を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織

この手順では、ショウジョウバエの組織を解剖してクロマチン免疫沈降データを生成し、drosophila組織内のin vivoにおけるクロマチン状態を正確に反映させます。本例では、数百個の精巣を手作業で解剖して回収します。クロマチン免疫沈降アッセイは、目的のタンパク質に対する抗体を用いて実施します。

精製されたチップDNA中の特定のゲノム領域の濃縮を評価するため、定量RT-PCR分析アッセイを継続して行います。あるいは、チップサンプルのハイスループットシーケンシングにより、ゲノムワイドなプロファイルを得ることができます。最終的に、分取した組織のチップ解析により、生理的条件下における細胞のクロマチン状態を提示することが可能となります。

このプロトコルは、生体から直接単離した組織の解析用に最適化されています。実際の生理学的条件下でのクロマチン状態およびエピジェネティック情報を取得するため、本稿ではショウジョウバエにおけるChIPを用いてクロマチン状態を調べる方法を実演します。なお、このプロトコルはマウスやゼブラフィッシュなどの他の生物種にも適用可能です。

チップへの適用やハイスループットシーケンシング用のシーケンシングライブラリ作製に使用するために、不十分な質および量ではなく、十分な品質と量のDNAを得るには、本プロトコルの視覚的な実演が極めて重要です。まず、プロテアーゼ阻害剤および100 µg/mL PMSFを含む冷PBS中で、目的の組織（本例では約200対のショウジョウバエ精巣）を解剖します。組織を2回洗浄した後、阻害剤を含む同様のPBS溶液200 µLで再懸濁します。

次に、37%ホルムアルデヒドを37°Cに加温し、5.5 µL加えてサンプルを固定します。37°Cで15分間インキュベートしてください。5分ごとにボルテックスし、組織を氷上で静置させます。

阻害剤を含むPBS 450 µLで2回洗浄します。サンプルを-20 °Cで保存します。200個のoph精巣サンプルを1.75 mLのエッペンドルフチューブにまとめます。

バッファーを吸引し、サンプルを再懸濁します。200 µLの溶解バッファーを用います。ブルーホモジナイザーで組織を完全に分散させ、凝集塊が残っていないことを確認した後、室温で10分間インキュベートします。

次に、マイクロチップソナケーターを用いてサンプルを断片化し、氷上で50秒間静置します。チップターゲットに最適な断片サイズが得られるまで、この操作を4〜5回繰り返します。その後、1.8 mLのリッパーバッファーで希釈し、クロマチン抽出液ストック液を作成します。ChIPアッセイを成功させるには、DNA断片のサイズを経験的に決定することが極めて重要です。

チップ実験に進むために、ゲル電気泳動を行う必要があります。入力コントロールサンプルについて、50 µLを取り出します。5 Mの塩化ナトリウムを2 µL加え、65 °Cで一晩インキュベートします。

架橋を解除するため、抗体をプロテインAビーズに接合します。1.5 mLのフェンドチューブに、40 µLのプロテインAビーズと600 µLのPBSを加え、4 °Cで2分間転がして混合します。

次に、ビーズを磁石に適用し、上清を捨てます。ここで、100 µLのPBSと目的の抗体を加えます。室温で1時間インキュベートします。

磁石でビーズを回収した後、1 mLの組織クロマチン抽出液を加えます。4 °Cで一晩回転混和させます。次に、ChIPサンプルを磁石にかけ、上清を除去します。

回収したビーズを4°Cで1 mLの洗浄液を用いて1回10分間ずつ洗浄し、100 µLのTEAバッファーに再懸濁します。タンパク質-DNA複合体の架橋を解除するため、10% SDSを3 µLと20 mg/mLのProteinase Kを5 µL加え、65°Cで一晩インキュベートします。

マグネットを用いてビーズをペレット化します。DNAを含む上清を新しいチューブに移します。ビーズを1回洗浄し、DNAを含む2回分の上清を合わせます。

次に、フェノール・クロロフォーム抽出でDNAを精製し、上層の水相を新しいチューブに移します。20 µg/mLの線状アクリルアミドまたはグリコーゲン、20 µLの3 M酢酸ナトリウム、および500 µLの100% Ethanolを用いてDNAを沈殿させます。

よく混ぜ合わせ、-80 °Cで10分間インキュベートします。遠心分離によってDNAをペレット化します。上清を捨て、風乾後、300 µLの70% ethanolでペレットを1回洗浄します。

DNAペレットを50 µLのTEバッファーで再懸濁します。チップ処理したDNAサンプルは-20 °Cで保存してください。標準曲線の作成のため、ゲノムDNAの段階希釈液を準備します。

希釈したゲノムDNAインプットコントロールまたはチップDNAのテンプレートを用いて、96ウェルプレートに20 µLのqPCR反応液をデュプリケートでセットアップし、ミニプレートスピナーで96ウェルプレートを遠心分離します。リアルタイムPCRシステムでサンプルプレートを走行させ、データを検証します。まず、熱解離プロットに単一のピークがあることを確認し、PCRによって単一のアンプリコンが増幅されたことを検証します。

次に、標準曲線をプロットします。希釈系列のゲノムDNAから得られたデータを用いて、サイクル閾値（Ct）に基づきDNA量を算出するための計算式を導き出します。また、各プライマーセットについて、PCRの指数増幅における直線相を決定します。

