ニワトリ胚の網膜におけるOVOエレクトロポレーションに

こんにちは、モハメド・イスラムです。私はラトガース大学生物医学工学科のLee博士の研究室に所属する大学院生です。本日は、標的網膜注射およびin vivo電穿孔法の実施方法について解説します。

本手法では、受精後4日目（炎症後約96時間）のニワトリ胚網膜を使用します。この手法は、網膜の発達研究における新規な手法と考えられています。本法は特に網膜前駆細胞を標的とするため、単一細胞レベルで全ての網膜細胞型を可視化することが可能です。

また、本手法は機能獲得または機能喪失研究にも適用可能であり、目的の遺伝子を標的として、網膜の正常な発達や疾患に関する研究を行うことができます。Xはワインセラーなどで約13 °Cで最大1週間まで保存可能です。温度が高すぎると胚に異常な発達が生じ始め、温度が低すぎると死亡率が高くなります。

インキュベートの準備ができたら、ワインクーラーから卵を取り出し、大きな方を上にして垂直に置きます。37.5 °Cのインキュベーターに入れる前に、卵を少なくとも2時間室温に置いてください。卵を約96時間（胚発生4日目にあたる）インキュベートします。

Hamburger and Hamilton stage 22の胚を得るために、ガラスキャピラリーチューブからPPマイクロピペットニードルを作成し、解剖顕微鏡下でピンセットを用いて先端を破断させ、先端の開口径が約0.1 µm、テーパー長が2 mmになるように調整します。先端径が大きすぎると卵黄膜を貫通させることが困難になり、逆に小さすぎるとDNA溶液の充填や注入が困難になります。調整したニードルを、マイクロマニピュレーターに取り付けたHamilton胃内容物吸引用シリンジに装着します。

針をシリンジに取り付けるために、マスタープレックスシリコンチューブを小さく切ったものを使用します。接続部は結紮されているため、ミネラルオイルを添加する必要はありません。この接続部分を密封するため、濃度 3〜6 µg/µL のレポータープラスミドDNA溶液 2 µL と Fast Green 0.2 µL を、周辺部で混合します。Fast Green 染料は注入の可視化に役立ちます。混合液をゆっくりと針に充填し、内膜から卵黄膜を剥離させます。卵をゆっくりと約 180 度回転させ、数分間待ちます。

その後、元の位置に戻し、エレクトロポレーションの準備をします。胚への感染を防ぐため、ピンセットと卵殻を70% ethanolで拭きます。ピンセットを用いて、気室の直上の卵殻に小さな穴を開けます。

卵殻を割らないように注意してください。小さな破片を一つずつ取り除き、小さな窓を作ります。脳や心臓に損傷を与えないよう、重要な膜に触れないように注意しながら、ピンセットを用いて内膜を慎重に取り除きます。

矢印で示されているように、眼に入り込む主要な血管束の反対側に、嘴を向くように針を配置します。生体膜、強膜、網膜、および硝子体を貫通させます。針を急激に押し込み、もし針が眼の反対側を貫通したとしても、主要な静脈を損傷していなければ問題ありません。

開口部の端でゆっくりと針を後退させ、眼球の外壁にほぼ接するように配置します。強膜と網膜の間の網膜下腔に針を刺入します。眼球の側面に緑色の溶液が充填され、膨らみができて網膜が内側に押し込まれるのが視認できるまで、DNAを注入します。

ここでは、膨隆（バルジ）が形成され、注入が成功したもう一つの良好な例を示しており、この図に描かれています。針の刺入位置が正しくなかった場合は、DNA溶液が硝子体内で広がり、眼球の中央を満たす様子が見られます。また、網膜を過度に損傷させた場合は、DNA溶液が眼球から漏れ出しているのが観察されます。

ゆっくりと針を抜き、直ちに電極を卵の中に平行に配置します。PBSで浸したあと、電極を押し下げて羊水に浸し、注入した眼が電極の間に位置するようにします。電極を配置する際、主要な静脈や心臓に触れないように注意してください。

DNAを脈絡膜下腔から網膜内の陽極方向へ輸送できるよう、陰極を注入部位に配置してください。15 voltのパルスを50 millisecondsの間、950 millisecondsの間隔で5回、網膜に電解処理します。電極を慎重に取り除き、透明なスコッチテープで卵のウィンドウを封止します。注入した卵にラベルを貼り、日付を記入してから、インキュベーターに戻してください。

通常、電気穿孔法の全工程の完了には約3〜5分かかります。GFPの発現は、電気穿孔後早ければ8時間で確認できます。ただし、卵を回収する前に、胚が目的の状態に達するまで待機しても構いません。

このビデオが、皆様ご自身の実験に役立つことを願っております。ご視聴ありがとうございました。