Name: マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶマウス脳の長期イメージング手法。頭蓋骨を薄く研磨しシアノアクリレート接着剤とカバーガラスで補強することで、炎症を起こさずに250μmの深さまで血管や神経細胞を観察可能。神経科学研究に有用です。

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この作品は、アメリカ心臓協会（AYSのポスドクフェローシップ）と国立衛生研究所（MH085499、EB003832、とOD006831 DKまで）によってサポートされていました。私たちは、原稿上でコメントをベス·フリードマンとパブロ·ブラインダーに感謝します。

1。手術の準備I <ol><li>超音波洗浄器でMaxizymeと外科ミルクの混合物に超音波処理により手術器具をきれいにします。各実験前に、手術器具をオートクレーブします。 </li><li>必要なすべての試薬と消耗品が使用可能であることを確認してください。試薬や消耗品のリストを表2に記載されています。曝露された組織に接触した試薬および消耗品は、可能な場合は、無菌でなければなりません。 </li><li>麻酔を誘導する。生存の研究に適した典型的な麻酔薬は、表1に記載されています。つま先ピンチ反射の欠如を確認することにより麻酔の外科的平面を確認してください。マウスの最適な年齢は3から6週間です。若いマウスの頭蓋骨は柔らかく薄いのが難しくなります。古いマウスは、間伐手順の間をもっと出血する厚い頭蓋骨を持っています。 </li><li>定位フレーム1に動物を保護します。手術用機器のリストは、表2に記載されています。 </li><li>ボディ温度を維持する37トゥーレ°Cのフィードバック調節直腸プローブと熱パッドを使用します。 </li><li>水分を保持するために目に眼軟膏を適用します。 </li><li>小型電気カミソリで頭皮を剃る。 </li><li> 70％（v / v）のイソプロピルアルコールで拭き取り、続いBetadineと頭皮をきれいにします。 </li><li>必要に応じて、心臓や呼吸速度がパルスオキシメータを使用して正常範囲内にあることを確認してください。マウスでは、これらの数字は、それぞれ約10センターと2 Hzのはずです。 </li><li> 37°C（125 mMのNaCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、3.1 mMのCaCl 2を 、1.3 mMのMgCl 2、pH7.4）中（Sigma社からのすべての化学物質）に滅菌濾過し、人工脳脊髄液（ACSF）のアリコートを温める2。 </li></ol> 2。ヘッドフレームの取り付け<ol><li>ピンセットと手術用ハサミで全体の背側頭蓋骨表面に頭皮を削除します。頭蓋骨の両側の側頭筋のエッジとポストに横方向に皮膚をトリミングする首の筋肉（ 図1A）にerior。 </li><li>頭蓋骨の表面から薄い骨膜を削除するには、外科用メスの刃を使用しています。 </li><li>湿った綿で頭蓋骨をきれいにアプリケーターをひっくり返しやほこりができからの空気の流れと頭蓋骨の表面を乾燥させます。その後、全体の頭蓋骨の表面にシアノアクリレート接着剤の薄い層を適用します。接着剤が完全に乾燥することができます。接着剤のこの層は、以降の手順では歯科用セメントの適切​​な遵守に必要とされています。シアノアクリレート系接着剤は滅菌する必要はありません。 </li><li>離れて目的のウィンドウの領域から、頭蓋骨の表面に金属製のコネクタに取り付けます。麻酔の準備のために、小さなナットは、後でボルトを用いた撮像セットアップ（ 図1B、1Lと1N）にねじ込むこともできシアノアクリレート接着剤のDABと頭蓋骨に固定することができます。接着剤が頭蓋骨に添付中のスレッドに入らないことを確認するためにテープでナットの裏面をシールします。ナットやテープは、滅菌すべきである<html>手術前にオートクレーブによって。 </li><li>目を覚ましイメージングの製剤は、2つのアタッチメントポイント（ 図1Mおよび1N）とより厳格なカスタムコネクタを接続します。 ½ミリメートルドリルバリと反対側の半球皮質上の頭蓋骨の2つの穴をドリルし、2つの＃000のセルフタッピングネジをご紹介します。これらのネジは頭蓋骨にヘッドマウントを固定するのに役立ちます。基本的な皮質に圧力をかけないようにするために、ネジの唯一つの完全なターンを適用します。その後、小脳上のシアノアクリレート系接着剤の小さなDABとカスタム金属製のクロスバーを取り付けます。シアノアクリレート系接着剤が完全に乾燥することができます。この金属製のコネクタは非常に自由度を減らし、長期的な研究でも同じイメージング分野の再配置を簡素化します。ワイドクロスバーは、電極の配置と鼻毛の刺激のための十分な余地を与えます。カスタムヘッドマウントおよび添付ファイルのデバイスを生成するための詳細な計画は、オンラインで入手できます（SICS / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html）。ネジとクロスバーは、手術前にオートクレーブで滅菌する必要があります。 </li><li>歯科用セメントの層（ 図1C及び1D）で、ウィンドウの位置を除いて、全体の頭蓋骨の表面をカバーしています。肌の露出エッジはセメントで覆われていることを確認してください。歯科用セメントの成分は、滅菌する必要はありません。 </li></ol> 3。ポリッシュの発生と間伐 - 頭蓋骨（ポート）ウィンドウを強化<ol><li>ドリルのバリがシャープであることを確認し、それらを再利用することは避けてください。 ½ミリメートルバリと体性感覚皮質上に2mmの地域別に歯科用ドリルで低速を使用して、薄い2mmである。 ACSFで頭蓋骨を湿潤し、ガスダスターからの空気の穏やかな流れと頭蓋骨の表面を乾燥させるとの間の代替、冷却のためのウェットと、間引きのために乾燥した。これは出血することが頭蓋骨の海綿層を介して間伐が必要ですが、細かく制御することができますACSF（ 図1E）で洗浄によってED。頭蓋骨は、〜50μmであるときに、ドリルのわずかな圧力の下でフレックスを開始し、軟膜血管が濡れた骨（ 図1F）を介して表示されるはずです。この厚さで、骨の中の小さな白い斑点は、乾燥頭蓋骨の表面は湿らされた直後に数秒間表示されるようになります。 </li><li>この時点で、骨の薄い、さらに。わずかなタッチで頭蓋骨の表面を削る低速ドリルの速度、すなわち、1000 rpmを使用しています。ペンのようなドリルを保持しながら、小さな制御された動きを使用してのみ横方向に力を適用します。骨は、その最終的な厚さ（ 図1G）で10から15ミクロン〜ザなければなりません。乾燥頭蓋骨表面を湿らされたときに骨が十分に薄い場合には、骨に小さな白い斑点が見えなくなりません。 </li><li>酸化スズ粉末とウィンドウ領域を磨く。シリコン水族館シーラントやと浸しました既製ドリルビットを取り付けますテーパー鞭（ 挿入図、図1H）を残して、描画されます。シリコンホイップは、少なくとも一日手術前に準備し、使用する前にイソプロパノール70％滅菌する必要があります。 ACSFの低下（ 図1H）と一緒にウィンドウ上に粉体の小さなピンチを配置します。そっと頭蓋骨表面への移動鞭の先端に触れることによって、最大10分のためにウィンドウの上にスラリーを攪拌してください。 ACSFを使用して、ウィンドウから徹底的に酸化スズ粉末を洗い流すと空気の穏やかな流れで徹底的に骨を乾燥させます。前の手順で掘削によって残された表面の凹凸や接着性の骨チップは研磨（ 図1Hおよび1I）の後に削除する必要があります。酸化スズ粉末を滅菌する必要はありません。 </li><li>なしの正方形の部分を切り取ります。 0はウィンドウのサイズよりもわずかに小さいガラスをカバーしています。穏やかにストレートエッジを使用してカバースリップで区切られた水平線と垂直線を獲得するためにスクライブを使用しています。その後シャーレとKNにカバースリップを置きガラス片を分離するためにテーブルの端に皿をOCK。全体のペトリ皿は、その後無菌性を確保するためにオートクレーブ処理することができます。 </li><li>適切なサイズのカバーガラス近くの乾燥したウィンドウを配置します。壊れた木製の綿棒の先端を使用してウィンドウ上にシアノアクリレート接着剤の小さなDABを適用し、すぐに接着剤の上のカバーガラスのプレカットピースを押してください。カバーガラスの下に気泡を作成することは避けてください。静かに、頭蓋骨の表面に対してカバーガラスを押し、数秒（ 図1Jと1O）に保持します。接着剤は15分以上かけて徹底的に乾燥させます。それが乾燥された後に過剰なシアノアクリレート接着剤は、手術用メスの刃とカバーガラスの上面から削除することができます。歯科用セメントでカバーガラスの端を密封して形成してわずかに浸漬レンズ（ 図1Kおよび1O）の水を保持するためにも提起した。 </li></ol> 4。回復<ol><li>手術後の暖かいケージに動物を配置します。モニターそれは完全に麻酔から回復するまで定期的に動物。 </li><li>準備は1日以上生存することを意図されている場合は、鎮痛のためにブプレノルフィンを（gの齧歯類0.03μg）を提供しています。一般的に我々のイメージは、少なくとも一日、最初の移植後の動物。 </li></ol> 5。イメージングの準備<ol><li>ヘッドサポート（ 図1Lと1M）などのフレームを使用して、イメージングのための光学ブレッドボード上で動物を安定させます。拘束装置はQioptiqまたはThorLabsから市販されているオプトメカニカルコンポーネントから行うことができます。私たちの独立したプレートは、動物と一つのユニット3のように組み立てられたすべての生理学的モニタリングデバイスと外科と2光子イメージングスイート間で転送することができます。 </li><li>血流イメージングが必要な場合は、5％の0.05 mLの（w / v）の蛍光デキストラン色素が血液血清（ 図2Aおよび2C 2Hにラベルを付けるためにどちらかの尾静脈または眼窩静脈を通して滅菌生理食塩水に溶解して注入する</strong&gt;）4-7。これは全身麻酔下で行わなければなりません。デキストランのソリューションは、より粘性であるため眼窩静脈投与は、初心者のためのより簡単であるかもしれません。