Name: 個々の準備ショウジョウバエエッグチェンバース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶショウジョウバエ卵巣の個別卵室を用いたmRNA局在化のライブイメージング手法。高速高分解能顕微鏡観察により、生体内での動的細胞プロセスとタンパク質発現の時空間制御を解明する。

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解剖のために前に1。 ショウジョウバエの準備（E. Gavis、プリンストン大学によると） <ol><li>まばらに播種したボトルから大人を破棄し、°C、実験に先立って25日にボトルを転送します。新成人が出現し始めていたら、二日待ってください。 </li><li>固形食品の約10ミリリットルを含むフライバイアルを取り出し、45度の角度に乾燥酵母の0.5〜0.7グラム（表を参照してください）​​を追加します。酵母でフライ食品の表面全体をカバーしていません。 </li><li>水和物（図1A）に十分な、酵母に数滴の水を追加します。 45度の角度でバイアルを配置して、酵母の約3分の水（図1B）を吸収することができます。 </li></ol>注：別の方法として、プレミックス別の容器に貼り付け、酵母やスパチュラでバイアルにペーストを追加します。 <ol start="4"><li> CO 2ガスを注入することにより、バイアル中にハエを麻酔。彼らは移動を停止すると、CO 2の上に無意識のハエを傾ける</sソートのためのUBは&gt;フライパッド（図1C）。 </li><li>微細な先端ペイントブラシ（図1D）と解剖範囲で10から15人の女性と、目的の遺伝子型の男性5名を分離します。男性は、その後部にclaspers、暗い突き出た構造の存在によって明らかである。 </li><li> yeastedバイアル（図1E）、選択したハエを追加します。 24から60時間25℃の場所。中間段階の卵室と後期の卵室のために長い期間に若いの大きいパーセントのために短い期間インキュベートします。 </li></ol> （2） ショウジョウバエの卵巣切開<ol><li>第1.5、22×50mmのカバースリップ（図2A）上にハロカーボンオイルの小滴を配置します。それが邪魔になりません側に準備されたカバースリップを設定します。 </li><li> CO 2パッドの上にCO 2ガス、チップを注入することによりyeasted下劣でハエを麻酔。 </li><li> （ない目の間に、個々の腹部の前で女​​性の肥育に把握する鋭い微鼻鉗子を使用します。eの腹部と胸郭）（図2B-C）。 </li><li>準備されたカバースリップ上に約2〜3センチメートル、解剖顕微鏡下でピンセットとビューでメスを保持します。 </li><li>まだ前方に保持し、女性の極端な後方（図2D）で組織を削除するには、鉗子の2番目のセットを使用しています。注：ガットの組織は、通常、後端に引き出します。ピンセットから採取した組織を拭いてください。 </li><li>それでも前で女性を保持したまま、静かに後方に向かって前方から作業、腹部を圧迫したり、マッサージに拭いて鉗子を使用しています。チューブの端から歯磨き粉を削除するのと同じ方法で腹部をマッサージ。 </li><li>二つの大きな不透明な構造体は、鉗子（図2E-F）の端に腹部とスティックからプッシュされます。これらはペアになって卵巣があります。 </li><li>下のスライド上でハロカーボンのオイルに卵巣をタッチします。 </li><li>カバースリップ（Figur上の油に4から6卵巣の合計を与えるために解剖を1-2回を繰り返します。電子2G）。 </li></ol> 3。の分離卵管注：各卵巣は、文字列10のビーズのように配置の異なる段階の6から10卵室で構成された約16卵管が含まれています。 注：前に卵管を分離するため、照明は、試料に浅い角度で当たるように解剖顕微鏡で光源を調整します。これは、サンプルにコントラストを与え、若い段階の卵室の可視化を可能にします。 <ol><li>油で、閉じた鉗子（図3A）と後端（旧ステージ）で接続組織を除去して、2つの卵巣を分離します。 </li><li>オリエント左から右へと最年少のステージへの最古の段階で個々の卵巣。卵巣の若い段階の卵室は透明であり、卵巣のより多くの先端を形成しています。 </li><li>利き手で鉗子のペアで、そっと目の残党、好ましくは卵巣の後部を把握する電子結合組織。鉗子の場所に卵巣を保持しながら、個々の卵管（図3B-D）引き出すために解剖プローブ（またはタングステン針）を使用します。 </li></ol>注意：古い段階が完全に卵巣から分離するには大きすぎるとして、個々の卵管が若い段階（ステージ10〜胚腺）の間に解除されます。 注：解剖プローブと後期の卵母細胞を穿刺すると、油中に漏れて細胞質になり、個々の卵管の抽出が非常に困難になります。後期段階の卵母細胞がパンクしている場合は、新鮮な卵巣に移動します。 <ol start="4"><li>卵巣管は卵巣の自由になると、実験のための所望の向きに油滴と東洋の中央にドラッグし解剖プローブを使用しています。注：油で卵管が安定し、ガラスに付着します。 </li><li> 15から25個卵管があるまで、このプロセス（3.3から3.4）を繰り返します。注：これはmultipの郭清が必要な場合がありますLEの卵巣。全体のプロセスは15分未満を取る必要があります。 </li></ol>注：これは、むしろ実験のためにハエのn個の数を増やすことが少なくハエから両側の卵巣を解剖よりも、いくつかのハエから一卵巣それぞれを詳細に分析することをお勧めします。 注：卵巣小管の乱暴に取り扱うと、不健康な卵母細胞になり、実験の成果物につながる可能性があります。 注：卵子は卵巣（Fを図7Eの比較）から解剖された後、40分を強調するため、表現型の変化を表示するために開始されます。 <ol start="6"><li>一度卵管に十分な方向（図3E）にある、油の過剰な卵巣組織を移動するために解剖プローブと閉じたピンセットを使用しています。この材料は、ペーパータオルの上にピンセットから一掃することができます。 </li></ol> 4。分離し、個々の後期卵室（E. Gavis、プリンストン大学によると） <ol><li> DOMINで鉗子のペアを持つアリの手は、好ましくは、結合組織の残党によって、孤立した卵巣の後部を把握する。鉗子の場所に卵巣を保持しながら、鉗子の近くに卵巣（図4A）の後端に解剖プローブをご紹介します。後期の卵室との間でプローブを挿入することによって、任意の卵室を穿刺は避けてください。 </li><li>初期段階の卵室（図4B）でそれが終了するまで卵巣を介して解剖針を引き抜きます。正しく行われた場合、プローブは、場所の卵管および後期段階の卵室を保持する結合組織を削除します。 </li><li>卵管は、カバースリップ上に広がっされるまで、ステップ4.2を繰り返します。注：卵室はもはや互いの上に積み重ねされていない、このステップは完了です。 </li><li>解剖プローブを使用して、簡単に画像（図4C）を可能にするために遅れて卵母細胞を分離します。 </li></ol>注：後期の卵室を解剖しながら卵をパンクチャリングは、iを解剖してのように非難するようではありません若いステージのndividual卵管。 注：ステージ14卵室では、オリエンテーションのための背の付属を把握するために鉗子を使用しています。 5。注射の準備注：中間段階の卵母細胞の注入は、東洋卵管垂直にカバースリップの長軸に。 <ol><li> [応用精密からDeltaVisionコア我々のケースで]イメージング顕微鏡をオンにし、適切な画像の設定（図5A-B）を読み込みます。 </li><li>噴射装置（図5C）をオンにします。 </li><li>ローディングチップ（図5D-E）で注射針をロードします。注入するソリューションは、注射針をブロックする可能性があり預金を避けるために高速で短時間遠心する必要があります。 </li><li>インジェクタにロードされた注射針を取り付けます。針（図5F）を壊してしまわないように注意してください。 </li><li> unclogging針を支援するために、カットや壊れたカバースリップからガラス×10 mmの小片を配置卵管を含む油滴のt一面。このガラスの断片が油で覆われていることを確認してください。このガラスは、RAMに針を壊したり、unclogging用に対して針の先端サービスを提供します。 </li></ol> 6。蛍光RNAの注入始める前に：噴射装置と注射針が視野の中心上に配置されるように、マイクロマニピュレータの制御を設定します。 <ol><li>顕微鏡ステージ上に注入されるサンプルをマウントします。 </li><li> 20倍の目標を選択します。より高いまたはより低い倍率の目標を使用することもできます。 </li></ol>注：ポイント訪問機能を備えた自動ステージを使用している場合は、注射のため8月9日卵開始する前に、すべてのステージをマークすることをお勧めします。これは、簡単に訪問し、選択した卵母細胞の注入を可能にします。 <ol start="3"><li>それは油に接触するまで注射針を下ろします。対物レンズの上にセンター針先。 </li><li>ターン部屋の照明を切り、顕微鏡の明視野光をオンにします。