チップDNAおよびインプットコントロールサンプルのCT値がCT値の直線範囲内にある場合、インプットに対するチップDNAの濃縮度を算出して考慮します。希釈係数に基づき、T4 DNAポリメラーゼおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを含む50 µLの反応系において、0.1〜5 µgのチップDNAの末端修復を行います。製造者の指示に従い、室温で45分間インキュベートします。

次に、MinLu反応クリーンアップキットを用いてDNAを精製します。DNAポリメラーゼ、1つの大きなCLA NOWフラグメント、およびdATPを加え、3'末端にオーバーハングを付加し、37°Cで30分間インキュベートします。再度、反応液をスピンカラムに通してDNAを精製し、濃縮します。

アダプターオリゴを用いたライゲーションに進みます。Illumina社のT4 DNA Ligaseを用いて混合し、室温で1時間インキュベートします。その後、MinLu reaction cleanup kitを用いてサンプルの精製を行います。

20 µLでDNAを溶出させます。次に、egel装置を用いて電気泳動によりDNAサンプルを分離します。ゲル中の200から400 base pairのバンドを単離し、KYOGENゲル抽出キットを用いて精製します。

次に、ペアエンドプライマーとIllumina社のFusion HFおよびpH酵素を用い、20サイクルのPCRでライブラリを増幅させます。その後、標準的な2%AOSEゲルを用いて、Ellenのソフトウェアによるハイスループットシーケンシング用の200〜400 base pairのDNA断片を単離します。すべてのリードをdrosophilaゲノムにアライメントし、参照配列に対して最大2つのミスマッチを許容します。

重複する同一リードがある場合、下流解析のために一意にマッピングされたリードを保持します。PCR増幅によるバイアスの可能性を低減するため、最大3コピーまで保持します。次に、Pythonスクリプトを使用して、GAパイプラインの出力をブラウザ拡張データファイルに変換します。

ウィンドウサイズを4塩基対、DNA断片サイズを160塩基対に設定します。RPKMに基づき、ショウジョウバエの遺伝子をサイレント遺伝子と発現遺伝子に分類します。RPKMが0の遺伝子をデジタル数として指定してください。

不活性グループとして、RPKMが1より大きい遺伝子を発現グループに分類し、さらに低、中、高の発現レベルの3つのサブグループに分けます。最後に、basal 2007の「bag of marbles」で以前に述べられているPythonスクリプトを用いて、ヒストン修飾と遺伝子発現レベルを比較します。変異体の精巣では、増殖期精原細胞から分化期精細胞への移行に不全が生じています。

このチップQPCR実験では、未分化生殖細胞のソースとしてBAM精巣を用い、精子分化に必要な主要遺伝子のクロマチン状態、およびヒストン修飾であるヒストン3リシン27三メチル化（H3K27me3）またはヒストン3リシン4三メチル化（H3K4me3）の濃縮度を解析します。分化遺伝子の定量は、恒常的に発現しているサイクリンA遺伝子で正規化して決定します。BAM精巣では発現していない分化遺伝子であるオス特異的転写因子87（Don Juan）およびfuzzy onionは、抑制的なヒストン3リシン27三メチル化ヒストン修飾が高度に濃縮されています。

さらに、それらには活性型ヒストン修飾であるヒストンH3リシン4トリメチル化（H3K4me3）が存在しません。このクロマチンシグネチャーは、ヒストンH3リシン4トリメチル化とヒストンH3リシン27トリメチル化の両方を備えたバレント（多価）状態とは対照的に、モノバレント（一価）と呼ばれます。

胚性幹細胞の分化遺伝子において、リシン27のトリメチル化が濃縮されている。同一の抗体セットを用いたChIP-seqデータ。図1Aに示されるChIP-qPCRの結果を確認する。テストした3つの終末分化遺伝子すべてのゲノム領域において、ヒストンH3のリシン27トリメチル化（H3K27me3）は高度に濃縮されているが、ヒストンH3のリシン4トリメチル化（H3K4me3）は濃縮されていない。

対照的に、構成的に発現しているcyclin agingは、転写開始点付近においてヒストン3リシン4トリメチル化が高く、ヒストン3リシン27トリメチル化が低くなっています。この図は、4つの発現変動遺伝子クラスの転写開始点付近における2つのヒストン修飾のChIP-seqデータを示しています。ヒストン3リシン27トリメチル化は転写開始点の下流に集積しており、これは遺伝子発現レベルと逆相関しています。

サイレント遺伝子は最も高いhistone three lysine 27 methyl threeレベルを示し、高発現遺伝子ではhistone three lysine 27 methyl threeの結合が見られませんでした。これは、遺伝子発現に対するhistone three lysine 27 methyl threeの抑制的な役割と一致しています。逆に、転写開始点周辺におけるhistone three lysine four methyl three修飾の濃縮は、遺伝子発現レベルと逆の相関を示しました。これは、遺伝子発現に対するhistone three lysine four methyl threeの活性化的な役割と一致しています。

この手法を習得すれば、2〜3日で適切に実施することができます。pH、クロロホルム、およびホルムアルデヒドを使用する際は、安全上の注意を忘れないでください。このプロトコルが、in vivo組織におけるクロマチンランドスケープを解析するためのクロマチン免疫共沈降法の利用について、十分な理解の一助となれば幸いです。