尾静脈は暗く着色されたマウスでは見つけるのが難しくなることができ、静脈注射が失敗した後に崩壊する傾向があります。緑色発光のイメージング血管系については、フルオレセインイソチオシアネートデキストランを使用しています。赤色発光については、テキサスレッドデキストランを使用しています。高分子量のデキストランを使用すると、色素は数時間の循環のままになります。また、内因性の蛍光標識を有する動物は、適切な二光子励起波長で直接撮像することができます。デキストラン溶液は、将来の使用のために分注して凍結することができます。 </li><li>優しく湿った綿の先端アプリケータとウィンドウの表面を清掃してください。 </li><li>麻酔の準備の長時間イメージングのための、体液やエネルギーの要件を維持するためにグラム当たり3μLの容量で2時間ごとに無菌の乳酸リンゲル液の腹腔内に注入します。&lt;/ LI&gt; <li>ときに覚醒状態のイメージングの動物は、ストレスレベルを低減するために、一度に少数の時間にヘッドレストを制限します。食糧と水のイメージングセッション間でのホームケージに動物を返します。 </li></ol> 6。代表的な結果成功したウィンドウには、数ヶ月のために軟膜表面下250μmで、イメージングの深さを設定できるようになります。このメソッドは、 生体内毛細血管の血流4、8、ミクログリアの活性化8、9、皮質実質8内の樹枝状構造で勉強するために使用されています。一例では、我々は血清がテキサスレッドデキストラン（ 図2A）の静脈内注射によって標識された後、麻酔THY1-黄色蛍光タンパク質（YFP）マウスの脳血管系を表示するために2光子イメージングを使用しています。硬膜の血管はやや硬膜（ 図2C、矢印 ）で皮質表面上に頻繁に表示されます。大軟膜細動脈と細静脈のLi皮質表面上の電子（図2D）。彼らは皮質組織を供給する緻密な毛細血管床（ 図2Eに2H）に分派する皮質にこの表面のネットワークとダイビングから貫通血管の分岐。皮質ニューロンを表現する深いYFP、このマウスラインへの信号の内因性の樹状アーバーは、第2のチャネル10（ 図2B 2Hまで ）で同時に撮像することができます。骨の第二高調波信号は、3番目のチャネルで収集され、画像スタックのコレクション（2Cに図2A）の後に薄く頭蓋骨の厚さを測定するために使用することができます。 皮質の血管の動態は、深く麻酔11の影響を受けています。二番目の例では、我々は慣れた目を覚まし、マウスから2光子顕微鏡によって収集された自発的vasoactivityのビデオが表示されます。内腔の直径の著名な血管の振動が軟膜細動脈ではなく、隣接する静脈と見られている。このvasoactivityの基底範囲は、ウレタン麻酔4に減少しています。血流の自然および誘発変化を定量化するために、我々は個々の血管の血管径と赤血球速度の両方をキャプチャするように適応ラインスキャン技術を使用しています。二光子顕微鏡を用いて定量的な血流イメージングに関する詳細なリソースは、12 3ご利用いただけます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> 図1。 Portsウィンドウの手順。 Portsウィンドウを生成するための手順で操作手順の（Kの）画像。詳細な手順については、テキストを参照してください。 β=ブレグマとλ=λ。麻酔の準備の撮像中に頭部を保護するための（L）ボルトとナットシステム。 （M）カスタム覚醒準備のためのクロスバーヘッドマウントを加工。この例では、コネクタがまた繰り返される脳波の記録に移植した。 （N）回路図は、さまざまなコンポーネントのヘッドマウントおよび位置の背ビューを示している。パネルLで使用されているナットがパネルM.で使用してクロスバーに代わるものとして意図され二つの＃000セルフタッピングネジが目を覚ましイメージング製剤で追加された安定性のためのクロスバーマウントで追加されます。 Portsウィンドウの断面を示す（O）の模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> 図2。マウス皮質の血管系と神経構造の2つの光子イメージング 。すべての画像は、ウィンドウの移植10日以降2日目にTHY1-YFPマウスでPortsウィンドウを介して収集された。血管（A）と樹状突起（B）との関係で薄く頭蓋骨を示すコロナの方向で組織の150μmの上の最大投影。骨（青）900 nm励起で450nmの発光で、第二高調波蛍光を収集することによって検出された<sup&gt; 8。血管系（赤）は静脈内注射70kDaのテキサスレッドデキストラン6で標識した。ニューロンの樹状突起のフィールド（緑）THY1-YFPトランスジェニックマウスのラインへの内因性があります。 PIA以下の異なる深さで水平方向に組織を50μm以上（CH）が最大と予測。データは、パネルに示すように、同じ画像スタックからのものであり、B.硬膜の血管は（Cの矢印 ）だけ皮質表面上に見えるかもしれません。 略語 ACSF =人工脳脊髄液 ポート=洗練された補強薄く頭蓋骨のウィンドウ YFP =黄色蛍光タンパク質 私が説明する手順は、あなたのローカル動物実験によって承認されていることを確認し、委員会を使用してください。

