Name: 放射性その場でハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: 学ぶ放射性インサイチュハイブリダイゼーション法で脊椎動物組織におけるmRNA発現パターンを定量的に検出する技術。低発現転写産物の可視化と組織構造の保存に優れた方法です。

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著者らは、年間でプロトコルを改善し、すべてのジャーヴィスラボのメンバーに感謝したいと思います。

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

mRNA発現のin situハイブリダイゼーション放射性は広く、地域組織の組織、細胞の種類、脳機能活性2-5,10,12-14を研究するためなど、複数の目的に使用されています。後で使用するためには、そのmRNA発現、脳内の神経活動の増加、頻繁に呼び出さ活​​動依存的遺伝子または即時早期遺伝子に依存している遺伝子にあります。孵化/新生児、少年を含む、複数の年齢、複数の組織で、脳、皮膚、筋肉を含む。これらの用途で、我々の方法は、哺乳動物（例えばヒト）、魚、両生類、鳥類を含め、複数種を越えて適用されています、成人、ここで全体の胚セクションの2,3,5,15-17。我々のプロトコルの特殊な機能が含まれます：（1）は、解剖学的特異性と定量的な特異性のバランスを生成します。 X線フィルム上に遺伝子発現を定量化するために、我々は画像のデジタル写真を撮ること（例：図1Aおよび1B）、フォーを使用しtoshop（アドビシステムズ社）の関心領域内のピクセル密度を測定し、組織の外膜の上にバックグラウンドレベルを減算するヒストグラム機能はまだスライドガラス2,4に。細胞レベルでの発現を定量するために、我々は高倍率下での細胞（ 図4】40-100X）を介して銀粒子の画像を撮影する。我々は、その後スライドガラス上の細胞なしで同じような領域でのバックグラウンドのカウントを減算し、画像内の銀粒子の数をカウントするためにNIHでのWayne Rasbandによる画像Jのしきい値および測定機能を使用して、セルの数で割るセル当たりの式の値。4,18を取得する（2）が原因鉱物油浴によって作成されたタイトなカバースリップのシールに、同時に100から200スライドの処理を可能にする、相対的に高いスループットをすることができます。標準のin-situハイブリダイゼーション法では、パラフィルム、マニキュア、スライドは多くのスペースを取る他の手段で、スライドを封止するために時間がかかる、（3）これは非常にあるデキストラン硫酸とハイブリダイゼーション緩衝液2,13でデンハルト溶液による低濃度の転写産物の高感度（4）暗視野の撮像手法は、4,5解剖顕微鏡に暗視野照明の下で写真を撮るために、コントラストの高い画像が得られます。さらに、このような活動依存的遺伝子発現のように、遺伝子発現の小さな変化の高感度な検出が特定の行動を19の知覚と生成の間にアクティブに特定の脳領域を識別することができます。非放射性プロトコルへの相対的な制限が、後者は携帯電話の解像度と、細胞内のmRNAの場所に明確であることであり、エマルジョンでの作業は、操作や光に対して非常に敏感です。同じ組織10,17,20で複数の遺伝子のmRNA発現にラベルを付けるためにin situハイブリダイゼーションなどの非放射性として、他の方法と手法を組み合わせることができます。それは免疫細胞化学と組み合わせることができます特定の細胞型10との共局在mRNAにために、同じサンプルにRNAとタンパク質の発現の両方にラベルを付けます。このような二重標識実験のために必要なプロトコルの変更は、引用文献に記載されています。 要約すると、我々のアプローチは、地域組織、組織の機能活性、遺伝子機能を理解するためにタイミングと遺伝子発現の細胞の位置の理解を容易にします。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td>クレシルバイオレット酢酸</td><td>シグマ</td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>マイクロモルHM550 </td><td></td></tr><tr><td>脱イオン化ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td>プロメガ</td><td> P1171 </td><td> 100mMの</td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td>埋め込み型</td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドSuperfrostプラススラ​​イド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 22-034-979 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GENECLEANキット</td><td> Q-バイオ遺伝子</td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td>コダックバイオマックスMRフィルム</td><td>シグマ</td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td>コダックNTBエマルジョン</td><td>ケアストリームヘルス社</td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td>コダックプロフェッショナル開発者D19 </td><td>コダック</td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td>コダックプロフェッショナルフィクサー</td><td>コダック</td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>カルビオケム</td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOHで</td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td>ポリ</td><td>インビトロジェン</td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> RATP </td><td>プロメガ</td><td> P1132 </td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> rCTP </td><td>プロメガ</td><td> P1142 </td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> rGTP </td><td>プロメガ</td><td> P1152 </td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> RNasin </td><td>プロメガ</td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td>パーキンエルマー</td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td>安全解決ソリューション</td><td>安全性は、研究プロダクツ国際を解決する</td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基</td><td>シグマ</td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム一塩基性リン</td><td>シグマ</td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNAポリメラーゼ</td><td>プロメガ</td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td>メタルラックを染色</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 70312から54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td>プロメガ</td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td>組織テック10月</td><td>桜</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 5倍の転写バッファー</td><td>プロメガ</td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td>トリス-HCl（1M、pH8.0）に</td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNAの</td><td>ロシュ社</td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table>ソリューション： <ol><li>リボプローブを作るための試薬：1.5μlのDNAテンプレート（0.2から0.3μg/μLの）、5最適化された転写緩衝液2μl、100mMのDTT 1μlの（Promegaからポリメラーゼが付属しており、ミックスよく室温）、RNasin（40ユニット/μl）、AGCリボヌクレオチド混合液を、S 35 UTPの3.5μlを、1μlのRNAポリメラーゼ1.5μlを0.3μL。ヌクレアーゼ·フリー水10μlに起動します。 </li><li> AGCリボヌクレオチド混合液：ミックス一緒に10mMのATP、GTPとCTPの等量。 </li><li>フリーS 35 UTPを削除するエタノール沈殿用酢酸ナトリウム溶液：40μlのRNaseおよびDNaseフリー水、3M酢酸ナトリウム5μlの、100％エタノール125μlの。 </li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液（10ミリリットル株）：100％脱イオンホルムアミド5mlの、5M NaClを600μlの、1Mトリス塩酸液（pH = 8.0）、0.5M EDTA 240液（pH = 8.0）、100×デンハルトの溶液100μl、 1M DTT 100μlの、20mg/ml tRNAの250μlの20 mg / mlのポリと、デキストラン硫酸ナトリウム1gを125μlの。 10ミリリットルの合計体積をもたらすためにDEPC処理水を追加します。激しく振とうして、すべてのデキストラン硫酸ナトリウムが溶解するまで55℃でインキュベートする。にハイブリダイゼーションバッファーを格納する〜6ヶ月に適しています-20°C、。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド緩衝溶液：ホルムアルデヒド用に指定され、50〜ヒート°Cのホットプレート上で撹拌しながらフラスコ内で760ミリリットルの蒸留水にホルムアルデヒドの40グラムを追加します。パラホルムアルデヒドを溶解するのを助けるために10NのNaOH 320μlを添加します。 （〜10分）に溶解した後、10倍のPBS 100ミリリットルを追加し、1リットルになるまで蒸留水を使用してボリュームを起動します。ホルムアルデヒドが溶解するまで溶液を攪拌し、加熱する。 pHは7.4でなければなりません。 </li><li>アセチル化バッファー：トリエタノールアミン13.6ミリリットルを加え、蒸留水1リットル中の無水酢酸の2.52ミリリットル。 </li><li> 20×SSPE溶液：3MのNaCl、200mMののNaH 2 PO 4-H 2 O、および蒸留水で200 mMのEDTA。 10N NaOHでpH7.4に解決策を調整します。 </li><li> 10×PBS緩衝液：蒸留水のKH 2 PO 4のNaClの80グラム、KClの2.0グラム、14.4グラムのNa 2 HPO 4、2.4グラム。 pHを7.0にソリューションを調整し、1 Liteに総量をもたらすR。 </li><li>第二洗浄液：0.1％β-メルカプトエタノールおよび2x SSPEで50％のホルムアミド</li><li>クレシルバイオレット酢酸溶液：水道水の3％クレシルバイオレット酢酸（蒸留水が良い染色を防ぎます）、室温でフラスコ内を撹拌しながら一晩溶解した。 1ミリメートルワットマン濾紙とブフナー漏斗を介して真空吸引してフィルタリングします。 </li></ol>

