Name: を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法でショウジョウバエ組織を用いたin vivoクロマチン状態の正確な評価と遺伝子発現制御メカニズムの解析。高スループットシーケンス技術を活用した神経科学・遺伝学研究に有用です。

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著者らは、シーケンシングの結果を提供することで彼らの助けのために博士Keji趙の研究室（NIH / NHLBI）に感謝したいと思います。また、読み込み、マップされたシーケンスを視覚化するためにゲノムブラウザを使用するためのUCSCゲノムプロジェクトに感謝​​します。 この作業は、起動時にXCに資金NICHD、ルシールParkard財団、ジョンズ·ホプキンス大学からの独立賞、R01HD065816にR00HD055052 NIH経路によってサポートされてい

（チップ全体の手順は約2日かかります。ハイスループットシーケンシング用チップライブラリーの調製別の2〜3日かかります。） 1。解剖するとChIP実験（〜1万個の細胞）の組織を準備する<ol><li>冷PBS + 1×プロテアーゼ阻害剤（7倍のストック溶液を得るために1.5 mlの1X PBS中のプロテアーゼインヒビターカクテル1ペレットを溶解）で（ ショウジョウバエ精巣の例えば、200ペア）を、目的の組織を解剖+ PMSF（最終濃度は100μg/ mL）を。回組織をすすぎ、阻害剤と同じPBS溶液200μLに組織を再懸濁します。 </li><li>サンプルを修正するには、5.5μLの37％ホルムアルデヒド（37使用する前に1分間℃の水浴中で暖かいホルムアルデヒド）を追加します。 15分、渦の間に5分ごとに37℃でインキュベートします。 </li><li> 2分間解決するために組織のサンプルを氷上に置きます。 450μLのPBS（プロテアーゼ阻害剤とPMSFを含む）で2倍すすいでください。サンプルは、現在店舗になります-20℃でのD ChIPのための十分な材料を得るために解剖を数回繰り返します。 </li></ol> 2。 ChIPアッセイのためにタンパク質-DNAコンジュゲート上清の準備<ol><li> 1.75 mLのエッペンドルフチュー​​ブにステップ1.3から十分なサンプルを兼ね備えています。 </li><li>組織サンプルからPBSを削除します。溶解緩衝液200μL（50mMのトリス-HCl、pHは7.6、1mMの塩化カルシウム、0.2％トリトンX-100またはNP-40、5 mMの酪酸、および1xプロテアーゼ阻害剤カクテル）を追加します。溶解バッファー（0.5mMのPMSFの最終濃度）に新鮮なPMSFストック溶液を追加します。組織が任意の凝集することなく完全に解離するまで10分間RT（室温）でインキュベートし、青ホモジナイザー（フィッシャー猫＃749521から1590）でホモジナイズする。 </li><li>超音波：パワー20で使用するマイクロチップの超音波（Misonix HS-XL200）。 50秒を氷上で10秒と残りのための超音波洗浄します。 （長い超音波処理は、小さな断片が得られるように最適な超音波処理時間は、経験的に決定されるべきである。ヒストンに対する抗体を用いたChIPのために4-5回を繰り返します。eの修正は、我々は通常、約200から300 bpまでのクロマチン超音波処理し、転写因子やクロマチンレギュレータ（例えば、ポリコーム蛋白質）のために、我々は通常、200から1000塩基対にクロマチン超音波洗浄します。しかし、最適なフラグメントサイズは​​経験的にテストする必要があります。注：必ず加熱からサンプルを防ぐために超音波処理中であっても、チューブを氷上にキープ！ </li><li> 1.8mlのRIPAバッファー（10mMトリス-HCl、pHが7.6で説明したのと同じ濃度のプロテアーゼ阻害剤とPMSFと1mMのEDTA、0.1％SDS、0.1％のNa-デオキシコール酸、1％トリトンX-100、追加することにより、試料を希釈する以前に）。架橋を逆にする（O / N）℃で一晩65℃2μL、5M NaClおよびインキュベーションを追加することにより、入力コントロールとして40μLを保存します。 </li><li>ビーズに抗体を結合するために、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに40μLのプロテインAビーズを追加し、その後、2分間、4℃で600μLのPBSと岩を追加磁石にビーズを適用し、上清を除去します。 100のPBSμLと目的の抗体を追加します（抗体の量は、empir決定されるべきであるically）。 4時間1時間または4℃室温でインキュベートします。 </li><li>磁石でビーズから上清を除去し、ステップ2.4​​からビーズに1mLのクロマチン抽出液を追加します。 4℃で回転させてCO / N. </li><li>磁石にチップのサンプルを適用し、上清を除去します。 10分ごとに4℃以下のバッファ°Cでビーズを洗浄します： RIPA緩衝液1 mLで2倍[1.89 mLの &#39;RIPAバッファー&#39; + 315μL7Xのプロテアーゼ阻害剤+ 20μLPMSF]; RIPA緩衝液1 mLで2倍+ 0.3 M NaClを[1.89 mLをRIPAバッファー+ 220μlの3 MのNaCl]; LiClを緩衝液1 mL（0.25 M LiClを、0.5％NP40、0.5％NaDOC）で2倍。 1X 1X TE 1mlの+ 0.2％トリトンX-100; 1X TEを1 mLの1X。 </li><li>架橋を逆にするには、100μlのTEバッファーでビーズを再懸濁し+ 3μL、10％SDS +プロテイナーゼK（20 mg / mL）を5μL。 65℃でインキュベートCO / N. </li><li>磁石にビーズを適用し、新しいチューブに上清を移す。上清は、あなたのDNAサンプルが含まれています。 100μLのTE + 0.5 Mでビーズを洗浄NaClおよび2上清を兼ね備えています。 </li><li>フェノール - クロロホルムDNAサンプルを抽出します。 Chlorofrom：IAA（25:24:1）を混合し、ボルテックスフェノール200μLを追加します。室温で5分間、14Kでスピン。また、DNAはキアゲンPCR精製キットを使用して抽出することができます。 </li><li>新しいチューブに上清/水層を移し、上清の各1mLのために20 mg / mLで20μg/ mLの（あるいはグリコーゲンの1μLの最終濃度にリニアアクリルアミドを追加しても使用することができます。グリコーゲンが使用されますリニアアクリルアミドはアッセイをシークエンシングのために使用されている間に、後続の定量PCRまたはPCR分析は。）3M NaOAcの20μLと500μLの100％EtOHを追加します。よく混ぜ、80℃でインキュベート℃で10分間。 4℃で20分間最大速度で回転℃、 </li><li>上清を除去し、300μLの70％エタノールで洗浄する。 50μLのTE緩衝液で空気乾燥して再懸濁したサンプル。サンプルは現在-20℃で保存することができますサンプルは、定量PCR（qPCR）アッセイ（ 図1）に使用することができます。 </li></ol> 3A。定量PCRを用いたChIP-EDのDNAを分析する<ol><li>原液、1/10、1/100、1/1000、1/5000：標準曲線を作成するには、以下の濃度でゲノムDNAを希釈する。 </li><li>各プライマーペアに対して、ステップ3a.1、入力制御とChIP-ED DNAからゲノムDNAを96ウェルプレートで重複して定量PCRを設定します。 10μLの2倍のSYBR PCRミックス（Fermentas、K0222） 1μL10μMフォワードプライマー; 1μL10μMリバースプライマー; XμLのChIP-ED DNA（インプットコントロール、またはゲノムDNA）; YμLのヌクレアーゼフリーH 2 Oは、20μLの反応液量を調整することができます。 </li><li>ミニプレートスピナー（Labnet）を96ウェルプレートをスピンダウンします。 </li><li>以下の条件を使用して、ABI 7300リアルタイムPCRシステム（または他のリアルタイムPCRシステム）で定量PCRを行います。 ステージ1：50℃2分、1サイクルのC; ステージ2：95℃で10分間、1サイクル; ステージ3：95℃15秒、60℃で1分間、40℃ycles。 ステージ4（解離段階）：95℃15秒、60°C、1分間、95℃15秒間CのC。 </li><li>解離曲線を確認してください。熱解離のプロット1つのピークは、PCR反応から単一のアンプリコンを示唆している。複数のピークは、プライマーペアと非特定の製品を示し、定量PCRのデータは、使用すべきではありません。 </li><li> 3aの希薄化後のゲノムDNAのシリーズを使用して標準曲線に基づいているCT（サイクル閾値）の値に従って、DNA量を解決する数式を計算することにより、各プライマーセットのPCR反応の指数関数的増幅の線形位相を決定します。 1。 </li><li> CHIP-ED DNAと入力コントロールのCt値は、CT値の直線範囲内にある場合は、2.4でのChIP-ED DNAと入力コントロールの希釈率に従って、CHIP-ED DNA対入力の濃縮を計算します。 </li></ol>図3b。ハイスループットシークエンシング用のCHIP-ED DNAを増幅する。 <ol><li> CHIP-ED DNAミックスのエンド修復（使用EPICENTRE DNA END-リペアキット）、氷の上で設定します。 ステップ2.12 1から34μlのゲノムDNA（0.1〜5μg）を 5μlの10倍エンド修理バッファ 5μlを2.5 mMのdNTPミックス 5μlの10mMのATP XμlのH 2 O 49μlに反応量を調整する 1μlのエンド修復酵素ミックス（T4 DNAポリメラーゼ+ T4ポリヌクレオチドキナーゼ） 室温で45分間インキュベートします。キアゲンのMinElute反応を用いて反応を浄化する クリーンアップキットです。 30μlの溶出バッファー（EB）で溶出します。 </li><li> 3 &#39;末端にオーバーハングを追加します。 ステップ3b.1から溶出したDNA産物30μlの 5μlの10×NEBバッファ＃2 10μlの1 mMのdATPを 2μlのdH 2 Oで 3μlの5 U /μlのKlenow断片（3 &#39;→5&#39;エキソ） 37℃で30分間インキュベート℃、 MinElute ReactionCleanupキットを使用して反応を浄化する。 10μlのEBに溶出します。 </li><li> Solexaリンカーライゲーション： ステップ3b.2から溶出したDNA 10μlの 10μlのDDH 2 O 2.5＆μ、L倍のT4 DNAリガーゼ緩衝液 イルミナから1μlのアダプターオリゴミックス（在庫から1/10-diluted） 2.5μlのT4 DNAリガーゼ（400単位/μl）を 室温で1時間インキュベートする。 MinElute ReactionCleanupキットを使用して反応を浄化する。 20μlのEBに溶出します。サンプルは現在-20℃で保存することができます</li><li> E-ゲル装置を用いてステップ3b.3から溶出したDNAサンプルを実行します。ゲル中300から500 bpのバンドを分離し、キアゲンのゲル抽出キット（このステップは、アダプターオリゴライゲーションから〜125 bpのセルフライゲーションリンカーを排除する）を用いて精製する。 12μlのEBに溶出します。 </li><li>イルミナからペアエンド（PE）のプライマーを用いてライブラリーを増幅する。 ステップ3b.4から溶出したDNAの10.5μL マスターミックスの12.5μL（2X备考HF、Finnzymes） PE1のPCRプライマー11μlの PE2のPCRプライマー21μlの PCR条件： 98℃30秒 （98°C 10秒、65℃30秒、72℃30秒）、繰り返し20サイクル 5分間72℃。 </li><li>ステップ3b.5からのサンプルは、標準的な2％アガロースゲルを使用して、適切なサイズのDNA（300〜500 bp）を選択した後のChIP-seqを使用することができます。サンプルは現在-20℃で保存することができます汚染を防ぐために、単一のゲル上の各チップのサンプルを分離することをお勧めします。サンプルは、ハイスループットシーケンシングのために提出することができます。 </li></ol> 3C。 Solexaのパイプライン分析<ol><li> 25-bpのシークエンスは、読み取りイルミナGenome Analyzerの（GA）パイプラインから得られた。 </li><li>すべての読み取りが参照配列を持つ2つのミスマッチまでできるように、エランド（塩基データの効率的なローカルアライメント）ソフトウェアを使用して、 ショウジョウバエのゲノム（DM3）に整列させた。 </li><li>一意にマッピングされた読み取りが下流解析のために保持された。複数の同一の読み取りの場合、最大3つのコピーは、PCR増幅からバイアスの可能性を減らすために保持された。 </li><li> GAパイプラインの出力は、ブラウザの拡張可能なデータ（BED）ファイルに変換されました。 </li><li>生成するには可視化のためにUCSCブラウザにアップロードするためのかつらファイルは、我々は、ウィンドウサイズとして4塩基対のDNA断片のサイズは160 bpで、以前の出版物3に記載されているPythonのかばんを使用していました。 </li><li>静かで発現する遺伝子に、ショウジョウバエの遺伝子を分類するために、我々はRPKMと呼ばれるデジタル数（キロベースあたりの/は/百万円、マップされたリードあたりのエクソン領 ​​域をマージ読み込み）を使用しました。 RPKMを持つ遺伝子= 0をRPKM≥1を使用してサイレント·グループと遺伝子として分類された、低中程度および高い発現レベルの遺伝子として3つのサブグループに分類することができる表されるグループに分類し、各グループには同じ数について持っている遺伝子。 </li><li>ヒストン修飾レベルおよび遺伝子発現を比較するために、我々は以前の出版物3に記載されているPythonスクリプトを使用していました。 </li></ol> 4。代表的な結果 BAMを使用したChIP-qPCRに結果の例（大理石の袋）変異体<html>精巣は、 図1〜4に示されています。 BAM精巣では、増殖性精原細胞から精母細胞5、6の差別化への移行に障害があります。我々は、この組織の種類に富む未分化な生殖細胞のソースとしてBAM精巣を使用しています。このような雄特異的転写因子87（mst87F）、ドン·ファン（DJ）、ファジィタマネギ（fzo）などの精子の分化に必要な分化遺伝子は、BAM精巣で表現されていません。これらの遺伝子は非常に抑圧的なH3K27me3ヒストン修飾7（ 図1A）に富むが、アクティブH3K4me3とヒストン修飾8（ 図1B）、我々は7 &#39;一価&quot;と呼ばれるクロマチンの署名を欠いているされています。 H3K27me3またはH3K4me3とのいずれかの濃縮は、恒常的に発現サイクリン（CycA）遺伝子4正規化によって決定されます。 BAM変異体の精巣（ 図2）図1に示すように、定量PCRの結果を検証しました。3テストされた分化遺伝子のmst87F、DJとfzoを有する抗体の同じセットを（すなわち、抑圧的なH3K27me3とアクティブH3K4me3）は使用したコンテンツ&quot;&gt; CHIP-seqの分析、それらのゲノム領域は非常にH3K27me3はなく、H3K4me3と（ 図2A-2C）で濃縮されています。これとは対照的に、恒常的に発現CycA遺伝子が重要なH3K4me3と、その転写開始部位（TSS）（ 図2D）の近くの小さなH3K27me3バインディングを持っています。 さらに、示差的に発現する遺伝子の4つのクラスの転写開始近くH3K27me3とH3K4me3とのChIPのプロファイルは、各ヒストン修飾の機能と一致している。 図3Aに示すように、転写開始のH3K27me3下流の濃縮は、逆に遺伝子発現レベルと相関している。サイレント遺伝子は、一方で最高H3K27me3を持っている高発現遺伝子はH3K27me3バインディングはありません。これらのデータは、遺伝子発現におけるH3K27me3の抑圧的な役割と一致しています。対照的に、転写開始の周りH3K4me3との濃縮は、遺伝子発現に及ぼすH3K4me3との積極的な役割と一致し、遺伝子発現レベル（ 図3B）と逆相関を示した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" /> どちらの抑圧的なH3K27me3ヒストン修飾（A）または（B）BAM細胞に富む未分化変異体精巣のアクティブH3K4me3とヒストン修飾に対する抗体を用いたChIP-ED DNAの図1。qPCR解析。 （）BAM精巣では、分化遺伝子（Mst87F、DJ、fzo）が H3K27me3抑圧的なヒストン修飾飾られています。 （B）分化遺伝子はH3K4me3とアクティブなマークが枯渇している。標的遺伝子のチップDNA（ChIPのDNA /入力）のレベル（Mst87F、DJやfzo）が最初レフに正規化されました<html>制御CycA遺伝子のチップDNAのエル。エラーバーは独立した生物学的複製するから標準偏差を示しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" /> 図2。 （A）Mst87Fの全ゲノム領域にわたるH3K27me3とH3K4me3と濃縮のUCSCゲノムブラウザスナップショット（B）DJと（C）fzoは 、（D）CycA遺伝子（D）のクロマチンの状態を反映しているではH3K27me3に富む領域を丸で囲んだ卑しいです。重複遺伝子CG7264、精巣（RPKM = 1）BAMで表されるが、非常に野生型精巣（RPKM = 130）8（7からのChIP-seqのデータ）で表されます。図1のChIPの結果の定量的PCR解析で使用されるプローブは、各プロットの下部にラベルが付けられています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 tp_upload/3745/3745fig3.jpg &quot;/&gt; 図3。精巣 7 BAMでH3K27me3とH3K4me3とを用いたChIP-seqのプロファイル 。 4遺伝子群（7509遺伝子）は、RNA-seqの結果を8に基づいてそれらの遺伝子発現レベルに応じて分類された。遺伝子の代表的なクラスは、上流の3キロバイトからの転写開始部位の下流3キロバイト（転写開始）に配列を使用して、特定のヒストン修飾の濃縮のためにプロットされます。これは（）H3K27me3（K27）の濃縮のプロファイルを生成し、（B）H3K4me3と（K4）は、各グループでのChIP-seqの分析は。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

