次いで、それらが適切な蛍光タンパク質を発現する場合、個々の卵室を直接イメージングするか、またはイメージング前に蛍光マーカーのマイクロインジェクションなどのさらなる操作を受けてもよい。最終的には、動画のシーケンスを解析することで、細胞内成分のダイナミックな相互作用を明らかにすることができます。この方法は、RNA輸送と局在化翻訳の分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちました。

例えば、ボディプランを設定するタンパク質の発現は、生体監督において時間と空間でどのように制御されているのでしょうか?一般的に、この方法に不慣れな人は、かなりのスピードと器用さが必要なため、苦労します。どちらの練習もより良い結果が得られます。

卵室の操作はテキストを伝えるのが難しく、患者の技術的専門知識と確実な手が必要なため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることは非常に重要です。この手順は、カバースリップにハロカーボンオイルを少量垂らし、脇に置くことから始めます。次に、準備したハエに二酸化炭素を麻酔します。

鋭利な細い鼻の鉗子を使用して、腹部の前方にある太った雌のハエをつかみます。腹部の中央をつかまないでください。準備したカバースリップの約2〜3センチ上にメスを持ちます。

2対目の鉗子を使用して、女性の最後部にある組織を切除します。これには通常、きれいな鉗子を備えた腸組織が含まれます。チューブから歯磨き粉を絞るように、腹部を前端から後端まで優しくマッサージします。

卵巣は大きな不透明な構造のように見え、鉗子の端にくっつきます。スライド上のハローカーボンオイルに触れて卵巣を採取します。次に、4〜6個の卵巣が採取されるまでこのプロセスを繰り返します。

アンテナを分離する前に。顕微鏡の光源を調整して、照明が浅い角度でスライドに当たり、組織に対照的な影が生じるようにします。ハエを解剖するときは、適切なツールを使用することが非常に重要です。

私たちが使用するポインターは鋭すぎて組織に損傷を与えることはありませんが、使用するピンセットをキャプチャできるようにかなり鈍いです。繰り返しになりますが、鋭すぎて組織を傷つけるのではなく、ツールを曲げずに物を操作できるほどの細さです。また、清潔なツールを持つことも非常に重要であるため、閉じた鉗子を使用して、手順全体を通して定期的にツールを清掃します。

後端の接続組織を取り除いて、2つの卵巣を分離します。後端には最も成熟した卵室があります。卵巣を水平に向け、最も若い卵室を利き手に向けてください。

次に、残りの結合組織で後端をそっとつかみ、解剖プロまたはタングステン針を使用して個々の空中を引き出します ジャマールステージからステージ10までの個々の卵室は互いに分離しますが、古い卵室は卵巣に付着したままになります。プローブを使用して、15〜25個の分離されたアンテナをオイルドロップの中心に慎重にドラッグします。複数の卵巣を解剖する必要がある場合は、別のハエから1つを選択します。

余分な卵巣組織を捨て、ストレスによる細胞表現型の変化を示し始めるため、迅速に作業します。卵巣から解剖されてから40分後、オイルから余分な卵巣組織を取り除きます 中期細胞の注入のための清潔な器具を使用して、カバースリップの長軸に対してアンテナを垂直に向けます。後期卵室を分離するため。

卵巣の後部を掴むには、前述のように別の方法が必要です。解剖プローブを鉗子の近くの卵巣の後端に導入します。卵室に穴を開けないように、後期の間にプローブを挿入しますtage卵室。

解剖針を卵巣に通して、初期段階の卵室から出るまで引っ張ります。正しく行われると、プローブはアンテナと後期卵室を所定の位置に保持している結合組織を取り除きます。アンテナがカバースリップに広がるまで、この手順を繰り返します。

卵室が互いに積み重ならなくなったら、この手順は完了です。解剖プローブを使用して、後期卵室を分離し、ステージ14の位置へのイメージングを容易にします。首のチャンバーは、鉗子を使用して背側の付属物をつかみます。

注入する溶液を、Muttを高速で短時間遠心分離して調製します。これにより、注入針を塞ぐ可能性のある固体堆積物がペレット化されます。その後、注入針にローディングチップを装填し、装填した注入ニードルをインジェクターに慎重に取り付けます。

次に、サンプルに隣接する小さなガラス片を置き、スライドを顕微鏡ステージに取り付けます。ガラスは、壊れたり、壊れたりするための壁として機能します。針を抜きます。

実験用の顕微鏡と注射装置を準備します。針先が折れないように注意してください。可能であれば、ポイントビジット機能を備えた自動ステージを使用して、注入用のすべてのステージ 8 とステージ 9 のサイトをマークします。

次に、注入針をオイルに触れるまで下げます。マークされたポイントリストの最初のポイントを選択し、サイトに焦点を合わせます。針が細胞と同じ焦点面になるまで手動で針を下げます。

マニピュレーターコントロールを使用して、注射針の先端をUサイトの内側まで動かします。速い突き刺す動きは、遅い動きよりも成功することがよくあります。中に入ったら、針から少量を排出し、効果を視覚的に評価します。

繰り返しが必要です。注入が成功すると、細胞内の細胞質が変位します。注入された液体の正確な量を定量することは困難です。

注入量を増やすには、注入パルスの圧力または持続時間を調整します。針先を折って針の開口部をわずかに広げるか、単に複数の注入パルスを使用してから次のマークを選択します。サイト。注入針が他の細胞にぶつからないように、オイル内で十分に高く上げます。

針が細胞内に広範囲に刺さったり、長引いたりすると、卵室に深刻な損傷を与えます。だから、急いでください。注射は10秒未満で完了します。

間違えた場合は、次のマークに移動します。視力に損傷を与えるのに時間を無駄にしないでください。針が詰まったら、針を割れたガラス片に動かします。

ガラスと針を同じ焦点面に置き、針をガラスにそっと突き刺します。注射ボタンを押して針の詰まりが解消されていることをテストし、針の先端から液体が出るかどうかを確認します。すべての米国部位を注入したら、針をオイルの外側に手動で移動させ、顕微鏡のビーム経路の外側に向けます。

目の損傷を避けるために安全な向きにあることを確認し、ライトを消灯してください。蛍光イメージングの速度を向上させるためには、急務です。卵室単離と細胞注入の間に1時間以上経過すると、細胞は注入が困難になり、ストレスに関連する表現型の変化を示します。

同様の問題は、細胞の乱暴な取り扱いや過剰な量の注入でも発生する可能性があります。トレンチジェニック蛍光タンパク質を発現する卵室は、注射を必要とせずにイメージングできます。内在性RNAのMS 2標識は、in vitroで合成した完全な手順を使用した組織単離手順を使用して良好な結果でイメージングできます。

Alexaは、546キン、RNAをME31BGFP卵室に注入し、RNAを細胞の背側前方に局在させ、核の周りにキャップを形成していったんマスターする。この技術は、解剖の時間からイメージングの開始まで約10分で行うことができますこの手順を試みながら、迅速かつ慎重に作業することにより、組織の世話をします。このビデオを見た後、生きているショウジョウバエの細胞の動的プロセスを記録する方法をよく理解しているはずです。