放射性その場で</em組織における多様な遺伝子発現パターンを検出するための>ハイブリダイゼーション

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

遺伝子は、遺伝子の機能の理解に貢献するで表現されているタイミング、レベル、細胞内局在、細胞の種類を知っている。これらの各機能は、細胞内のmRNAのin situハイブリダイゼーションを行うことができます。ここでは、クレイトンら （1988）1特に大人の脊椎動物の脳2-5、長年にわたって私たちのラボで正常に働いているから修正in situハイブリダイゼーション法で放射性を提示する。標的配列への長い相補的RNA（cRNA）をプローブは、低濃度の転写産物6,7の検出を可能にします。 cRNAプローブに放射性ヌクレオチドの取り込みのいずれかの組織の上にコーティングされた光に敏感なX線フィルム又はエマルジョンにより、低濃度の転写産物と定量分析の更なる検出感度を可能にします。これらの検出方法は、標的遺伝子の発現の長期的な記録を提供しています。非放射性プローブ​​をメタに比べてそのようなDIG標識としてODS、放射性プローブ​​のハイブリダイゼーション法は、低濃度の転写産物を検出するためにHRP-抗体および/またはTSAキットを使用して複数の増幅工程を必要としません。したがって、このメソッドは、定量分析のための信号強度と標的mRNAの量の間の線形関係を提供しています。それは同時に100から200までのスライドを処理することができます。それは胚の発達段階の異なるにも適しています。胚組織は、それが困難な組織切片を持つ細胞集団間の境界を確認しながら、細胞間の少ない凝集して、成体組織よりも脆弱であるため、ほとんどの遺伝子発現の発達研究では、全体の胚および一部の非放射性のアプローチ8,9を使用しています 。対照的に、感度のより広い範囲のために私たちの放射性アプローチは、それが簡単に集団間の境界を見て作り、組織領域間の遺伝子発現の解像度で高コントラストを得ることができる。この方法を使用して、研究者は明らかにすることができ新たに同定された遺伝子の可能性の意義、さらに興味のある遺伝子の機能を予測する。

このプロトコルが正常に定量的な脊椎動物種間で複数の組織の種類のレベルとmRNA発現の空間パターンを検出するために使用されています。メソッドは、低濃度の転写物を検出すると同時にスライドの何百もの処理を可能にすることができます。我々は、例として、鳥類の胚の脳形成の発現プロファイリングを使用して、このプロトコルを提示します。

遺伝子が発現するタイミング、レベル、細胞内局在、および細胞種を明らかにすることは、その遺伝子の機能を理解することに寄与します。...