<ol><li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li>
<li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li>
<li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li>
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<li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

このプロトコルで説明したChIP解析の汎用性は、生物学的に関連したシステムではクロマチンの状態を勉強する機会を提供する別の組織で使用することができます。培養されたシステムからの細胞を用いたChIP実験は、細胞の大量を容易に得ることができるので、実行するために便利です。しかし、培養細胞は、必ずしも多細胞環境内のセルを反映するものではありません。生きた動物から切除した組織を使用して、この技術を開発することによって、我々は培養細胞ができない多くの問題に対処することができます。 このプロトコルの有用性にもかかわらず、いくつかの注意点があります。たとえば、解剖組織は、まだいくつかの異なる種類の細胞で不均質である。比較的均一な細胞は、成虫、根性のような他の組織、精巣、およびすべての制限された成体幹細胞は不均一であるが含まれて卵巣としてショウジョウバエの組織では得ることができる。この合併症は、部分的にすることができます強力なショウジョウバエ遺伝学を使用して対処。成体幹細胞は、上述の組織の小集団内に存在するとChIP解析のために十分な数で単離することが非常に困難...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>完全なミニプロテアーゼインヒビターカクテル</td><td>ロシュ社</td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド（37％） </td><td>スペルコ</td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td>シグマ</td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontesペレット乳棒</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR精製キット</td><td>キアゲン</td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td>線形ポリアクリルアミド</td><td>シグマ</td><td> 56575-1ML </td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>キアゲン</td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBRグリーン/ ROX定量PCRマスターミックス</td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td>ミニプレートスピナー</td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRシステム</td><td>アプライドバイオシステム</td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td>少量の超音波プロセッサ</td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td>モデル廃止</td></tr><tr><td>ダイナ、タンパク質</td><td>インビトロジェン</td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td>磁石をDynamag </td><td>インビトロジェン</td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td>フェノール：Chlorofrom：IAA </td><td>インビトロジェン</td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> EPICENTRE DNA END-リペアキット</td><td> EPICENTREバイオテクノロジー</td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction個のクリーンアップキット</td><td>キアゲン</td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td>クレノウフラグメント（3 &#39;→5&#39;エキソ） </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td>プロメガ株式会社</td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td>アダプターオリゴヌクレオチド</td><td>イルミナ</td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td>ペアエンドプライマー1.0および2.0 </td><td>イルミナ</td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-ゲルElectorphoresisシステム</td><td>インビトロジェン</td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X备考HFマスターミックス</td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