マークポイントリストの最初のポイント（卵）を選択します。接眼レンズをのぞきながら、卵母細胞（図6A）に焦点を当てています。 </li><li>それは卵母細胞と卵母細胞に見える次のように焦点の同一平面になるまで手動で針を下ろします。 </li><li>それは卵母細胞の内側になるまでマニピュレータコントロールを使用して、注射針のポイントを移動します。速い突き刺す動きがしばしば遅い、事前よりも成功しています。中に入ると、針から小さなボリュームを取り出して、視覚的効果を評価し、必要に応じて繰り返します。注入に成功した場合、これは繰り返し明らかでない場合は、卵母細胞内の細胞質は、避難されます。それは材料が注入されているかどうかを判断するために蛍光の画像にする必要はありません。注入後、卵母細胞（図6B-G）の内側から針を外します。 </li><li>注入された流体の正確な量は、定量することは困難である。注入量、adjuを増やすには噴射パルスの圧力や時間ST、繰り返し注入パルスをわずかに開口部を増やしたり、使用する針の先端を破る。 </li></ol>注：正しく実行したときに全体の注入プロセスは10秒未満を取る必要があります。刺すまたは卵母細胞への針の内部に残る大規模な卵室への深刻なダメージになります。 <ol start="8"><li>次の顕著な卵母細胞を選択する前に、旅行パスに他の卵母細胞に接触しないように油に十分な注射針は、高上げる。 </li><li>新しい卵母細胞では、手順6.6を繰り返します。必要なすべての卵母細胞が注入されるまで、このように上に運ぶ。 </li></ol>注：注入しながらミスが行われた場合は、次のマークされた卵母細胞に移動します。破損した卵母細胞に時間を無駄にしないでください。 注意：針は注射セッション中に目詰まりがあります。このケースでは、カバースリップ上に油でガラスの破片に隣接して針を移動します。ウィットHと同じ焦点面のガラスと針が、ゆっくりガラス（図6H）に針をRAM。針を注入ボタンを押すと任意の流体終了した場合、針の先端を見てuncloggedされていることをテストします。 <ol start="10"><li>すべての卵母細胞が注入された場合は、手動で顕微鏡のビーム経路の油と向き、それをうち、針を上に移動します。それは眼の損傷を防ぐため、安全な方向にあることを確認します。 </li></ol>注：時間の延長期間は卵室の分離と卵母細胞の注入の間で経過した場合は、卵母細胞がストレスに関連付けられた表現型の変化を注入し、示すことが困難になります。同様の問題は卵母細胞または過剰量の注入（図は6Iを比較して、J、K）の乱暴な取り扱いで発生する可能性があります。 7。イメージング実験デザインを生きる<ol><li>リストから最初の注入された卵母細胞を選択します。注射は蛍光イメージング1フレーム（で卵母細胞の中にあったかどうかをテストします図6GのS）。 </li><li>励起波長、放出経路、励起時間は、Z-スタックとコレクション間の時間を含む：実験的なパラメータを設定します。注：この方法の詳細については、パートンR.らを参照してください。 （2010年）2。 </li><li>データセットを収集します。 </li></ol> 8。代表的な結果 in vitroで合成されたアレクサ-546 GRK RNAはMe31B :: GFP卵室（図7A）に注入した。 RNAは卵母細胞の背側前方に局在し、核の周りにキャップ（図7B）を形成する。 RNAの局在化の例についてはマクドゥーガルN.らを参照してください。 （2003）11。 蛍光標識タンパク質（タウ-GFP、図7C）またはRNAタギングシステム（GRK * mCherry、図7D）を発現半ばおよび後期段階の卵母細胞を注入することなく撮像することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> 図1。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> 図2。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> 図3。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> 図4。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> 図5。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> 図6。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> 図7。