本実験の全体的な目的は、特定の遺伝子発現領域を特定し、遺伝子発現のタイミングとレベルを明らかにすることで、遺伝子機能の理解に寄与することです。これは、組織の完全性を維持するために、手順に使用する組織を迅速に採取し、調製することによって達成されます。第二のステップとして、リボプローブのバックグラウンド結合を低減させるために組織処理を行います。次に、リボプローブを組織にハイブリダイズさせ、RIBAプローブの結合を可視化します。X線フィルムまたは感光乳剤を用いることで、X線画像や暗視野および明視野顕微鏡観察と解析に基づき、遺伝子発現の部位とレベルを示す結果が得られます。Image Jソフトウェアを使用して解析を行います。ここでは、多くの人が間違いを犯しやすい、適切に行う必要がある重要なステップがいくつかあり、その一つがバックグラウンドの抑制です。不適切なサチュレーションや、不適切な温度でのハイブリダイゼーションなど、バックグラウンドの原因となるステップがいくつかあります。また、RNAプローブを分解させるRNA汚染も要因となります。したがって、すべてをRNaseフリーな状態に保つよう注意する必要があります。3点目は、スライドをエマルションに浸す際、暗室内に漏光がないこと、および最大3週間に及ぶ全工程を通じてエマルションを光にさらさないようにすることです。本手法の実演は、私の研究室のポストドクであるHun Chenが行います。新鮮な脳を採取し、1×PBSで洗浄した後、室温でメディアを入れた型に脳を浸し、OCT組織包埋剤で包埋します。脳が切片作成に適した方向を向いていることを確認します。次に、ドライアイスにエタノールをスプレーし、ブロックをエタノールとドライアイスの混合物に入れて組織を凍結させます。エタノールがブロック内部に入らないように注意しながら、クライオスタットを用いて凍結組織を10〜12 µmの厚さで切片し、脳および胚組織用のSuper Plusスライドに貼付します。最適な切削温度は-18°Cから-20°Cの範囲内です。切片はスライドボックスに入れ、-80°Cで保存してください。スライドを-80°Cの保存状態からドライアイス上のメタルラックへ移します。次に、認証済みのドラフトチャンバー内で、室温より3〜5°C高く予熱した4%パラホルムアルデヒド溶液にラックを浸します。室温で5分間インキュベートした後、ラックをパラホルムアルデヒドから取り出し、ラックをPBSに15回浸してスライドを洗浄します。この洗浄ステップを、毎回新しいPBS溶液を用いて2回繰り返します。次に、RIBAプローブの非特異的結合を低減させるため、スライドを調製したばかりのアセチル化バッファーに10分間浸します。その後、前と同様にスライドを洗浄しますが、今回は洗浄液として2×SSPEを使用します。70%、95%、100%のエタノール系列で各溶液に2分間ずつ浸し、組織を脱水します。その後、ドラフト内でスライドを少なくとも10～15分間乾燥させます。書面によるプロトコルの指示に従ってRIBAプローブを合成した後、すべてのスライドに必要なRIBAプローブとハイブリダイゼーション溶液の必要量を算出します。Riboプローブハイブリダイゼーションミックスを65 °Cで5分間予熱します。Riboプローブを変性させるため、Riboプローブハイブリダイゼーション溶液を100 µLピペッティングし、カバーガラス全体に配置します。次に、2枚目のガラスカバースリップを使用して、組織とカバーガラスの上に溶液を均一に広げます。スライドを水平に、表面を上にしてメタルラックに配置し、すべてのスライドの準備が整ったら、ラックを65 °Cのオイルバスにゆっくりと浸し、最低4時間、最大16時間保持します。オイルは、インキュベーション後のカバーガラスの周囲に気密シールを形成します。スライドが入ったメタルラックから余分なオイルを取り除きます。その後、ドラフトチャンバー内でクロロホルムを入れたガラス製または金属製のトレーにラックを浸します。新しいクロロホルムを入れた2つ目のトレーで洗浄を繰り返します。次に、ラックを0.1% $\beta$-mercaptoethanol含有2$\times$SSPE溶液に浸し、カバーグラスを外し、過剰なハイブリダイゼーション溶液を溶解させます。その後、スライドを新しく調製した0.1% $\beta$-mercaptoethanol含有2$\times$SSPE溶液に移します。カバーグラスを外したスライドを、0.1% $\beta$-mercaptoethanol含有2$\times$SSPEを含むトレイ内の新しいラックに移し、室温で1時間インキュベートして、結合しなかった過剰なRNAプローブを除去します。次に、スライドラックを65°Cに予熱した2×SSPE（50% フォームアミド、β-ME、および最終濃度0.1%のエタノールを含む）に転移し、65°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、この溶液およびそれまでのすべての水性洗浄溶液、ならびにカバーガラスを放射性廃棄物として廃棄します。続いて、65°Cに予熱した0.1×SSPEで、各30分間、スライドを2回洗浄します。次に、組織を70%、95%、100%のエタノール系列でそれぞれ2分間脱水します。最後に、ドラフトチャンバー内でスライドを少なくとも30分間乾燥させます。まず、組織に放射性シグナルが存在するかどうかを確認します。暗室にてセーフライトを使用し、乾燥させたスライドをフィルムカセットに入れます。スライドの上にX線フィルムを重ねます。スライドがフィルムのエマルション面に向いていることを確認し、カセットを閉じます。転写物の想定される量に応じて、スライドをフィルムに1日から7日間露光させます。露光完了後、標準的な現像液および定着液を用いてX線フィルムを現像します。ハイブリダイゼーションシグナルは、細胞解像度を決定し、組織上のシグナルを確認するために、乳剤中の露光された銀粒子に起因してフィルム上に黒い領域として現れます。スライドを写真用乳剤に浸した後、対比染色を行います。スライドをクリスタルバイオレットで対比染色する場合は、記載されたプロトコルの指示に従って切片を脱パラフィン処理しなければなりません。この時点で、暗室にて試験管に蒸留水を注ぎます。NTBエマルジョンをすくい取り、蒸留水を用いて1対1の割合で希釈します。エマルションを42 °Cの恒温水槽で20〜30分間加熱して融解させた後、42 °Cの恒温水槽に浸したガラス製の浸漬容器に移します。希釈したエマルションの液量は、スライドを浸した際にスライド上のすべての切片を覆う程度にします。