を使用してクロマチン免疫沈降（chip）ショウジョウバエ組織

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

エピジェネティクスは、研究クロマチンの状態は、異なる発達段階で異なる種類の細胞で異なる遺伝子発現に寄与してどのように急速に発展してフィールドのままです。エピジェネティックな調節は、成人期の胚発生と恒常性の間に細胞分化を含む生物学的プロセスの広いスペクトルに貢献しています。エピジェネティクス研究における重要な戦略は、様々なヒストン修飾とクロマチン因子が遺伝子発現を調節する方法を検討することである。この問題に対処するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）は、目的の細胞のDNAを持つ特定の要因の関連のスナップショットを取得するために広く使用されています。 ChIPのテクニックは、一般的に再現性のあるデータを生成するために豊かさと均一性を得ることができる出発材料として、培養細胞を使用しています。しかし、いくつかの制約があります：まず、ペトリ皿に細胞を成長させる環境は、このように、in vivoでのものとは異なる場合があります生体内の細胞の内因性のクロマチンの状態を反映していない。第二に、細胞のすべてではないタイプは、ex vivoで培養することができます。人々は、ChIPアッセイのための十分な材料を得ることができ、そこから細胞株の限られた数があります。 ここでは、 ショウジョウバエの組織を用いたChIP実験を行うための方法について説明します。出発原料は、このように正確に内因性のクロマチンの状態を反映することができ、生きている動物から組織を解剖しています。組織の多くの異なったタイプのこのメソッドの適応性は、研究者がより多くの生物学的に多くの生体 1、2 のエピジェネティック制御についての関連問題に対処することができます。ハイスループットシーケンシング（CHIP-SEQ）でこのメソッドを組み合わせることにより、さらに研究者らはエピ風景を取得することができます。