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開示するものがありません。

Portsウィンドウを介して2つの光子イメージングは薄く骨を介して伝送し、レーザ光 ​​を減衰させ、より大きな深さ8で光学収差を追加する硬膜を必要とします。しかし、この欠点にもかかわらず、軟膜表面下250μmでのイメージングの深さまでは900 nmの励起を実現することができます。大きな画像の深さは、原則的に13より長い励起波長を持つことも可能です。この方法の主な利点は、完全な開頭術14、15を含む方法で一時的に存在するかもしれない皮質の炎症の欠如です。よく準備Portsウィンドウには、注入8次の血管新生や炎症のない明白な徴候を示すべきではありません。これは、イメージング血管構造による実験の過程で、またはCX（3）CR1-GFPマウス8行、16、17におけるミクログリアの形態変化を検出することにより、in vivoで評価することができる。さらに、 事後免疫組織ごとでなければなりませんグリア線維性酸性蛋白質8の抗体を用いて、例えば、表面の皮質におけるア...

<table border="1"><tbody><tr><td> エージェント </td><td> 配達の経路 </td><td> マウスの用量 </td><td> 持続 </td><td> 注釈 </td><td> ソース </td><td> refの文献 </td></tr><tr><td> ペントバルビタール（ネンブタール） </td><td> IP </td><td> 90μg/ gで</td><td> 15〜60分間</td><td>狭い安全マージン。徐々に麻酔の適切な用量まで動作します。必要に応じて誘導量の10％を補う。 </td><td> 036093;バトラーシャイン</td><td> 7 </td></tr><tr><td> キシラジンと混合したケタミン（Ketaset）（Anased） </td><td> IP </td><td> 60μg/ gで（K） 10μg/ gで（X）（同じ注射器でミックス） </td><td> 20〜30分</td><td>キシラジンは、筋弛緩剤と鎮痛剤としての共同注入されます。必要に応じて誘導量の50％のみケタミン補う。 </td><td> （K）010177、（X）033198;バトラーシャイン</td><td> 7 </td></tr><tr><td> イソフルラン（Isothesia） </td><td>吸入</td><td> 4％の誘導のための肺胞内濃度（MAC）を意味し、メンテナンスのために1から2パーセントMAC </td><td> 4〜6時間。 </td><td> 70％酸素と30％亜酸化窒素の混合物で提供される。長時間の麻酔は、回復を遅らせることにつながる。 </td><td> 029403;バトラーシャイン</td><td> 26 </td></tr></tbody></table> 表1。生存研究のために麻酔薬を示唆した。 <table border="1"><tbody><tr><td> ITEM </td><td> COMPANY </td><td><stroNG&gt;カタログ＃/ MODEL </td></tr><tr><td> Betadine </td><td>バトラーシャイン</td><td> 6906950 </td></tr><tr><td>ブプレノルフィン（Buprenex） </td><td>バトラーシャイン</td><td> 031919 </td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネートデキストラン、2 MDA分子量</td><td>シグマ</td><td> FD2000S </td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>フィッシャー</td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td>乳酸リンゲル液</td><td>バトラーシャイン</td><td> 009846; </td></tr><tr><td>リドカイン溶液、2％（v / v）の</td><td>バトラーシャイン</td><td> 002468 </td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>バトラーシャイン</td><td> 009861 </td></tr><tr><td>手術のミルク</td><td>バトラーシャイン</td><td&gt; 014325 </td></tr><tr><td>テキサスレッドデキストラン、70 kDaの分子量</td><td>インビトロジェン</td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td>バトラーシャイン</td><td> 035646 </td></tr><tr><td> 使い捨て </td></tr><tr><td>カーバイドバリ、1/2ミリメートルのチップサイズ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 19007から05 </td></tr><tr><td> Cottoned先端アプリケータ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td>いや、ガラスをカバーしています。 0厚さ</td><td>トーマス科学</td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td>シアノアクリレート系接着剤</td><td> ND産業</td><td> 31428 H04308 </td></tr><tr><td>ガスダスター</td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td>グリップセメント粉末</td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td>グリップセメント溶剤</td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td>インスリン注射器、29.5ゲージの針で0.3 mLの</td><td>バトラーシャイン</td><td> 018384 </td></tr><tr><td>頭を保護するためのナットとボルト</td><td>閲覧</td><td>ナット、H723-ND、ボルト、R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td>眼科軟膏</td><td>バトラーシャイン</td><td> 039886 </td></tr><tr><td>手術用メス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td>ねじ、セルフタッピング＃000 </td><td> JIモリス会社</td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td>シリコン水族館シーラント</td><td>パーフェクトマニュファクチャリング</td><td> 31001 </td></tr><tr><td>スズ酸化物粉末</td><td>ママの鉱物</td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> 装置 </td></tr><tr><td>ガラススクライブ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08から675 </td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td>電動ドリル</td><td> Foredomまたは長田</td><td> K.1020（Foredom）またはEXL-M40（長田） </td></tr><tr><td>電気かみそり</td><td>ウォール</td><td>シリーズ8900 </td></tr><tr><td>鉗子、デュモンありません。 55 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11255から20 </td></tr><tr><td>フィードバック安定化された熱パッド</td><td> FHC </td><td> 40-90-8（直腸サーミスタ、40から90-5D-02、H）パッド、40-90-2-07を食べる</td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td>パルス酸素濃度計</td><td>スターライフサイエンス</td><td> MouseOx </td></tr><tr><td>ミニチュア、ドライバー</td><td>ギャレット·ウェイド</td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td>定位フレーム</td><td> Kopfは楽器</td><td>モデル900（マウスの麻酔マスクと非破裂耳バー付き） </td></tr><tr><td>外科はさみ、平滑末端</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14078から10 </td></tr><tr><td>超音波洗浄器</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> 表2特定の試薬 ​​、消耗品や機器のリストです。

マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

皮質機能のin vivoイメージングでは頭蓋内環境を中断することなく、脳への光アクセスする必要があります。我々は、直径数ミリメートルにまたがって、数ヶ月安定であるマウスの頭蓋骨で洗練された補強薄く頭蓋骨（ポート）ウィンドウを形成する手法を提案する。頭蓋骨は、光学的透明性を達成するためにドリルを開催し、シアノアクリレート系接着剤とカバーガラスで覆われている手で厚さ10から15ミクロンまで薄くされています。1）剛性、2を提供する）、骨再生を阻害し、3）光散乱を低減する骨表面の凹凸から。頭蓋骨が破られていないので、検討されてプロセスに影響を与える可能性の炎症が大幅に削減されます。アップ皮質表面下250μmのへのイメージングの深さは、二光子レーザー走査顕微鏡を用いて達成することができます。このウィンドウは、よく麻酔と覚醒の両方準備に脳血流と細胞機能を研究するのに適しています。それはさらにオペアンプを提供していますoptogeneticsを使用して、細胞の活性を操作するか、または循環する光感受性の照射により、標的血管の血流を妨害するportunity。

我々は、ミリメートルにまたがると、脳の炎症を伴わないヶ月間安定であるマウスの頭蓋骨の画像ウィンドウを形成する手法を提案する。このメソッドは、よく二光子顕微鏡を用いて血流、細胞のダイナミクス、細胞/血管構造の縦断的研究に適しています。

皮質機能のin vivoイメージングには、頭蓋内環境を乱することなく脳への光学的なアクセスを確保することが不可欠です。本研究では、...を形成する方法を提示します。

