Name: ハイブリダイゼーションその場で唾液腺、卵巣、および媒介蚊の胚の (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶその場でハイブリダイゼーション法を用いて、媒介蚊の唾液腺、卵巣、胚における特定の転写産物の局在と蓄積パターンを可視化する手法です。遺伝子発現の空間的調節を理解する上で有用です。

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著者らは、その後にハイブリダイゼーションのためにここで記述されたプロトコルを開発するために適応し、変更された、 ハマダラカの胚の in situ ハイブリダイゼーションのためのプロトコルの議論のための軟組織とユーリGoltsevその場の方法でハイブリダイゼーションの開発に助言をマリカ·ウォルターズに感謝したいと思いますヒトスジシマカとアカイエカの胚の in situ。我々はまた、アダム·パレとDavid K​​osmanによって与えられた有用な提言を認める。我々は科学的な議論とプロトコルのテキストを編集するためのオズワルドMarinottiに感謝します。

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</ol>

著者らは開示しません。

全体のマウント蚊組織および胚のためにここで紹介する場と比色染色プロトコールでのハイブリダイゼーションは、特定の臓器や細胞型内転写産物の局在のために有用な技術である。これらの手順は、私たちの以前に報告された方法に比べて、両方の広範な洗浄工程の合理化と技術的な詳細および試薬ソースを提供することで改善されています。 我々の経験では、ハイブリダイゼーションシグナルの比色検出は、蛍光ベースの検出方式に比べてハイブリダイゼーションシグナルの感度と透明性に優れています。また、比色検出は、本質的に自動蛍光性である胚の信号差別に関連する問題を回避します。低濃度の転写産物をターゲットにされている場合ハイブリダイゼーションシグナルを検出するのに制限が発生し、バックグラウンド染色は明白である。 65ハイブリダイゼーション温度を上昇させる°Cは、バック減らすことが見出されているグラウンドハイブリダイゼーションシグナルが、固有のターゲットに特異的なRNAプローブを設計するための提案代わるものではありません。 このプロトコルは、全マウント唾液ネッタイシマカの腺、卵巣、 ハマダラカ、ハマダラカ、AEの胚の in situ ハイブリダイゼーションを行うために使用されています。ネッタイシマカとネッタイイエカ 。また、このメソッドは、他の蚊の組織に適用されると、おそらく他の昆虫のものです。さらに、我々は3つのベクトル蚊、 ヒトスジシマカにおける胚発生のステージングのための最初の時間の比較のガイドラインについては、コンパイルされます。ネッタイシマカ、。ハマダラカとCx。 fatigans。観測は控えめな飼育条件下では、これら3種の特定の株が報告されている。開発時間のコースは蚊種の異なる株のために、異なる飼育条件下で異なることに注意することが重要です。 ANAへの努力継続的にその場サプリメントでハイブリダイゼーション蚊やその他の節足動物のトランスクリプトームをlyze、これらの生物における遺伝子発現の調節の良い画像を提供することがあります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> Ambionの</td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1MのTris-HCl </td><td> Ambionの</td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10×PBS </td><td> Ambionの</td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambionの</td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5mlマイクロチューブ</td><td> Ambionの</td><td> AM12400 </td><td>可視化サンプル中のエイズ、標準のチューブよりも小さい不透明な</td></tr><tr><td>脱イオン化ホルムアミド</td><td> Ambionの</td><td> AM9342 </td><td> 4°Cでの保存</td></tr><tr><td> DEPC水</td><td> Ambionの</td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td> Ambionの</td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5.25％次亜塩素酸ナトリウム</td><td>オースティンの</td><td></td><td> A-1ブランド</td></tr><tr><td> T3 RNAポリメラーゼプラス</td><td> Ambionの</td><td> AM2733 </td><td> -20°Cでの貯蔵</td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td> Ambionの</td><td> AM2082 </td><td> -20°Cでの貯蔵</td></tr><tr><td> 95％エタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand使い捨てポリエチレン転送ピペット</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37％ホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLCグレードのメタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-542A </td><td> 18×18ミリメートル</td></tr><tr><td> n-ヘプタン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-キシレン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td>パイレックス9ウェルスポットプレート</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13-748B </td><td> 100x85ミリメートル</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost /プラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75X1.0ミリメートル</td></tr><tr><td> Davlynレッドクリアライナーかつらテープ</td><td>直接髪</td><td> RED-75R12 </td><td>ポリ/ X 12ヤードテープロールのスキン基材0.75 </td></tr><tr><td>ワントップ10化学的にコンピテントE.とSequeningためのTOPOTAクローニングキット大腸菌 </td><td>インビトロジェン</td><td> K457501 K457540 </td><td> 20反応 40反応</td></tr><tr><td>超音波処理サケ精子DNA </td><td>インビトロジェン</td><td> 15632-011 </td><td> -20°Cでの貯蔵</td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-AP、Fabフラグメント</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 1093274 </td><td> 4°Cでの保存</td></tr><tr><td> DIG RNAラベリングミックス</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 1277073 </td><td> -20°Cでの貯蔵</td></tr><tr><td> NBT / BCIPストック溶液</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 1681451 </td><td> 4°Cでの保存</td></tr><tr><td>西部のブロッキング試薬</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11921673001 </td><td> 4°Cでの保存</td></tr><tr><td> Saatileneハイテックポリエステルメッシュ（330.130） </td><td> Saatiプリント</td><td> 330.34 UO PW </td><td> 330スレッド/インチ、34ミクロンのネジ径、オレンジ色</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td> G6279-1 </td><td> PBTの70％ </td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20を</td><td>シグマ</td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37％ホルムアルデヒド</td><td>テッド·ペラ</td><td> 18508 </td><td>琥珀色のアンプルに10 mlのアリコート</td></tr><tr><td> 16オンス蓋つきのソロ紙容器</td><td>ペーパーカンパニー</td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスscintillatアタッチされていないスクリューキャップ付きバイアルイオン</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 66022-128 </td><td> 500の20ミリリットルの場合</td></tr><tr><td>シールドエアーバブルラップcelluar緩衝材</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 500018-081 </td><td> 10フィート/ロール0.188インチの厚さ</td></tr><tr><td>鶏血清</td><td></td><td></td><td>全血は、どちらの翼静脈から、または幼若鶏から心臓穿刺により採取した。血液が凝固して、30分間氷上に置いたまでは1時間37℃でインキュベートした。血清を10分間3000×gで収集し、遠心分離した。得られた上清（明らかに血清）を使用するまで-20℃で収集し、格納されていました。 </td></tr></tbody></table> 表4。in situでのハイブリダイゼーションの特異的試薬および機器の表。