最近のハイスループットシーケンシング技術が大幅にクロマチン免疫沈降（ChIP）実験の感度を増加させ、精製した細胞や組織解剖を使用して、そのアプリケーションを求めている。ここでは、チップ技術を使用する方法を描く<em&gt;ショウジョウバエ</emよく特徴付けられた生物学的システムにおける内因性のクロマチン状態に対処することができます&gt;組織。

を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織

エピジェネティクスは、クロマチンの状態が、異なる細胞種における特異的な遺伝子発現にどのように寄与するかを研究する分野であり、現在も急速に発展し続けています。

この手順では、ショウジョウバエの組織を解剖してクロマチン免疫沈降データを生成し、drosophila組織内のin vivoにおけるクロマチン状態を正確に反映させます。本例では、数百個の精巣を手作業で解剖して回収します。クロマチン免疫沈降アッセイは、目的のタンパク質に対する抗体を用いて実施します。精製されたチップDNA中の特定のゲノム領域の濃縮を評価するため、定量RT-PCR分析アッセイを継続して行います。あるいは、チップサンプルのハイスループットシーケンシングにより、ゲノムワイドなプロファイルを得ることができます。最終的に、分取した組織のチップ解析により、生理的条件下における細胞のクロマチン状態を提示することが可能となります。このプロトコルは、生体から直接単離した組織の解析用に最適化されています。実際の生理学的条件下でのクロマチン状態およびエピジェネティック情報を取得するため、本稿ではショウジョウバエにおけるChIPを用いてクロマチン状態を調べる方法を実演します。なお、このプロトコルはマウスやゼブラフィッシュなどの他の生物種にも適用可能です。チップへの適用やハイスループットシーケンシング用のシーケンシングライブラリ作製に使用するために、不十分な質および量ではなく、十分な品質と量のDNAを得るには、本プロトコルの視覚的な実演が極めて重要です。まず、プロテアーゼ阻害剤および100 µg/mL PMSFを含む冷PBS中で、目的の組織（本例では約200対のショウジョウバエ精巣）を解剖します。組織を2回洗浄した後、阻害剤を含む同様のPBS溶液200 µLで再懸濁します。次に、37%ホルムアルデヒドを37°Cに加温し、5.5 µL加えてサンプルを固定します。37°Cで15分間インキュベートしてください。5分ごとにボルテックスし、組織を氷上で静置させます。阻害剤を含むPBS 450 µLで2回洗浄します。サンプルを-20 °Cで保存します。200個のoph精巣サンプルを1.75 mLのエッペンドルフチューブにまとめます。バッファーを吸引し、サンプルを再懸濁します。200 µLの溶解バッファーを用います。ブルーホモジナイザーで組織を完全に分散させ、凝集塊が残っていないことを確認した後、室温で10分間インキュベートします。次に、マイクロチップソナケーターを用いてサンプルを断片化し、氷上で50秒間静置します。チップターゲットに最適な断片サイズが得られるまで、この操作を4〜5回繰り返します。その後、1.8 mLのリッパーバッファーで希釈し、クロマチン抽出液ストック液を作成します。ChIPアッセイを成功させるには、DNA断片のサイズを経験的に決定することが極めて重要です。チップ実験に進むために、ゲル電気泳動を行う必要があります。入力コントロールサンプルについて、50 µLを取り出します。5 Mの塩化ナトリウムを2 µL加え、65 °Cで一晩インキュベートします。架橋を解除するため、抗体をプロテインAビーズに接合します。1.5 mLのフェンドチューブに、40 µLのプロテインAビーズと600 µLのPBSを加え、4 °Cで2分間転がして混合します。次に、ビーズを磁石に適用し、上清を捨てます。ここで、100 µLのPBSと目的の抗体を加えます。室温で1時間インキュベートします。磁石でビーズを回収した後、1 mLの組織クロマチン抽出液を加えます。4 °Cで一晩回転混和させます。次に、ChIPサンプルを磁石にかけ、上清を除去します。回収したビーズを4°Cで1 mLの洗浄液を用いて1回10分間ずつ洗浄し、100 µLのTEAバッファーに再懸濁します。タンパク質-DNA複合体の架橋を解除するため、10% SDSを3 µLと20 mg/mLのProteinase Kを5 µL加え、65°Cで一晩インキュベートします。マグネットを用いてビーズをペレット化します。DNAを含む上清を新しいチューブに移します。ビーズを1回洗浄し、DNAを含む2回分の上清を合わせます。次に、フェノール・クロロフォーム抽出でDNAを精製し、上層の水相を新しいチューブに移します。20 µg/mLの線状アクリルアミドまたはグリコーゲン、20 µLの3 M酢酸ナトリウム、および500 µLの100% Ethanolを用いてDNAを沈殿させます。よく混ぜ合わせ、-80 °Cで10分間インキュベートします。遠心分離によってDNAをペレット化します。上清を捨て、風乾後、300 µLの70% ethanolでペレットを1回洗浄します。DNAペレットを50 µLのTEバッファーで再懸濁します。チップ処理したDNAサンプルは-20 °Cで保存してください。標準曲線の作成のため、ゲノムDNAの段階希釈液を準備します。希釈したゲノムDNAインプットコントロールまたはチップDNAのテンプレートを用いて、96ウェルプレートに20 µLのqPCR反応液をデュプリケートでセットアップし、ミニプレートスピナーで96ウェルプレートを遠心分離します。リアルタイムPCRシステムでサンプルプレートを走行させ、データを検証します。まず、熱解離プロットに単一のピークがあることを確認し、PCRによって単一のアンプリコンが増幅されたことを検証します。次に、標準曲線をプロットします。希釈系列のゲノムDNAから得られたデータを用いて、サイクル閾値（Ct）に基づきDNA量を算出するための計算式を導き出します。