この手順の全般的な目的は、頭蓋内の環境を乱することなく繰り返しイメージングが行えるよう、マウスの皮質上に安定した薄い頭蓋窓を作成することです。まず、イメージング装置の下で頭部を安定して固定するためのヘッドマウントを取り付けます。次に、脳の背側表面上の領域で頭蓋骨を慎重に薄くし、微粒子研磨剤で表面を研磨します。次に、シアノアクリレート系接着剤を少量塗り、カバーガラスで窓を覆って補強します。最後のステップは、2光子顕微鏡によるイメージングに向けて動物を準備することです。最終的に、in vivoでの2光子顕微鏡法を用いて、動脈、静脈、毛細血管、神経細胞の樹状突起などの微細構造を可視化します。これらは、皮質から最大250 µmの深さまで、数週間にわたってイメージングすることが可能です。この頭蓋窓作成法の主な利点は、皮質上の頭蓋骨に手を触れないことです。まず、光学的な透明度を得るために頭蓋骨を薄くし、次にシアノアクリレート系接着剤とカバーガラスで頭蓋骨を補強します。この手法は、麻酔下またはOIC状態で、さまざまな蛍光トランスジェニックマウスを研究する際に有用です。本手順を開始するために、必要な手術器具をオートクレーブで滅菌し、付属の論文に記載の方法に従って、生後約3～6週齢のマウスを麻酔します。足指をピンチして反射を確認し、マウスが手術に適した麻酔深度にあることを確認してください。次に、マウスを脳定位固定装置に固定します。マウスの体温を37 °Cに維持します。フィードバック調節機能付きの直腸プローブとヒートパッドを使用してください。また、眼の保湿のため、眼軟膏を塗布します。次に、小型電気シェーバーで頭皮を剃ります。その後、Betadineで頭皮を洗浄し、続いて70%イソプロピルアルコールで拭き取ります。そして、顕微鏡下で滅菌人工脳脊髄液の一分量を37°Cに温めます。外科用鋏を用いて、頭蓋骨背面の全領域から頭皮を除去します。皮膚を、頭蓋骨両側の側頭筋の端および頸部の筋肉の後方まで側方にトリミングします。次に、メスを用いて、頭蓋骨表面から薄い骨膜を除去します。次に、頭蓋骨を乾燥させ、洗浄します。その後、頭蓋骨の表面にシアノアクリレート接着剤を薄く塗布します。接着剤を十分に乾燥させてください。この接着剤の層は、歯科用セメントを適切に密着させるために必要です。以降のステップとして、覚醒 imaging 準備のためにドリルで穴を開け、対側頭蓋骨表面に 0 0 0 番のセルフタッピングスクリューを2本挿入します。次に、2つの固定点を持つ剛性のカスタムコネクタを頭蓋骨に取り付けます。これにより自由度が大幅に減少し、縦断的研究において同一の撮像領域を再設定することが容易になります。また、幅広のクロスバーにより、電極の配置や振動刺激のための十分なスペースが確保されます。次に、窓を作成する部位を除き、頭蓋骨表面全体を歯科用セメントの層で覆い、露出している皮膚の端がすべてセメントで覆われていることを確認します。頭蓋骨を薄く削る前に、ドリルバーが鋭利であることを確認し、再利用は避けてください。低速の歯科用ドリルと0.5 mmのバーを使用し、体性感覚皮質上の2 mm × 2 mmの領域を薄く削ります。次に、加熱を防ぐため、定期的にCSFで頭蓋骨を湿らせながら、一度に数秒ずつ乾燥した頭蓋骨表面を薄くします。続いて骨を薄くしていきます。さらにドリルを低速に切り替え、軽く触れる程度に頭蓋骨表面を削ります。ドリルは垂直方向から約30度の角度で表面に近づけます。血管層を越えて、脳表面の上の第2骨層まで骨を削り続けます。