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

<html>ライブセルイメージングは​​、リアルタイムで細胞プロセスを調べるための強力なアッセイである。単純な明視野観察に加えて、興味のあるタンパク質とRNAの蛍光標識の添加は、多くのブレークスルーをリードしている。ここでは、遺伝的および生化学的アッセイと組み合わせて利用することができる画像個々の生きている卵母細胞のプロトコルを概説しています。 このプロトコルでは、我々はまた、実験的に注射することによって生きている卵母細胞を操作する方法について説明します。アッセイに直接RNAの局在化（ボールとデイビス、未発表）および蛋白質6の機能を阻害する抗体に二次構造の能力を蛍光標識したRNAを合成し、in vitroでを含む材料を注入するための多くの可能性があります。今後はおそらく他の標識成分との分子メカニズムをテストすることが可能になり生きている卵母細胞への細胞機械の導入が表示されます。 t &quot;は&gt;生きている細胞で作業する場合、組織の生存と健康が不可欠です。保存このプロトコルでは、我々は卵室のストレスにつながることができますステップの数を指摘している。たとえば、オイルがイメージングのための優れているにもかかわらず、油の拡張文化が卵室にストレスにつながることができます。これは簡単に核の形態と位置を調べることによって、明るい界曝露下で監視することができ、ストレスの下で歪曲水疱ます。卵母細胞膜は、（Figure7Fに（ストレスのない）図7Eの比較（ ））を強調した。ステージ9卵室は、複数の時間にわたってRNAの局在化と境界細胞の移動12を示しています。ただし、ステージ7月8日卵室が卵巣の約40分から削除された後のハロカーボンオイルに悪影響を示すことが開始されます女性の後期段階の卵室、ステージ11から14は、ため、これらのステージ13で卵胞細胞から卵の殻の分泌油または水性媒体のいずれかで正常に開発することができます。これはレポされている水性昆虫培地にインスリンの添加は、最大で6時間14 germariaまでの14時間〜15のためにステージ9卵母細胞を維持することができますrted。それは卵母細胞を強調し、その可能性を低減し、すべてのケースでは、卵室の積極的な操縦は、避けるべきである。イメージング卵室が少ないと治療に注意しながらそれぞれが穏やかに最適な可能性を確保するための最良の方法です。

解剖に使用されるツールは、きれいになる必要がありますが、オートクレーブ滅菌する必要はありません。 EtOHでツールを拭いて、それらを開始する前に乾燥させます。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ファイン先端ペイントブラシ （アーティストセーブル、ラウンド、サイズ00または0） </td><td>ほとんどの画材店から入手</td><td></td><td>質の良いブラシが重要である</td></tr><tr><td>ハロカーボン製品株式会社は、シリーズ95 </td><td>ハロカーボン製品株式会社は、887 Kinderkamack道路、河川エッジNJ 07661 </td><td></td><td>ヨーロッパの代理店： Solvadis（社） 油を介して空気をバブリングすることにより酸素を送り込むにしてください。 </td></tr><tr><td>スリップカバーなし。 50ミリメートル1.5、22× </td><td>国際No1の-VWR猫= 631から0137-22〜50ミリメートル</td><td>メンツェル·グレイザー-22-40mmでMNJ 400-070T </td><td></td></tr><tr><td>デュモン5番 - Dumostar </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11253から20 </td><td> &quot;Biologie&quot;チップも良いですが、より多くの脆弱な</td></tr><tr><td>解剖プローブ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10140から01 </td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> CO2パッド</td><td>を通じて利用可能 <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / （ジェネシー·サイエンティフィック社の一部門） </td><td> 59から114 （789060 Dutscher） </td><td>ヨーロッパの代理店： <a href="http://www.dutscherscientific.com">WWW。dutscherscientific。com</a> / それはあなた自身のフライパッドをカスタムを構築することも比較的容易である</td></tr><tr><td> KimCare </td><td> KimberyクラークKimCare - 医療ワイプ</td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡-DeltaVision </td><td>アプライドプレシジョン</td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td>マニピュレーター</td><td>バーレイマイクロマニピュレーター ルーメンダイナミクスグループ株式会社から。 2260 Argentiaロード、ミシソーガ、オンタリオ州、L5N 6H7カナダ</td><td>バーレイPCS-5000シリーズ、TS-5000から300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> /（旧EXFO） </td></tr><tr><td>噴射装置</td><td> Tritechリサーチ株式会社 2961ベテランアベニュー ロサンゼルス、CA 90064 </td><td> MINJ-1 </td><td>エッペンドルフFemptotipsを取るホルダーを使用して変更</td></tr><tr><td>注射針</td><td>エッペンドルフ滅菌Femtotips IおよびII </td><td> 930000043 </td><td>別のヒントが別のアプリケーション用に優れている</td></tr><tr><td>ヒント20μLをロードする</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td>乾燥したアクティブな酵母</td><td>フライシュマンの酵母</td><td> ＃2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

