マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

この手順の全般的な目的は、頭蓋内の環境を乱することなく繰り返しイメージングが行えるよう、マウスの皮質上に安定した薄い頭蓋窓を作成することです。まず、イメージング装置の下で頭部を安定して固定するためのヘッドマウントを取り付けます。次に、脳の背側表面上の領域で頭蓋骨を慎重に薄くし、微粒子研磨剤で表面を研磨します。

次に、シアノアクリレート系接着剤を少量塗り、カバーガラスで窓を覆って補強します。最後のステップは、2光子顕微鏡によるイメージングに向けて動物を準備することです。最終的に、in vivoでの2光子顕微鏡法を用いて、動脈、静脈、毛細血管、神経細胞の樹状突起などの微細構造を可視化します。これらは、皮質から最大250 µmの深さまで、数週間にわたってイメージングすることが可能です。

この頭蓋窓作成法の主な利点は、皮質上の頭蓋骨に手を触れないことです。まず、光学的な透明度を得るために頭蓋骨を薄くし、次にシアノアクリレート系接着剤とカバーガラスで頭蓋骨を補強します。この手法は、麻酔下またはOIC状態で、さまざまな蛍光トランスジェニックマウスを研究する際に有用です。

本手順を開始するために、必要な手術器具をオートクレーブで滅菌し、付属の論文に記載の方法に従って、生後約3～6週齢のマウスを麻酔します。足指をピンチして反射を確認し、マウスが手術に適した麻酔深度にあることを確認してください。次に、マウスを脳定位固定装置に固定します。

マウスの体温を37 °Cに維持します。フィードバック調節機能付きの直腸プローブとヒートパッドを使用してください。また、眼の保湿のため、眼軟膏を塗布します。

次に、小型電気シェーバーで頭皮を剃ります。その後、Betadineで頭皮を洗浄し、続いて70%イソプロピルアルコールで拭き取ります。そして、顕微鏡下で滅菌人工脳脊髄液の一分量を37°Cに温めます。

外科用鋏を用いて、頭蓋骨背面の全領域から頭皮を除去します。皮膚を、頭蓋骨両側の側頭筋の端および頸部の筋肉の後方まで側方にトリミングします。次に、メスを用いて、頭蓋骨表面から薄い骨膜を除去します。

次に、頭蓋骨を乾燥させ、洗浄します。その後、頭蓋骨の表面にシアノアクリレート接着剤を薄く塗布します。接着剤を十分に乾燥させてください。

この接着剤の層は、歯科用セメントを適切に密着させるために必要です。以降のステップとして、覚醒 imaging 準備のためにドリルで穴を開け、対側頭蓋骨表面に 0 0 0 番のセルフタッピングスクリューを2本挿入します。

次に、2つの固定点を持つ剛性のカスタムコネクタを頭蓋骨に取り付けます。これにより自由度が大幅に減少し、縦断的研究において同一の撮像領域を再設定することが容易になります。また、幅広のクロスバーにより、電極の配置や振動刺激のための十分なスペースが確保されます。

次に、窓を作成する部位を除き、頭蓋骨表面全体を歯科用セメントの層で覆い、露出している皮膚の端がすべてセメントで覆われていることを確認します。頭蓋骨を薄く削る前に、ドリルバーが鋭利であることを確認し、再利用は避けてください。低速の歯科用ドリルと0.5 mmのバーを使用し、体性感覚皮質上の2 mm × 2 mmの領域を薄く削ります。

次に、加熱を防ぐため、定期的にCSFで頭蓋骨を湿らせながら、一度に数秒ずつ乾燥した頭蓋骨表面を薄くします。続いて骨を薄くしていきます。さらにドリルを低速に切り替え、軽く触れる程度に頭蓋骨表面を削ります。

ドリルは垂直方向から約30度の角度で表面に近づけます。血管層を越えて、脳表面の上の第2骨層まで骨を削り続けます。

ドリルを細かく制御しながら保持し、側方向にのみ力を加えます。骨の厚さが約 50 microns になると、濡れた骨を通して剥離血管がはっきりと見えるようになります。この深さになると、骨の中の小さな白い点が数秒間現れます。

乾燥した頭蓋骨の表面を湿らせた直後、最終的な骨の厚さが約10〜15 micronsになるようにします。骨が十分に薄くなると、乾燥した頭蓋骨表面を湿らせた際に、骨の中の小さな白い斑点が見えなくなります。ここで、酸化スズ粉末を用いてウィンドウを研磨します。

ウィンドウの約4分の1の大きさの少量の粉末を使い、シリコンホイップ付きの既製ドリルビットを用いて、CSFと共に粉末のスラリーを撹拌します。表面を10分間研磨し、ウィンドウから酸化スズ粉末を完全に洗い流して、骨を乾燥させます。この工程により、薄層化の手順でドリルビットによって残った粗いエッジを軽減することができます。

次に、ウィンドウのサイズよりわずかに小さい正方形の0号カバーガラスを数枚切り出します。スクライバーを使用して、カバーガラスに水平線と垂直線をそっと刻みます。ガラスを割らないように注意しながら、定規などの直線的なエッジを用いて切り離します。

次に、カバーガラスをペトリ皿に入れます。皿をテーブルの端に軽く叩きつけ、ガラス片を分離させます。その後、折れた綿棒の木製チップを使用して、ウィンドウの上にSano ACRL接着剤を少量塗布します。

あらかじめカットしておいたカバーガラスを、接着剤の上に素早く配置します。接着剤を15分以上十分に乾燥させ、カバーガラスの下に気泡が入らないようにしてください。カバーガラスの上面に付着した過剰なシアノアクリレート系接着剤は、メスを用いて除去します。

歯科用セメントでウィンドウの縁を封止します。次に、最後に浸漬レンズを使用するための水を保持できるよう、わずかに盛り上がったウェルを作成します。動物を暖かいケージに入れ、麻酔から完全に回復するまで待機させます。

このステップでは、イメージングのために動物を光学ブレッドボード上に固定し、フレームを頭部支持として使用します。別売りのプレートを使用することで、動物とすべての生理学的モニタリング装置を1つのユニットとして組み立てたまま、手術部位から2光子イメージング部位まで輸送することが可能です。血流イメージングを行う場合は、血清を標識するために、5%フルオレセインデキストラン染料0.05 millilitersを眼窩下静脈から注入してください。

この操作は全身麻酔下で行う必要があり、通常、色素は数時間にわたって血中に留まります。体液量とエネルギー要件を維持するため、乳酸リンゲル液を2時間ごとに1gあたり3 µLの容量で腹腔内に注入してください。イソフルロンの投与を中止し、マウスを目覚めさせます。

覚醒から1時間後、マウスはイメージングが可能な状態になります。光の混入を防ぐため、顕微鏡の上にケージを被せてください。ここに、静脈内注射でテキサスレッド結合デキストランを標識したYFPマウスの太腿の皮質血管系の例を示します。硬膜の血管は、多くの場合、皮質表面のわずか上の硬膜内で観察されます。

大きな皮質動脈と静脈が皮質表面に位置しています。貫通血管はこの表面ネットワークから分岐して皮質内に進入し、そこで分枝して皮質組織に栄養を供給する緻密な毛細血管網を形成します。この動画では、覚醒マウスの皮質表面における脈管系を示しています。

動物が安静状態にあるとき、動脈径に自発的な振動が見られることがあります。この手法は、麻酔下または覚醒状態の、さまざまな蛍光トランスジェニック動物を研究する際に有用であると考えられます。