ハイブリダイゼーション<em&gt;その場で</em&gt;唾液腺、卵巣、および媒介蚊の胚の

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

蚊はアルボウイルス、原虫や線虫を含む病原体の多様なセットのベクトルです。蚊の宿主と病原体相互作用の組織で発現し、臓器に繁殖に関与している転写産物や遺伝子レギュレータの調査では、戦略は蚊が媒介する病気の感染を減らすと卵の開発を混乱させるための大きな関心である。ツールの数は、遺伝子発現の時間的および組織特異的調節を研究し、検証するために用いられてきた。ここでは、特定の遺伝子が発現し、それらの製品が蓄積されている場所の我々の理解を高め、空間情報を取得するために開発されているプロトコルについて説明します。記述されているプロトコルは、再され、式を検証し、そのような女性の唾液腺と同様に、卵巣および胚の細胞内コンパートメントなど蚊が媒介する病原体の伝播に関連した組織では転写産物の蓄積パターンを決定するために使用されています蚊の再生と発展に遅い。 次の手順では、ターゲット固有のハイブリダイゼーションシグナルを失わずにプロトコルのさまざまなステップの効率を向上させる最適化された方法論を表しています。 RNAプローブの調製のためのガイドライン、軟組織と固定とハイブリダイゼーションのための一般的な手順の解剖は、蚊の胚の収集、固定、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションのための具体的な手順は、パートBに記載されていながら、パートで説明されています

時間的·空間的遺伝子発現解析は、ゲノム機能解析において重要な役割を持っています。ホールマウントハイブリダイゼーション<em&gt;その場で</em&gt;組織や細胞内コンパートメント内での転写産物の局在を決定するために有用である。ここでは、ハイブリダイゼーションを概説<em&gt;その場で</em蚊の特定の標的組織のために修正を加えた&gt;プロトコル。

蚊は、アルボウイルス、原生動物寄生虫、線虫を含む多様な病原体の媒介動物である。転写物および遺伝子の調査により...

