同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

この実験の全体的な目的は、トマト植物における還元的に調節されるタンパク質に対するPseudomonas syringe PV tomatoの影響を観察することです。まず、トマト植物にPseudomonas syringe PV tomatoを接種し、病原体の感染とタンパク質反応を誘導します。続いて、DIAM benzineで染色し、活性酸素種の変化を観察します。

次に、タンパク質中のレドックス調節システインを調べるために、システインTMT標識を行います。得られた結果から、処理サンプルとコントロールサンプルの間の変化を測定できます。こんにちは、フロリダ大学の生物学部およびプロテオミクス施設のChenです。

アイソトープコートフィンタグ（ASCAとしても知られる）などの既存の方法と比較して、本研究のCTMTタグ付けの利点は、大規模にレドックス応答性タンパク質を分析しながらマルチプレックス化が可能である点にあります。このデモンストレーションでは、病原体感染に応答するトマトのレドックス調節タンパク質に関する知見を提供しますが、この実験はjoof、マウス、その他の植物や、ストレス条件の制御などの他の系にも適用可能です。私たちがこの手法を考案したのは、利用可能なタグが2種類しかないため、ICAD実験間で顕著な変動が観察されたことがきっかけでした。

ラベル付けおよび濃縮のステップは習得が困難であるため、本手法のVIRデモンストレーションは非常に重要です。効率的なラベル付けを確実にするために、ラベル付けされたサンプル間の実験的ばらつきを最小限に抑え、除去される領域を減らす必要があります。それでは始めましょう。接種源培養用として、同様のサイズの移植したトマト苗2株を直径4インチのポットで育てます。

KBMプレート上のPseudomonas syringaeの菌叢。細菌を掻き取り20 millilitersの水に加え、1 milliliterあたり約10⁶ colony forming unitsの細菌接種液を調製する。1 literの接種緩衝液を用い、4週齢の植物を細菌接種液に30 seconds間浸漬させる。

その後、すぐに透明なプラスチック袋で覆います。希望の接種時間が経過した後、完全に展開した葉を採取し、表皮側を上にして1 mg/mLのDAB染色液に入れ、15分間真空浸潤させます。次に、葉を室温の暗所で一晩インキュベートします。

次に、染色した葉を95%ethanolで10分間煮沸し、乳鉢を用いて粉砕した後、75%ethanolで保存します。回収した葉を液体窒素中で微粉末に粉砕します。その後、付随する本文に記載されている通りにフェノール抽出を行います。

次に、フェノール抽出したタンパク質を、100% methanol中の冷 0.1 molar 酢酸アンモニウム 5容量で沈殿させます。遠心分離によりタンパク質を回収し、ペレットの洗浄を行います。その後、サンプルを 1.5 milliliters の冷 70% ethanol に再懸濁し、2 milliliter マイクロ遠心チューブに移します。

遠心分離後、エタノールの上清を捨て、スピードバクでペレットを短時間乾燥させます。変性タンパク質抽出バッファーにサンプルを溶解させ、遠心分離してペレットを形成させた後、上清を回収し、メーカーのマニュアルに従ってタンパク質濃度を測定します。6種類のマスタグそれぞれについて、100 µgのタンパク質サンプルに、遊離チオール基をブロックするため、調製直後の200 mM IOアセトアミドアルキル化バッファーを等量加え、37 °Cで1時間インキュベートします。次に、タンパク質を沈殿させるため、冷やした80% アセトンを1 mL加え、-20 °Cで一晩静置します。

遠心分離によりタンパク質をペレット化し、80%アセトンで3回洗浄します。氷上でサンプルを風乾させた後、ペレットを50 µLの溶解バッファーで再懸濁します。次に、ジスルフィド結合を還元するため、100 mM TCEPを0.5 µL加え、室温で1時間インキュベートします。

試薬チューブに20 µLのアセトニトリルを加えてタグを可溶化します。ボルテックスし、遠心して集液します。次に、過剰なTCEPを除去するため、50 µLのサンプルをMicroCon 3 KDカラムにロードします。50 µLの溶解バッファーを加え、10,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離します。

サンプルを回収するため、カラムを取り出して清潔なチューブに倒立させ、遠心分離を行います。必要に応じてサンプルのpHを確認してください。1 M 塩酸を用いて、pH 7から8の間で調整します。