ドリルを細かく制御しながら保持し、側方向にのみ力を加えます。骨の厚さが約 50 microns になると、濡れた骨を通して剥離血管がはっきりと見えるようになります。この深さになると、骨の中の小さな白い点が数秒間現れます。乾燥した頭蓋骨の表面を湿らせた直後、最終的な骨の厚さが約10〜15 micronsになるようにします。骨が十分に薄くなると、乾燥した頭蓋骨表面を湿らせた際に、骨の中の小さな白い斑点が見えなくなります。ここで、酸化スズ粉末を用いてウィンドウを研磨します。ウィンドウの約4分の1の大きさの少量の粉末を使い、シリコンホイップ付きの既製ドリルビットを用いて、CSFと共に粉末のスラリーを撹拌します。表面を10分間研磨し、ウィンドウから酸化スズ粉末を完全に洗い流して、骨を乾燥させます。この工程により、薄層化の手順でドリルビットによって残った粗いエッジを軽減することができます。次に、ウィンドウのサイズよりわずかに小さい正方形の0号カバーガラスを数枚切り出します。スクライバーを使用して、カバーガラスに水平線と垂直線をそっと刻みます。ガラスを割らないように注意しながら、定規などの直線的なエッジを用いて切り離します。次に、カバーガラスをペトリ皿に入れます。皿をテーブルの端に軽く叩きつけ、ガラス片を分離させます。その後、折れた綿棒の木製チップを使用して、ウィンドウの上にSano ACRL接着剤を少量塗布します。あらかじめカットしておいたカバーガラスを、接着剤の上に素早く配置します。接着剤を15分以上十分に乾燥させ、カバーガラスの下に気泡が入らないようにしてください。カバーガラスの上面に付着した過剰なシアノアクリレート系接着剤は、メスを用いて除去します。歯科用セメントでウィンドウの縁を封止します。次に、最後に浸漬レンズを使用するための水を保持できるよう、わずかに盛り上がったウェルを作成します。動物を暖かいケージに入れ、麻酔から完全に回復するまで待機させます。このステップでは、イメージングのために動物を光学ブレッドボード上に固定し、フレームを頭部支持として使用します。別売りのプレートを使用することで、動物とすべての生理学的モニタリング装置を1つのユニットとして組み立てたまま、手術部位から2光子イメージング部位まで輸送することが可能です。血流イメージングを行う場合は、血清を標識するために、5%フルオレセインデキストラン染料0.05 millilitersを眼窩下静脈から注入してください。この操作は全身麻酔下で行う必要があり、通常、色素は数時間にわたって血中に留まります。体液量とエネルギー要件を維持するため、乳酸リンゲル液を2時間ごとに1gあたり3 µLの容量で腹腔内に注入してください。イソフルロンの投与を中止し、マウスを目覚めさせます。覚醒から1時間後、マウスはイメージングが可能な状態になります。光の混入を防ぐため、顕微鏡の上にケージを被せてください。ここに、静脈内注射でテキサスレッド結合デキストランを標識したYFPマウスの太腿の皮質血管系の例を示します。硬膜の血管は、多くの場合、皮質表面のわずか上の硬膜内で観察されます。大きな皮質動脈と静脈が皮質表面に位置しています。貫通血管はこの表面ネットワークから分岐して皮質内に進入し、そこで分枝して皮質組織に栄養を供給する緻密な毛細血管網を形成します。この動画では、覚醒マウスの皮質表面における脈管系を示しています。動物が安静状態にあるとき、動脈径に自発的な振動が見られることがあります。この手法は、麻酔下または覚醒状態の、さまざまな蛍光トランスジェニック動物を研究する際に有用であると考えられます。