本実験の全体的な目的は、蚊の組織および胚内における特定の転写物の局在と蓄積パターンを決定するために、in situ ハイブリダイゼーションを行うことです。まず、組織の超微形態と標的mRNAを保持し、アンチセンスRNAプローブとのハイブリダイゼーションを可能にするために、蚊の組織または胚を固定します。次に、固定した組織または胚内の標的転写物にアンチセンスRNAプローブをハイブリダイズさせます。次に、標的mRNAの局在と蓄積パターンを検出するために、コラーゲン計量抗体染色法を実施します。C2におけるハイブリダイゼーションと比色検出法に基づいたRNA蓄積の空間的パターンの結果が得られます。この手法は、蚊のどの部位で、いつ遺伝子産物が蓄積するかといった、機能ゲノミクス分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手順により、空間的な局在情報を得ることができ、生殖の発達や蚊と病原体の相互作用などの生物学的プロセスにおいて、遺伝子発現がどのように調節されているかをより深く理解することが可能になります。digoxigenin標識RNAプローブを蚊の組織にハイブリダイゼーションさせる準備として、まず卵巣と唾液腺を摘出します。その後、組織を固定し、必要に応じてプロテイナーゼKで処理します。組織の後固定後、ハイブリダイゼーション溶液PBTまたはHIB PBTの1:1混合液1 mLに入れ、30分間静置して平衡化させます。組織が沈降するまで待ち、次に可能な限り多くのHIB PBTをデカンテーションで取り除きます。その後、各サンプルチューブにHIBを1 mL加えます。サンプルチューブを気泡緩衝材などの密閉された空気保護包装で包み、ハイブリダイゼーションボトルの中に入れます。ハイブリダイゼーションボトルキャップでボトルを密閉し、55 °Cで30分間、回転させながらインキュベートします。インキュベーターからボトルを取り出し、組織を静置させた後、サンプルの紛失を防ぐため、チューブ内に50 µLの溶液を残して、プレハイブリダイゼーションバッファーを慎重にデカントします。次に、同じサンプルに50 µLのPrewarm high bufferを加え、55 °Cに設定したヒートブロックに置きます。あらかじめ調製したRNAプローブを85 °Cで5分間変性させます。その後、すぐに氷上に5分間置きます。次に、RNAプローブをサンプルチューブにピペッティングします。RNAプローブはHI溶液の上に浮いて表面に現れます。チューブを軽く叩いて混ぜ合わせます。ハイブリダイゼーションオーブン内の固定マイクロ遠心機用ラックにサンプルをセットし、55 °Cで16〜24時間、静かにインキュベートします。その後、記載のプロトコルに従い、RNA処理および抗体染色を行います。まず、200 µL ピペットチップを使用して、組織サンプルを Pyrex スポットプレートの個別の丸底ウェルに転送し、マウントします。PBT を可能な限り除去し、サンプルを 70% glycerol in water で覆います。4 °C で一晩おき、グリセロールをサンプルに浸透させます。顕微鏡スライドを準備します。まず、キムワイプでスライド表面をきれいに拭き取ります。次に、アーティストブラシを用いて、不可視テープを2本平行に貼り、狭いチャネルを形成します。サンプルを一つずつ取り出し、チャネルに沿って配置します。この際、各サンプルの前後の向きおよび背腹の方向を揃えて配置してください。各サンプルの配置後、キムワイプの綿棒を使用して、組織周囲の余分なグリセロール溶液を吸収します。カバーガラスでスライド上のマウント済みサンプルを封入する際に気泡が形成されるのを防ぐため、余分なグリセロールを除去することが重要です。整列させたサンプルを含むチャネルの上に、注意深くカバーガラスを配置します。透明のマニキュアを用い、四隅を点置きしてカバーガラスをスライドに半永久的に固定します。200 µLピペッターを使用して、70% glycerolをチャネルの一端からゆっくりと注入し、チャネル内とカバーガラス下の領域を完全に満たして永久的に封入します。カバースリップの四辺にネイルポリッシュを塗布し、封入したサンプルを密封します。