個々の準備ショウジョウバエエッグチェンバース

本実験の目的は、生存しているショウジョウバエのUサイトにおける動的なプロセスを記録することである。まず、十分に給餌した2日齢の雌から無傷の卵巣を単離する。次に、卵室をイメージングするために、卵巣から個々の卵管を抽出する。

その後、適切な蛍光タンパク質が発現していれば、個々の卵室を直接イメージングするか、あるいはイメージング前に蛍光マーカーをマイクロインジェクションするなどのさらなる操作を行うことができます。最終的に、一連の動画解析を通じて、細胞内成分のダイナミックな相互作用を明らかにすることが可能です。この手法は、RNA輸送および局所翻訳の分野におけるいくつかの重要な疑問を解決するのに役立ちました。

例えば、生体内で個体のボディプランを構築するタンパク質の発現は、時間的および空間的にどのように調節されているのでしょうか。一般的に、この手法に不慣れな方は、かなりのスピードと器用さが求められるため、習得に苦労するでしょう。十分な練習を積むことで、より良い結果が得られます。

卵室の操作は文章で伝えることが困難であり、また忍耐強い技術的習熟と確実な手つきが必要とされるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。まず、カバーガラスの上にハロカーボンオイルを少量滴下し、脇に置いておきます。次に、準備したショウジョウバエを二酸化炭素で麻酔します。

鋭い微小ピンセットを使用し、腹部前方で太った雌 flies を把持します。腹部の中央を把持しないでください。準備したカバーガラスの約 2～3 cm 上方で雌 flies を保持します。

2組目のピンセットを使用して、雌の最後端にある組織を除去します。この際、通常は腸管組織も含まれますので、清潔なピンセットを用いてください。チューブから歯磨き粉を押し出すように、腹部を前方から後方に向かって優しくマッサージします。

卵巣は大きな不透明な構造体として観察され、ピンセットの先端に付着します。卵巣に触れてスライド上のハロカーボンオイルに転写することで回収します。この操作を繰り返し、4〜6個の卵巣を回収してください。

空中器官を分離する前に、顕微鏡の光源を調整し、照明がスライドに浅い角度で当たり、組織にコントラストのある影ができるようにします。ハエを解剖する際は、適切な器具を使用することが非常に重要です。

使用するポインターは、組織を傷つけないよう鋭すぎず、かつピンセットをしっかりと掴める程度の適度な鈍さを持つものを使用します。同様に、ピンセットも組織を損傷させないよう鋭すぎないものを選びますが、器具を曲げることなく操作ができる程度の適度な鋭さを備えている必要があります。また、器具を清潔に保つことが非常に重要であるため、処置の間、閉じた鉗子を用いて定期的に清掃を行います。

後端にある結合組織を除去し、2つの卵巣を分離します。後端には最も成熟した卵室があります。最も若い卵室が利き手側に来るように、卵巣を水平に配置します。

次に、残っている結合組織で後端をそっと掴み、解剖針またはタングステン針を使用して、個々の卵室を慎重に取り出します。Stage 0からStage 10の卵室は互いに分離しますが、より成熟した卵室は卵巣に付着したままになります。プローブを用いて、分離した卵室を15から25個、オイルドロップの中心まで慎重に移動させます。複数の卵巣を解剖する必要がある場合は、別の個体から1つ選択してください。

余分な卵巣組織は廃棄し、ストレスによる細胞の表現型変化が始まるため、迅速に作業してください。卵巣から切り出してから40分後、オイルから余分な卵巣組織を取り除きます。中期卵母細胞の注入には清潔な器具を使用し、カバースリップの長軸に対して垂直に配置します。後期卵室を単離します。

前述した卵巣後方の把持に伴い、異なる手法が必要となります。ピンセットの近くから卵巣の後端に解剖用プローブを挿入します。卵室を穿刺しないよう、後期の卵室の間にプローブを挿入してください。