個々の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>エッグチェンバース

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

ライブセルイメージングは、このような軸仕様、細胞分化と器官形成1などのトピックを調べるためにモデルとして使用されるショウジョウバエの多くの組織に適用される重要なテクニックです。実験試料の正しい準備は非常に重要、しばしば無視され、ステップです。準備の目標は、生理学的な妥当性を確保するために、最適な撮影条件を確立することです。組織の生存を維持するためには、脱水、低酸素症、発熱、または媒体の劣化2を避けることが重要です。 ショウジョウバエの卵室は、体のパターニング、mRNAの局在と細胞骨格の組織3,4から、限られた関連はなく、疑問を調べるための十分に確立されシステムです。初期および中期段階の卵室では、ハロカーボンのオイルでマウントすると、それは酸素の自由な拡散を可能にすることで生存のために良いですが、脱水と低酸素症を防ぎ、顕微鏡検査のために優れた光学特性を持っています。イム蛍光タンパク質の老化と卵室または5月7日標識RNA、タンパク質または抗体の物理的な注入に導入遺伝子の導入によって可能性があります。たとえば、動物のゲノムにMS2の構造の追加は、卵母細胞8のmRNAのリアルタイム観測を可能にします。これらの構造は、コートタンパク質9 MS2バクテリオファージRNAステムループの相互作用を活用したmRNAのin vivo標識を可能にします。 ここでは、雌のショウジョウバエから個々の卵管と卵室を分離するだけでなく、卵巣の抽出のためのプロトコルを提示します。 ショウジョウバエの卵形成の詳細な説明については、アランC. Spradling（2009年再版1993年）10を参照してください。

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵室は、mRNAの局在化のメカニズムを研究するための優れたモデルです。ローカライズのプロセスを支える動的なイベントをキャプチャするために、生きている組織の急速な高分解能のイメージングが必要となります。ここでは、最小限の中断でライブサンプルの解離およびイメージングのためのプロトコルを提示します。