また、各プライマーセットについて、PCRの指数増幅における直線相を決定します。チップDNAおよびインプットコントロールサンプルのCT値がCT値の直線範囲内にある場合、インプットに対するチップDNAの濃縮度を算出して考慮します。希釈係数に基づき、T4 DNAポリメラーゼおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを含む50 µLの反応系において、0.1〜5 µgのチップDNAの末端修復を行います。製造者の指示に従い、室温で45分間インキュベートします。次に、MinLu反応クリーンアップキットを用いてDNAを精製します。DNAポリメラーゼ、1つの大きなCLA NOWフラグメント、およびdATPを加え、3'末端にオーバーハングを付加し、37°Cで30分間インキュベートします。再度、反応液をスピンカラムに通してDNAを精製し、濃縮します。アダプターオリゴを用いたライゲーションに進みます。Illumina社のT4 DNA Ligaseを用いて混合し、室温で1時間インキュベートします。その後、MinLu reaction cleanup kitを用いてサンプルの精製を行います。20 µLでDNAを溶出させます。次に、egel装置を用いて電気泳動によりDNAサンプルを分離します。ゲル中の200から400 base pairのバンドを単離し、KYOGENゲル抽出キットを用いて精製します。次に、ペアエンドプライマーとIllumina社のFusion HFおよびpH酵素を用い、20サイクルのPCRでライブラリを増幅させます。その後、標準的な2%AOSEゲルを用いて、Ellenのソフトウェアによるハイスループットシーケンシング用の200〜400 base pairのDNA断片を単離します。すべてのリードをdrosophilaゲノムにアライメントし、参照配列に対して最大2つのミスマッチを許容します。重複する同一リードがある場合、下流解析のために一意にマッピングされたリードを保持します。PCR増幅によるバイアスの可能性を低減するため、最大3コピーまで保持します。次に、Pythonスクリプトを使用して、GAパイプラインの出力をブラウザ拡張データファイルに変換します。ウィンドウサイズを4塩基対、DNA断片サイズを160塩基対に設定します。RPKMに基づき、ショウジョウバエの遺伝子をサイレント遺伝子と発現遺伝子に分類します。RPKMが0の遺伝子をデジタル数として指定してください。不活性グループとして、RPKMが1より大きい遺伝子を発現グループに分類し、さらに低、中、高の発現レベルの3つのサブグループに分けます。最後に、basal 2007の「bag of marbles」で以前に述べられているPythonスクリプトを用いて、ヒストン修飾と遺伝子発現レベルを比較します。変異体の精巣では、増殖期精原細胞から分化期精細胞への移行に不全が生じています。このチップQPCR実験では、未分化生殖細胞のソースとしてBAM精巣を用い、精子分化に必要な主要遺伝子のクロマチン状態、およびヒストン修飾であるヒストン3リシン27三メチル化（H3K27me3）またはヒストン3リシン4三メチル化（H3K4me3）の濃縮度を解析します。分化遺伝子の定量は、恒常的に発現しているサイクリンA遺伝子で正規化して決定します。BAM精巣では発現していない分化遺伝子であるオス特異的転写因子87（Don Juan）およびfuzzy onionは、抑制的なヒストン3リシン27三メチル化ヒストン修飾が高度に濃縮されています。さらに、それらには活性型ヒストン修飾であるヒストンH3リシン4トリメチル化（H3K4me3）が存在しません。このクロマチンシグネチャーは、ヒストンH3リシン4トリメチル化とヒストンH3リシン27トリメチル化の両方を備えたバレント（多価）状態とは対照的に、モノバレント（一価）と呼ばれます。胚性幹細胞の分化遺伝子において、リシン27のトリメチル化が濃縮されている。同一の抗体セットを用いたChIP-seqデータ。図1Aに示されるChIP-qPCRの結果を確認する。テストした3つの終末分化遺伝子すべてのゲノム領域において、ヒストンH3のリシン27トリメチル化（H3K27me3）は高度に濃縮されているが、ヒストンH3のリシン4トリメチル化（H3K4me3）は濃縮されていない。対照的に、構成的に発現しているcyclin agingは、転写開始点付近においてヒストン3リシン4トリメチル化が高く、ヒストン3リシン27トリメチル化が低くなっています。この図は、4つの発現変動遺伝子クラスの転写開始点付近における2つのヒストン修飾のChIP-seqデータを示しています。ヒストン3リシン27トリメチル化は転写開始点の下流に集積しており、これは遺伝子発現レベルと逆相関しています。サイレント遺伝子は最も高いhistone three lysine 27 methyl threeレベルを示し、高発現遺伝子ではhistone three lysine 27 methyl threeの結合が見られませんでした。これは、遺伝子発現に対するhistone three lysine 27 methyl threeの抑制的な役割と一致しています。逆に、転写開始点周辺におけるhistone three lysine four methyl three修飾の濃縮は、遺伝子発現レベルと逆の相関を示しました。これは、遺伝子発現に対するhistone three lysine four methyl threeの活性化的な役割と一致しています。この手法を習得すれば、2〜3日で適切に実施することができます。pH、クロロホルム、およびホルムアルデヒドを使用する際は、安全上の注意を忘れないでください。このプロトコルが、in vivo組織におけるクロマチンランドスケープを解析するためのクロマチン免疫共沈降法の利用について、十分な理解の一助となれば幸いです。