解剖針を卵巣に通し、初期段階の卵室から出るまで引き抜きます。正しく行われれば、プローブによって、卵管と後期段階の卵室を固定している結合組織が取り除かれます。卵管がカバーガラス上に広がるまで、この手順を繰り返します。

卵室が互いに重なり合わなくなった時点で、この工程は完了です。解剖用プローブを用いて、後期段階の卵室を分離し、Stage 14を配置してイメージングしやすくします。頸部室については、ピンセットで背側付属器を把持してください。

注入用溶液を短時間高速遠心分離して準備します。これにより、注入針を詰まらせる可能性のある固形沈殿物をペレット化させます。次に、ローディングチップを用いて注入針に溶液を充填し、充填済みの注入針をインジェクターに慎重に取り付けます。

次に、サンプルの隣に小さなガラス片を配置し、スライドを顕微鏡ステージに固定します。このガラスは、遮断または解除するための壁として機能します。ニードルを外してください。

実験に使用する顕微鏡と注入装置を準備します。この際、針先を折らないように注意してください。可能であれば、ポイントビジティング機能を持つ自動ステージを使用し、注入対象となるすべてのステージ8およびステージ9の細胞にマークを付けてください。

次に、注入針をオイルに触れるまで下げます。マークされたポイントリストから最初のポイントを選択し、細胞にフォーカスを合わせます。細胞と同じ焦点面にくるまで、手動で針を下げてください。

マニピュレーターのコントロールを使用して、注入針の先端をU部位の内部まで移動させます。ゆっくりとした動作よりも、素早く突き刺す動作の方が成功しやすい傾向にあります。内部に入ったら、針から少量の液を注入し、その効果を視覚的に評価します。

繰り返し操作が必要です。注入が成功すると、細胞内の細胞質が置換されます。注入された液体の正確な量を定量化することは困難です。

注入量を増やすには、注入パルスの圧力または時間を調整します。針先の先端を折って針口をわずかに広げるか、次のMark.Cyteを選択する前に注入パルスを複数回繰り返します。注入針は、他のCyteにぶつからないよう、オイルの中で十分に高く上げてください。

針を細胞内に何度も刺したり、長時間留まらせたりすると、卵室に深刻なダメージを与えます。そのため、迅速に行ってください。注入時間は10秒未満にする必要があります。

ミスが発生した場合は、次のマークの部位に移動してください。損傷した部位に時間を費やさないでください。針が詰まった場合は、針をガラスの破片に移動させてください。

ガラスと針を同一焦点面に合わせ、針をゆっくりとガラスに突き刺します。注入ボタンを押し、針先から液体が出るかを確認して、針に詰まりがないことをテストしてください。すべてのUS部位への注入が完了したら、手動で針をオイルから出し、顕微鏡のビーム経路から外れるように配置します。

眼への損傷を避けるため、安全な方向に向いていることを確認し、消灯してください。蛍光イメージングを円滑に行うためには、速度が不可欠です。卵室の分離から細胞注入までに1時間以上経過すると、細胞の注入が困難になり、ストレスに関連した表現型の変化が現れます。

同様の問題は、細胞の粗雑な取り扱いや、過剰な量の注入によっても発生する可能性があります。trenchgenic蛍光タンパク質を発現している卵室は、注入を行うことなくイメージングが可能です。内因性RNAのMS2ラベル化は、in vitroで合成された完全な手順を用いた組織分離操作により、良好な結果でイメージングすることができます。

Alexa 546標識RNAをME 31 BGFP卵室に注入すると、RNAは細胞の背側前方に局在し、核の周囲にキャップ状の構造を形成しました。この手法を習得すれば、解剖からイメージング開始まで約10分で完了させることができます。この手順を行う際は、迅速かつ慎重に操作し、組織を丁寧に扱うよう注意してください。このビデオを視聴することで、生存しているショウジョウバエの細胞における動的なプロセスの記録方法について十分に理解できるはずです。