ライブセルイメージングは、軸決定などのテーマを研究するためのモデルとして用いられる、多くのショウジョウバエ組織に適用される重要な技術です。

本実験の目的は、生きたショウジョウバエのUサイトにおける動的プロセスを記録することです。まず、十分に給餌した2日齢の雌から完全な卵巣を単離します。次に、卵室をイメージングするために、卵巣から個々の卵管を抽出します。その後、適切な蛍光タンパク質が発現していれば、個々の卵室を直接イメージングするか、あるいはイメージング前に蛍光マーカーを微量注入するなどのさらなる操作を行うことができます。最終的に、動画シーケンスの解析を通じて、細胞内コンポーネントの動的な相互作用を明らかにすることが可能です。この手法は、RNA輸送および局在翻訳の分野におけるいくつかの重要な疑問を解決するのに役立ってきました。例えば、生体内でボディプランを構築するタンパク質の発現は、時間的・空間的にどのように制御されているのでしょうか。一般的に、この手法に不慣れな方は、かなりの速度と器用さが要求されるため、習得に苦労すると思われます。十分な練習を積むことで、より良い結果が得られます。卵室の操作はテキストで伝えることが困難であり、また、忍耐強い技術的習熟と確実な手さばきが必要であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。まず、カバーガラス上にハロカーボンオイルを少量滴下し、脇に置いておきます。次に、準備したショウジョウバエを二酸化炭素で麻酔させます。先の鋭い精密ピンセットを使用し、腹部前方で太った雌のハエを掴みます。腹部の中央を掴まないようにしてください。雌のハエを、準備したカバーガラスから約2〜3 cm上の高さで保持します。2組目のピンセットを使用して、雌の最後端にある組織を取り除きます。通常、これには腸組織が含まれますので、清潔なピンセットを用いてください。歯磨き粉をチューブから出すように、腹部を前方から後方に向かって緩やかにマッサージします。卵巣は大きな不透明な構造体として見え、鉗子の先端に付着します。卵巣に触れてスライド上のHaloカーボンオイルに転写し、回収してください。その後、4〜6個の卵巣が集まるまでこの操作を繰り返します。空中器官を分離する前に、顕微鏡の光源を調整し、照明がスライドに浅い角度で当たり、組織にコントラストのある影ができるようにします。ショウジョウバエを解剖する際は、適切な器具を使用することが非常に重要です。使用するポインターは、組織を傷つけないよう鋭すぎない一方で、ピンセットを確実に保持できる程度の適度な鈍さを持たせています。同様に、ピンセットも組織を損傷させないよう鋭すぎないようにしますが、器具を曲げることなく操作できる十分な精度は確保しています。また、器具を清潔に保つことが非常に重要であるため、処置の間、閉じた鉗子を用いて定期的に器具を洗浄します。後端の結合組織を取り除き、2つの卵巣を分離します。後端には最も成熟した卵室があります。卵巣を水平に配置し、最も若い卵室が利き手側にくるように向けます。次に、残っている結合組織を持って後端をそっと掴み、解剖針またはタングステン針を使用して、個々の卵室を丁寧に分離します。ジャマー期からステージ10までの個々の卵室は互いに分離しますが、より成熟した卵室は卵巣に付着したままになります。プローブを用いて、分離した15〜25個の卵室を慎重にオイルドロップの中央まで移動させます。複数の卵巣を解剖する必要がある場合は、別の個体から1つ選択してください。余分な卵巣組織は廃棄し、細胞がストレスによる表現型の変化を示し始めるため、迅速に作業してください。卵巣から解剖して40分後、オイルから余分な卵巣組織を取り除きます。中期の卵母細胞を注入するために、清潔な器具を用いて、カバーガラスの長軸に対して垂直に方向を合わせます。後期の卵室を単離するために。前述のように卵巣の後端を把持した場合とは異なる方法が必要です。解剖用プローブを、鉗子の近くの卵巣後端に挿入します。卵室を穿刺しないよう、成熟段階にある卵室の間にプローブを挿入してください。解剖針を卵巣の中へ通し、初期段階の卵室から出るまで引っぱります。正しく行われれば、プローブによって、卵管と後期段階の卵室を固定している結合組織が取り除かれます。卵管がカバーガラス上で広がるまで、この操作を繰り返します。卵室が重なり合わなくなった時点で、このステップは完了です。解剖用プローブを使用して、後期段階の卵室を分離し、ステージ14を配置してイメージングしやすくします。ネックチャンバーについては、ピンセットを用いて背側付属肢を把持してください。注入用溶液を高速で短時間遠心分離し、準備します。これにより、注入針を閉塞させる可能性のある固形沈殿物をペレット化します。次に、ローディングチップを用いて注入針に溶液を充填し、充填済みの注入針をインジェクターに慎重に取り付けます。次に、サンプルの隣に小さなガラス片を配置し、スライドを顕微鏡ステージに固定します。このガラスは、壁として機能し、遮断または解除するために使用します。ニードルを外してください。顕微鏡と注入装置を準備します。この際、針先を破損させないように注意してください。可能であれば、ポイントビジティング機能を備えた電動ステージを使用して、注入対象となるステージ8およびステージ9の細胞すべてにマークを付けてください。次に、注入針をオイルに触れるまで下げます。マークされたポイントリストから最初のポイントを選択し、細胞に焦点を合わせます。細胞と同じ焦点平面にくるまで、手動で針を下げてください。マニピュレーターのコントローラーを使用して、注入針の先端をU部位の内部に移動させます。ゆっくりと刺すよりも、素早く刺す動作の方が成功しやすい場合が多いです。内部に入ったら、針から少量の液を注入し、その効果を視覚的に確認します。繰り返し操作が必要です。注入が成功すると、細胞内の細胞質が押し出されます。注入された液体の正確な量を定量することは困難です。注入量を増やすには、注入パルスの圧力または時間を調整してください。また、ニードルの先端を折ることで開口部をわずかに広げるか、次の mark.Cyte を選択する前に、注入パルスを複数回適用してください。注入用ニードルは、他の cyte にぶつからないよう、オイルの中で十分に高く上げてください。針を細胞内に何度も刺したり、長時間留めたりすると、卵室に深刻なダメージを与えます。そのため、迅速に行なってください。注入は10秒以内に完了させる必要があります。操作に誤りがあった場合は、次の標的部位へ移動してください。損傷した部位に時間を費やさないようにします。針が詰まった場合は、針をガラスの破片の方へ移動させてください。ガラスと針を同一の焦点面に合わせ、針をゆっくりとガラスに刺入します。注入ボタンを押し、針先から液体が出るかを確認して、針に詰まりがないことをテストしてください。すべてのUS部位への注入が完了したら、手動で針をオイルから出し、顕微鏡のビームパスの外に配置します。眼への損傷を避けるため、安全な向きに配置されていることを確認し、消灯してください。蛍光イメージングを効率的に行うには、速度が不可欠です。卵室の単離から細胞注入までに1時間以上経過すると、細胞の注入が困難になり、ストレスに関連した表現型の変化が現れます。同様の問題は、細胞の粗い取り扱いや過剰な量の注入によっても発生する可能性があります。trenchgenic蛍光タンパク質を発現している卵室は、注入を行うことなくイメージングが可能です。内因性RNAのMS2標識は、in vitroで合成された完全な手順を用いた組織分離の手順を用いることで、良好な結果でイメージングできます。Alexa 546ラベル付きRNAをME 31 BGFP卵室に注入したところ、RNAは細胞の背側前方に局在し、核の周囲にキャップ状の構造を形成しました。この手法に習熟すれば、解剖からイメージング開始まで約10分で完了させることができます。この手順を行う際は、迅速かつ慎重に操作し、組織を傷つけないよう注意してください。このビデオを視聴することで、生存しているショウジョウバエの細胞におけるダイナミックなプロセスの記録方法について十分に理解できるはずです。