スライドの枚数が多い場合は、追加のエマルションが必要になることがあります。次に、42 °Cの水槽内でスライドを希釈乳剤に浸し、その後、暗室内の密閉された遮光容器で一晩、または37 °Cのオーブン内で消灯状態で2～3時間、浸漬したスライドを乾燥させます。乾燥後、スライドをスライドボックスに移します。端を黒色の絶縁テープで密封し、さらにアルミホイルで覆います。ボックスを4 °Cで数日間から数週間保存します。現像の準備ができたら、スライドを室温に戻します。次に、暗室でスライドが入ったラックをボックスから取り出し、16 °CのCodec D-19現像液で3〜5分間現像します。その後、現像したスライドを室温の水道水で1分間洗浄します。次に、スライドを19°Cの定着液で6分間ずつ2回定着させます。2回目の定着中は室灯をつけても構いません。その後、室温の流水でスライドを30分以上洗浄します。続いて、スライドが濡れているうちに、カミソリの刃を使用してスライド背面からエマルジョンを削り取ります。最後に、0.3%クリスタルバイオレットで対比染色し、必要に応じて書面によるプロトコルの指示に従って脱水およびスライドの封入を行います。さらに、スライドの裏面に付着した過剰なエマルションを、水で濡らしてカミソリで削り取ることで除去します。スライドを80%エタノール溶液で洗浄し、ゴミや埃を取り除くために1〜2回優しく拭き取ります。暗視野照明または明視野照明下で撮影を行います。解剖顕微鏡の暗視野ではダスト粒子が容易に確認できるため、粒子がない良好な画像を得るには、スクレイピングとクリーニングの工程を2～3回繰り返す必要がある場合があります。以下の画像は、X線フィルムを用いたin situハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの例です。このX線フィルム画像は、胚発生10日目のキンカチョウの頭部全体の矢状断面を示しており、Fox P oneに対するアンチセンスリボプローブでハイブリダイゼーションが行われています。フィルム上の黒い感光粒子はメッセンジャーRNAの発現を示しており、脳内においてFox P oneメッセンジャーRNAが中隔線条体および背側視床に集積していることが確認できます。こちらのX線フィルム画像は、同じキンカチョウの個体でCuperに対するアンチセンスリボプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った断面を示しています。TF2は、視床背側およびより腹側の視床に濃縮されています。以下の画像は、エマルジョン浸漬スライドを用いたin situハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの例です。解剖顕微鏡下で撮影されたこの暗視野画像は、Fox P1に対するアンチセンスRIBAプローブでハイブリダイズさせた、孵化後6日目のキンカチョウの頭部矢状断全 sectionを示しています。組織上の乳剤層に見られる白い露出した銀粒子は、messenger RNAの発現を示しています。赤色はクレシルバイオレット染色の結果を表しています。スケールバーは1 mmを示しています。ここにある画像は、coop TF twoに対するアンチセンスリボプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った、同一のキンカチョウの切片を示しています。以下の画像は、胚齢12日のキンカチョウの頭部切片をX線フィルムでオートラジオグラフィーにより観察し、アンチセンス標識とセンス標識で異なるパターンが示されていることを比較したものです。破線は全脳の輪郭を、Cは小脳を示しています。PAC sixのアンチセンス鎖は、脳、特に心室帯で発現していることがわかります。この隣接切片をPAC sixのセンス鎖でハイブリダイゼーションさせたところ、胚の頭部全体にバックグラウンド発現は見られませんでしたが、アンチセンス鎖と同様に網膜の色素層に明らかな発現が認められました。以下の画像Cには、胚後期におけるキンカチョウの脳から作製した、明視野および暗視野による2つの遺伝子発現シグナルと乳剤浸漬スライドを示します。この明視野像は、胚齢10日目におけるD one Bの発現を示しています。乳剤への通常の露光では、黒く現れるラベルはこの倍率ではほとんど見えません。この画像は、前の画像と同じ切片および倍率のものですが、暗視野像に切り替えており、線条体と視床におけるラベルが白く示されています。この明視野像は、胚齢12日目におけるslit threeの発現を示しています。エマルションへの過剰露光後、黒いラベルが容易に確認できます。SCは脊髄の位置を、CBは小脳の位置を示しています。吻側は左方向を向いています。ここに示されている画像は同一の切片であり、倍率も同じですが、暗視野像に切り替えて表示しており、明視野像と一致する脊髄内の標識が白く示されています。以下の画像は、細胞レベルでの銀粒子の解像度を示しています。ここに示すのは、キンカチョウ前脳におけるFox P1メッセンジャーRNAの標識です。シルバーグレインは、クリスタルバイオレットで染色された細胞上の黒い点として現れています。この画像は、成鳥キンカチョウの中側核（mesoalium）の個々の細胞における高発現を示しています。また、こちらの画像は、同一切片の隣接する側核（alium）の個々の細胞における低発現を示しています。Hi Fox P1 メッセンジャーRNAの細胞における発現は、胚発生12日目の中胚葉に認められます。ここで見られる胚細胞は、前の2つの画像に見られた成体細胞と比較して小さく、より密集しています。最後に、この画像は、同じ切片の隣接する外層（alium）の細胞における低発現を示しています。この手順に従うことで、標的遺伝子がどの細胞型で発現しているかなど、さらなる疑問を解決するために免疫化学などの他の手法を行うことができます。このビデオを視聴することで、in situ ハイブリダイゼーションの手法について十分に理解できるはずです。放射性試薬の取り扱いは非常に危険であるため、この手順の間は常に個人用保護具などの予防策を講じることを忘れないでください。

radioactive-situ-hybridization-for-detecting-diverse-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

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