放射性その場でハイブリダイゼーション

本実験の全体的な目的は、特定の遺伝子発現領域を特定し、遺伝子発現のタイミングとレベルを明らかにすることで、遺伝子機能の理解に寄与することである。これは、組織の完全性を維持するため、手順に使用する組織を迅速に採取し、調製することによって達成される。第2段階として、リボプローブのバックグラウンド結合を低減させるために組織処理を行う。

次に、リボプローブを組織にハイブリダイゼーションさせ、RIBAプローブの結合を可視化します。X線フィルムまたは感光性乳剤を用いることで、X線画像、あるいは暗視野および明視野顕微鏡観察と解析に基づいた、遺伝子発現の部位とレベルを示す結果が得られます。Image Jソフトウェアを使用しますが、適切に行う必要があるいくつかの重要なステップがあり、多くの人が間違いを犯す点の一つが、バックグラウンドの防止です。

不十分な飽和や、不適切な温度でのハイブリダイゼーションなど、バックグラウンドの原因となる工程がいくつかあります。また、RNAプローブを分解させるRNA汚染も考えられます。したがって、あらゆる工程においてRNaseフリーの状態を維持することに注意してください。

3点目は、スライドをエマルジョンに浸す際、暗室内に光漏れがないこと、また最大3週間に及ぶ全工程を通じてエマルジョンが露光されないように注意することです。この手法の実演は、私の研究室のポストドクターであるHun Chenが行います。新鮮な脳を採取し、1×PBSで洗浄した後、室温でメディアを入れた型に脳を浸し、OCT組織包埋剤で包埋します。

脳をセクショニングに必要な方向に向かせます。次に、ドライアイスにエタノールをスプレーし、ブロックをエタノールとドライアイスの混合物に浸して組織を凍結させます。エタノールがブロック内部に入らないように注意しながら、クライオスタットを用いて凍結組織を10〜12 µmの厚さにスライスし、脳および胚組織用のSuper Plusスライドにマウントします。

最適な切断温度は-18°Cから-20°Cの範囲内です。切片はスライドボックスに入れ-80°Cで保存してください。スライドを-80°Cの保存場所からドライアイス上の金属ラックへ移動させます。

次に、認定済みのドラフトチャンバー内で、室温より3～5°C高く予熱した4%パラホルムアルデヒド溶液にラックを浸します。室温で5分間インキュベートした後、ラックをパラホルムアルデヒドから取り出し、ラックをPBSに15回浸してスライドを洗浄します。この洗浄ステップを、毎回新しいPBS溶液を用いて2回繰り返します。

次に、RIBAプローブの非特異的結合を抑制するため、スライドを調製したばかりのアセチル化バッファーに10分間浸します。その後、前述と同様にスライドを洗浄しますが、今回は洗浄液として2×SSPEを使用してください。70%、95%、100%のエタノール系列を用いて、各溶液に2分間ずつ浸し、組織を脱水します。

その後、ドラフトチャンバー内でスライドを少なくとも10〜15分間乾燥させます。書面によるプロトコルの指示に従ってRIBAプローブを合成した後、すべてのスライドに必要なRIBAプローブおよびハイブリダイゼーション溶液の必要量を算出します。Riboプローブハイブリダイゼーションミックスを65 °Cで5分間予熱します。

Riboプローブを変性させるため、Riboプローブハイブリダイゼーション溶液を100 µLピペッティングし、カバーガラス全体に広げます。次に、2枚目のガラスカバー slipを使用して、溶液を組織とカバーガラス上に均一に広げます。スライドを水平に、上面を上にしてメタルラックに配置し、すべてのスライドの準備が整ったら、ラックを65 °Cのオイルバスにゆっくりと浸し、最低4時間、最大16時間保持します。

オイルはカバーガラスの周囲に気密シールを形成します。インキュベーション後、スライドが入ったメタルラックから余分なオイルを拭き取ります。次に、ドラフトチャンバー内でクロロホルムを入れたガラス製または金属製のトレイにラックを浸します。新鮮なクロロホルムを入れた2つ目のトレイで、洗浄を繰り返します。