chromatin-immunoprecipitation-chip-using-drosophila-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。...

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

このビデオプロトコルは準備するヨハンセン実験室で使用されているスカッシュのテクニックを示しています。...

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。...

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chirpが長い非コードRNAのゲノム結合部位（lncRNAs）をマッピングするための新規かつ迅速な手法である。メソッドは、lncRNAバインドされたゲノムサイトの列挙を許可するアンチセンスタイルオリゴヌクレオチドの特異性を利用しています。...

RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

ショウジョウバエの組織は、しばしば、細胞型の不均一な混合物を含有する。特定の組織の特定の細胞型における遺伝子発現を調べるために、核が遺伝的にタグ付けし、続いて親和性に基づくアプローチを用いて単離することができる。単離された核は、遺伝子発現解析およびクロマチン免疫沈降などの下流用途に使用することができる。...

からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em&gt;ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための&gt;組織

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq...

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

この作品は、高解像度その場でハイ C...

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

この方法は、細胞株におけるPRC2媒介クロマチンドメインの形成に従うように設計されており、この方法は他の多くのシステムに適応することができる。...

クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

このプロトコルは、ショ ウジョウバエ...

ショ ウジョウバエ 唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

学ぶクロマチン免疫沈降法でショウジョウバエ組織を用いたin vivoクロマチン状態の正確な評価と遺伝子発現制御メカニズムの解析。高スループットシーケンス技術を活用した神経科学・遺伝学研究に有用です。

を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織

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