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は繰り返しマウスミクログリアを可視化し、単球を循環させるための方法を説明します。...

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

このビデオと補足資料では、我々は慢性のプロトコルを示す...

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

ポリッシュと補強薄頭蓋骨（ポート）頭蓋窓と神経膠芽腫（GBM）の細胞注入を組み合わせることによって、我々は、神経膠腫の開始と縦ライブマウスの脳内に注入GBM細胞からの成長を観察することができます。...

イメージンググリオーマ開始<emインビボで&gt;</em&gt;ポリッシュと補強シン頭蓋骨頭蓋窓スルー

このビデオでは、脳のさまざまな領域への安定した光学アクセスのために、マウスモデルに頭蓋窓を埋め込む外科的処置を紹介しています。...

マウスモデルにおける頭蓋イメージングウィンドウの移植:マウス脳領域への安定した光学アクセスのためのガラスベースのカバースリップを埋め込む外科的処置

急性脳外傷は現在まで適切な治療を持っていない重傷です。多光子顕微鏡は、縦方向に急性脳外傷開発のプロセスを研究し、げっ歯類における治療的戦略をプロービングできます。脳のin vivo二光子イメージングに師事急性脳外傷の二つのモデルは、このプロトコルで実証されています。...

縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷

この原稿が縦2光子顕微鏡を用いたin vivoでのアミロイド斑の蓄積の間に脳血管系のリモデリングを追跡するための手順を説明します。間引き頭蓋骨製剤は、アルツハイマー病のマウスモデルにおける脳損傷の進行を評価するために、蛍光色素の可視化を可能にします。...

縦<em&gt;インビボ</em&gt;脳血管系のイメージング：中枢神経系疾患との関連

このプロトコルは、神経-神経膠血管構造の縦画像化、相互作用、および健康および疾患条件の両方における機能に使用できる慢性頭蓋窓移植技術を記述する。これは、多くの場合、好ましいが、いくつかの重大な制限を有する経頭蓋イメージングアプローチに対する補完的な代替手段として機能する。...

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

ここに提示されるのは、覚醒した頭部拘束マウスにおける脳細胞の縦方向イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルである。...

覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

本プロトコルは、フードラップ、透明シリコーン、およびカバーガラスを使用して、大きな(6 x 3 mm2)頭蓋窓を作成することについて説明しています。この頭蓋窓は、同じマウスでの in vivo...

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。...

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

学ぶマウス脳の長期イメージング手法。頭蓋骨を薄く研磨しシアノアクリレート接着剤とカバーガラスで補強することで、炎症を起こさずに250μmの深さまで血管や神経細胞を観察可能。神経科学研究に有用です。

マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

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