次に、カバーガラスを緩め、過剰なハイブリダイゼーション溶液を溶解させるため、ラックを0.1%betta me cap含有エタノールおよび2倍SSPE溶液に浸します。その後、スライドを新しい0.1%betta me cap TERエタノールおよび2倍SSPE溶液に移します。カバーガラスを外したスライドを、0.1%beta macca TERエタノールおよび2倍SSPEを含むトレイ内の新しいラックに移し、室温で1時間インキュベートして、未結合の過剰なRNAプローブを除去します。

次に、スライドラックを、65°Cに予熱し、最終濃度0.1%のβ-MEおよびエタノールを含む2×SSPE（50%ホルムアミド含有）溶液に移し、65°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、この溶液および以前のすべての水性洗浄液ならびにカバーガラスを放射性廃棄物として廃棄します。続いて、65°Cに予熱した0.1×SSPEで、30分間ずつ2回スライドを洗浄します。

次に、70%、95%、100%のエタノール系列を用いて、各溶液で2分間ずつ組織を脱水します。最後に、ドラフトチャンバー内でスライドを少なくとも30分間乾燥させます。まず、組織内に放射性信号が存在するかどうかを判定します。

暗室内でセーフライトを使用し、乾燥させたスライドをフィルムカセットに入れる。スライドの上にX線フィルムを重ねる。スライドがフィルムの乳剤面に面していることを確認し、カセットを閉じる。転写物の予想される量に応じて、1日から7日間、スライドをフィルムに露光させる。

露光完了後、標準的な現像液および定着液でX線フィルムを現像します。ハイブリダイゼーション信号は、細胞解像度を決定し、組織上の信号を確認するために、乳剤中の感光した銀粒子に由来する黒い領域としてフィルム上に現れます。スライドは写真用乳剤に浸漬させた後、対比染色を行います。

スライドをクリスタルバイオレットで対比染色する場合、書面によるプロトコルの指示に従って切片を脱パラフィン処理する必要があります。この時点で、暗室内でチューブに蒸留水を注ぎます。uc NTB乳剤をすくい取り、蒸留水で1対1に希釈します。

エマルションを42 °Cの水槽で20～30分間加熱して溶解させた後、42 °Cの水槽内に設置したガラス製ディッピング容器に移します。スライドを浸した際に、希釈したエマルションの液面がスライド上のすべての切片を覆うようにしてください。スライド枚数が多い場合は、追加のエマルションが必要になることがあります。

次に、42 °Cのウォーターバス内で、スライドを希釈乳剤に浸します。その後、暗室内の遮光密閉容器で一晩、または消灯した状態で37 °Cのオーブンで2〜3時間、浸漬したスライドを乾燥させます。乾燥後、スライドをスライドボックスに移します。エッジを黒色の絶縁テープで密封し、さらにアルミホイルで覆います。

ボックスを4 °Cで数日から数週間保存します。現像する際は、スライドを室温まで温めてください。次に、暗室でスライドが入ったラックをボックスから取り出し、16 °CのCodec D-19現像液で3〜5分間現像します。その後、現像したスライドを室温の水道水で1分間洗浄します。

次に、スライドを定着液に19 °Cで6分間ずつ2回浸します。2回目の定着時には室灯を点灯しても構いません。その後、室温の流水でスライドを少なくとも30分間洗浄します。そして、スライドが濡れているうちに、カミソリでスライド背面の乳剤をこそぎ落としてください。

最後に、0.3%クリスタルバイオレットで対比染色し、必要に応じて書面の手順書に従ってスライドを脱水・封入します。さらに、スライドの裏面に付着した過剰なエマルションを、水で濡らしてカミソリで削り取ることで除去します。スライドを80%エタノール溶液で洗浄し、ゴミやホコリを取り除くために1〜2回そっと拭き取ります。

暗視野照明または明視野照明下で撮影を行います。解剖顕微鏡の暗視野ではダスト粒子が容易に確認できるため、良好な画像を得るには、スクレイピングと洗浄の工程を2～3回繰り返す必要がある場合があります。以下の画像は、X線フィルムを用いたin situハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの例です。