サンプルをイメージングする前に、ネイルポリッシュを十分に乾燥させてください。交尾させた300匹の成雌蚊のケージから胚を回収し、目的の段階まで発育させた後、回収容器から80個の胚が入ったタイレンメッシュ装飾付きキャッチチューブに転移させます。キャッチチューブを、チューブの体積の半分まで満たされる十分な量の蒸留水が入ったビーカーに入れます。画筆を使用して、タイレンメッシュから胚を剥がし、水が入ったキャッチチューブに移します。胚が非常に多い場合は、回収容器からタイレンメッシュを取り外し、メッシュを慎重に折り畳んで漏斗状にし、そのメッシュ漏斗を片手で保持します。もう一方の手で漏斗の側面に沿って水を噴射し、胚をキャッチチューブへと洗い流します。この手法は、正常な胚の表面に存在する、卵を上の基質に付着させる粘着物質を欠いているため、異常胚に対しても適用可能です。40 millilitersの脱鞘溶液を調製し、その溶液を100 millimeterのペトリ皿に注ぎます。100 mLのビーカーに50 mLの蒸留水を加え、置いておきます。次に、胚を脱色素溶液が入ったペトリ皿に移します。使い捨てのポリエチレン製転送ピペットを用いて胚を洗浄し、その際、胚が脱色素溶液に浸ったまま攪拌されるように回収バイアルを回転させます。脱殻はプロトコルのなかで最も繊細な工程の一つであり、8細胞期胚に対して次亜塩素酸ナトリウム処理を長く行いすぎると、適切な内殻（endo corion）の露出が妨げられます。8細胞期胚には最大35秒、16細胞期胚には75秒の処理で十分です。低倍率の実体顕微鏡下で脱殻の状態を確認してください。8細胞期胚では網目状の外殻（exo corion）が消失し、16細胞期胚では滑らかで光沢のある黒い内殻の表面のみが観察されます。胚がコーティングされると、外絨毛の浮遊構造および隆起構造は消失します。記載されたプロトコルの手順に従い、内絨毛の固定および破壊を行ってください。破壊した内絨毛を剥離させるために、大口径の200 µL ピペットチップを使用して、3 cmのペトリ皿の中央に両面付け毛用テープを配置します。胚をメタノールから両面テープ上へ移します。胚がテープ表面に沈降し、付着するまで1〜2分間待ち、余分なメタノールをデカンテーションで除いた後、表面を1〜2分間わずかに乾燥させます。次に、胚をテープ上にさらに固定するため、ペトリ皿に95% ethanolを加え、600 µLの蒸留水をエタノール中にピペットで加え、回転させて混ぜ合わせます。次に、1 mLシリンジに装着した27.5ゲージの針を用いて、破裂した卵膜（endo corion）を剥がします。極細の筆を用いて、黒色の卵膜の残渣から白色の胚を分離させた後、速やかに胚をテープからペトリ皿のエタノールリザーバーへ移します。続いて、3 mmピペットチップを用いて、胚を500 µLの100%Ethanolを含む1.5 mLマイクロチューブに移します。最後に、胚を100%Ethanolで2〜3回洗浄し、-20 °Cで100%Ethanol中に保存します。この図のC2では、メスの Aedes aegypti の全量唾液腺を、amylase 1D seven S two および D seven L two を標的とするmRNAプローブでハイブリダイゼーションさせており、これらの転写物がそれぞれ近位外側葉、遠位外側葉、および遠位外側内側葉に蓄積していることが示されています。この実験では、3種の蚊の全量組織を、それぞれの同種 Oscar 転写物を特異的に標的とするmRNAプローブでハイブリダイゼーションさせました。ここでは、Anopheles gambiae、Aedes aegypti、および Culex quinquefasciatus の全量胚を用いて、それぞれの蚊の Oscar 同種転写物を標的とするアンチセンスRNAプローブによるC2ハイブリダイゼーションを行いました。このビデオを視聴することで、特定の蚊の組織または胚における転写物の局在と蓄積を決定するための、in situ ハイブリダイゼーション実験の実施方法について十分に理解することができます。

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