TMT試薬を5 µL添加し、室温で2時間反応させます。サンプルを混合し、等量のサンプルバッファーを加えて5分間煮沸し、12% プレキャストポリアクリルアミドゲルで分離します。ゲルをろ過水で3回洗浄した後、クマシーブルーで1時間染色し、タンパク質バンドの濃度に基づいて水中で一晩脱色します。ゲルの各レーンを12分画に分割します。各分画を1 mmの断片に切り分け、1.5 mLチューブに入れます。

0.1 M 重炭酸アンモニウムを含む 50% アセトニトリルでゲル片を完全に浸します。次に、100% アセトニトリルでゲル片を 15 分間覆います。液体を除去し、スピードバク（遠心濃縮機）を使用してゲル片を乾燥させます。

次に、同量のトリプシン溶液を加え、氷上に置いて再水和させます。その後、トリプシン消化のため、37 °Cで12〜16時間インキュベートします。続いて、インキュベートしたサンプルから液体タンパク質抽出液を除去します。

ゲル片を5%formic acid、50%aceto nitrileで覆い、反応を停止させ、残存しているタンパク質消化液を除去します。次に、室温で20分間ゲル片を振盪します。さらに2回抽出を行い、上清をタンパク質抽出サンプルチューブに移します。

サンプルを0.5 milliliterチューブに入れ、スピードバック（真空濃縮機）で乾燥させます。各タンパク質バンドの強度に比例した濃度のTBSを用いて、anti TMTレジンの50%スラリーを調製します。レジンを1回分のカラム量（1 column volume）の1倍TBSで3回洗浄し、その後、各サンプルに200 microlitersのTBSを加えます。

その後、anti TMTレジンに転移させ、室温で2時間攪拌し、続いて4 °Cで一晩ロッキングします。各サンプルをカラムにロードします。200 µLずつカラム洗浄を行います。

その後、各サンプルを50%溶出バッファー 200 µLで3回溶出し、真空下で乾燥させます。次に、0.1%ギ酸を含む3%アセトニトリル 12 µLにサンプルを懸濁させ、5 µLをHPLCカラムに直接注入します。付属テキストに詳述されている通り、アセトニトリルの濃度を上げるグラジエントを用いてペプチドを溶出させます。

トップ2×3ワークフローを用いて、質量分析によるペプチド検出を行います。まず、シングルステージMSを実施します。次に、高エネルギー衝突解離（HCD）フラグメンテーションによる3つのMS/MSスペクトルを取得し、続いて3つの解析を行います。

タンパク質同定のための衝突誘起解離を用いたMS/MS。分岐ワークフローを用いて質量分析データを解析します。比率を定量するためにリポーター鉄定量器を実装します。

また、MSM MSスペクトルをスペクトラムセレクター、スペクトラムノーマライザー、およびスペクトラムグルーパーノードで処理し、SeaQuest検索エンジンに対してデータをクエリします。この画像は、DABで染色した後の、左側に対照群のトマトの葉、右側にPseudomonasを接種した葉の例を示しています。DES染色プロセスにより、組織化学的染色によって葉組織内の活性酸素種の兆候を可視化できます。

予想通り、コントロールでは有意な染色は見られませんが、pseudomonasで処理した葉では過酸化水素の産生について陽性反応を示しています。この例はプロテオーム解析データの出力を示しており、各サンプルの酸化還元調節を受けたタンパク質のピーク面積により絶対定量が可能です。コントロールと接種サンプルの間のピーク面積は、相対量を示しています。

ここでは、コントロールサンプルと接種サンプルの間におけるタンパク質のレドックス調節は同様です。同程度の強度のピークは、処理の変化によって調節されないジスルフィド結合が存在することを示唆しています。この手法を習得すれば、1週間で適切に実施することが可能です。

サンプルは常に冷やし、ラベルを整理しておくことを忘れないでください。また、フェノールを使用する際は、適切な耐化学薬品手袋を着用し、本手順に従ってドラフトチャンバー内で作業するなど、十分な予防措置を講じてください。翻訳後修飾の特異的な質量分析などの他の手法を用いることで、オレイン酸やグルタチオン・シミュレーションなどの他のシステム修飾を特定することが可能です。

このビデオを視聴することで、DIBスタンディングCTMDの有効化およびredox 16の認定の実施方法について十分に理解することができるはずです。