このX線フィルム画像は、FoxP1に対するアンチセンスリボプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った、胚10日目のキンカチョウの頭部正中矢状断を示しています。フィルム上の黒い感光粒子はメッセンジャーRNAの発現を示しており、脳内の4つの領域で確認できます。ここでは、FoxP1メッセンジャーRNAが内側線条体と背側視床に豊富に存在しています。このX線フィルム画像は、同一のキンカチョウから採取し、Cupreに対するアンチセンスリボプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った切片を示しています。

TF two Co. TF twoは、palam aliumおよびより腹側の視床に濃縮されています。以下の画像は、エマルジョン浸漬スライドを用いたin situハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの例です。解剖顕微鏡下で撮影されたこの暗視野画像は、Fox P oneに対するアンチセンスRIBAプローブでハイブリダイゼーションを行った、孵化後6日目のキンカチョウの頭部正中矢状断面を示しています。

組織上の乳剤内にある白く露出した銀粒子は、メッセンジャーRNAの発現を示しています。赤色はクリスタルバイオレット染色を表しています。スケールバーは1 mmを示しています。

ここでは、coop TF 2に対するアンチセンスリボプローブでハイブリダイゼーションを行った同じキンアトリの切片を示しています。以下の画像は、胚性12日目のキンアトリの頭部切片をX線フィルムでオートラジオグラフィーにしたもので、アンチセンス標識とセンス標識の異なるパターンの比較を示しています。破線は脳全体の輪郭を示し、Cは小脳を示しています。

PAC sixのアンチセンスストランドは、脳内、特に心室帯において発現していることがわかります。これに隣接する、PAC sixのセンスストランドでハイブリダイゼーションさせた切片では、胚の頭部全体にバックグラウンド発現は見られませんが、アンチセンスストランドと同様に、網膜の色素層に明瞭な発現が認められます。以下の画像Cは、胚後期におけるキンアオガガスの脳から作製された、遺伝子発現の2つのシグナルおよびエマルション浸漬スライドの明視野および暗視野像を示しています。

この明視野像は、胚齢10日目におけるD one Bの発現を示しています。エマルジョンへの通常の露光では、黒く現れるラベルはこの倍率ではほとんど見えません。この画像は、前の画像と同じ切片および倍率のものですが、暗視野像に切り替えており、線条体と視床におけるラベルが白く示されています。

この明視野画像は、胚齢12日目におけるslit 3の発現を示しています。エマルションに過剰露光させることで、黒色のラベルを容易に確認できます。SCは脊髄の位置を、CBは小脳の位置を示しています。

吻側は左方向です。ここに示されている画像は、明視野画像と一致する脊髄内の白色のラベルを暗視野像で示したもので、同一の切片および倍率です。以下の画像は、細胞レベルでの銀粒子の解像度を示しています。

ここに示されているのは、キンカチョウ前脳におけるFox P1メッセンジャーRNAの標識です。クリスタルバイオレットで染色された細胞の上に、シルバーグレインが黒い点として現れています。この画像は、成鳥のキンカチョウの中層アリューム（mesoalium）における個々の細胞での高発現を示しています。また、この画像は、同一切片の隣接するアリューム（alium）における個々の細胞での低発現を示しています。

Hi Fox P1メッセンジャーRNAの細胞における発現が、胚12日目の中胚葉に認められます。

ここで示されている胚細胞は、前の2枚の画像に見られる成体細胞と比較して、より小さく、より密に詰まっています。最後に、この画像は、同じ切片の隣接する外層（alium）の細胞において、発現量が低いことを示しています。この手順に従い、免疫化学などの他の手法を実施することで、標的遺伝子がどの細胞型で発現しているかといった追加の疑問に答えることができます。

このビデオを視聴することで、インサイチュハイブリダイゼーションの手法について深く理解できるはずです。放射性試薬の取り扱いは非常に危険であるため、この手順の間は個人用保護具の使用などの予防策を常に講じることを忘れないでください。