preparing-individual-drosophila-egg-chambers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を作製する、シンプルで安価な、そして効果的な方法が提示される。我々のプロトコルは、湿度およびガス交換を提供し、ショウジョウバエの胚を圧縮しません。このメソッドは、実体顕微鏡や正立複合顕微鏡を用いてショウジョウバエの胚のGFPベースのライブイメージングに適しています。...

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ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

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このプロトコルで説明されている直立イメージング法は、発育中のDrosophila melanogasterの卵の極の詳細な視覚化を可能にします。...

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ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

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ライブイメージングを用いたショウジョウバエ卵チャンバに対する酸化損傷の効果の可視化

ショウジョウバエでは、卵母細胞核は卵発生時に微小管依存性の移動を受ける。ここでは、卵室ex-vivoでライブイメージングを行うことで、移行に追随するために開発されたプロトコルについて説明します。私たちの手順は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してマルチポジション3Dタイムラプス映画を取得するために12時間生きている卵室を維持します。...

ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動

ここでは、ショウジョウバエの卵巣ニッチにおける生殖幹細胞(GSC)の非対称分裂のライブイメージングを行うための詳細なプロトコルを提供します。私たちは、スペクトロソームタンパク質Par-1の緑色蛍光タンパク質(GFP)融合を遍在的に発現するトランスジェニックラインを使用しています。...

雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング

学ぶショウジョウバエ卵巣の個別卵室を用いたmRNA局在化のライブイメージング手法。高速高分解能顕微鏡観察により、生体内での動的細胞プロセスとタンパク質発現の時空間制御を解明する。

個々の準備ショウジョウバエエッグチェンバース

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