生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作
2012年3月9日
光による小さなGTPase活性の時空間制御の方法が記載されている。このメソッドは、ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロと写真ケージシステムに基づいています。光照射の最適化は、細胞内レベルでの低分子量GTPaseの時空間時間的制御の活性化を可能にします。
このビデオでは、紫外線を使用して原形質膜でのタンパク質の活性を操作する方法を示します。これを行うために、細胞に膜固定FRBタンパク質と目的のFK BP融合タンパク質をコットトランスフェクションします。フォトケージに入れたラパマイシン誘導体を培地に添加します。
次に、ライブセルイメージング中に、細胞の特定の領域にUV光を照射します。ラパマイシンとビオチンの間のリンカーは切断され、放出される化学二量体とその副産物である放出された二量体化剤は細胞内に拡散し、照射領域のFKBP標識タンパク質と原形質膜固定FRBとの間の二量体化を誘導します。紫外線がないと、FKBPとFRBは結合しないため、効果はありません。
データの解析により、目的のFKBP融合タンパク質は、その生理学的効果に基づいて高度に局在化していることが明らかになりました。この手法が薬理学や遺伝学のアプローチなどの既存の方法よりも優れている点は、作用速度、標的特異性、空間分解能の組み合わせです。この技術の意味は、癌細胞による移動の結果である転移性癌の治療にまで及びます。
したがって、主要な移動因子の活性を操作することで、その治療と治癒の前提条件であるその正確な分子メカニズムが明らかになるかもしれません。手順のデモンストレーションは、大学院生のChris Paul Meyerと私の研究室の技術者であるBob de Roseです。このプロトコルは、滅菌マイクロ遠心チューブプラスミド、DNA、膜テザーFRB FLUORESCENTタグ付きFKBP、TIA one、および脱イオン水に以下を組み合わせて開始し、混合物と渦に1マイクロリットルのいくつかの遺伝子HDを追加します。
チューブを室温で20分間インキュベートします。インキュベーション中に、ガラス製の8ウェルチャンバー側の各ウェルに50マイクロリットルのポリデリシンを加え、1分間インキュベートして表面をコーティングした後、溶液を吸引し、各ウェルの中央を50の脱イオン水で洗浄します。次に、トリプシンは80〜85%のコンフルエントNIH3T3細胞です。
細胞が剥離した後、10%FBSを含む10ミリリットルのDMEMを添加し、懸濁液の375マイクロリットルを15ミリリットルの滅菌チューブに移し、1,500Gで3分間遠心分離する。スピン後、メディウムを慎重に吸引します。750マイクロリットルのDMEMを10%FVSとResusで追加します。
ペレットを数回ゆっくりと上下させて吊り下げます。最後に、細胞懸濁液をトランスフェクション溶液に加え、ピペットチップを使用して穏やかに攪拌しながら、250マイクロリットルの細胞トランスフェクション懸濁液をチャンバーの各ウェルに加えます。スライドさせてインキュベートします。
摂氏37度で15時間から18時間。ケージラパマイシン、ビオチン付加物を合成するために。まず、DMSO中のCRBの1ミリモルストック溶液を滅菌フュージチューブに調製し、別の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに1ミリグラムのアバドンを溶解し、250マイクロリットルのPBSに1ミリグラムのアバドンを溶解します。
次に、ケージ部分をラパマイシンに結合させます。溶解したAVIDに0.5マイクロリットルのCRBストック溶液を数回反転させて混合し、室温で15分間インキュベートします。結合していない低分子を除外し、CRBAを精製するためのコンジュゲート溶液中のCRB AVIDを生成するには、300マイクロリットルのPBSでG 25サイズの排除カラムを精製します。
カラムが平衡化した後、5回繰り返します。125マイクロリットルのCRBA溶液をカラムの中央ベッドにロードします。次に、溶液を800 Gで2分間スピンダウンし、室温で、細胞のトランスフェクション後に1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに流れを回収します。
培地をFBSを含まないDMEMに交換して血清を飢餓状態にし、細胞を12時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を穏やかに吸引し、調製した1マイクロモルCRBA溶液を250マイクロリットル加えます。次に、生細胞内のタンパク質ダイナミクスを視覚化するには、UV照明を備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、365ナノメートルのUV LED光の光学系を結合します。
エピ蛍光光付き。UV光で励起された蛍光染料でコーティングされたガラス板を使用して、照明スポットの座標とサイズを定義します。これにより、照射する領域を微調整することができます。
100 x 対物レンズと落射蛍光を使用して、細胞をステージ上に配置したチャンバースライドを配置します。細胞にピントを合わせ、細胞を見つけます。イメージングについては、生理学的効果のバックグラウンドレベルを決定した後、細胞のイメージングを開始します。
ここでは、膜の波立たれを測定し、細胞の選択された1つの象限にUV光を照射し、ケージ外で溶解し、したがって元のラパマイシンをDMSOに溶解し、次にPBSに最終濃度400ナノモルまで溶解します。100マイクロリットルの溶液をイメージングチャンバーに追加して、全体的な効果を誘発します。15秒ごとに20分間蛍光画像を撮影し、RACの局所的な活性化が局所的なフリル形成を誘発できるかどうかを判断します。
NIH three T three細胞に、YFPタグ付きRACアクチベーターFK bp、TIA one、および膜が固定されているLDRをトランスフェクションしました。黄色の丸で示したセルの端にFRB局在照射を行った後、1063秒から1秒間、水銀ランプによる全球照射を行った。ここで見ることができるように、最初は膜のフリルはほとんど存在しませんでした。
しかし、局所的な照明の後、全球的な照明とラパマイシンの添加後に空間的に閉じ込められた波立たが見られ、これによりFK bp TIAの1つが原形質膜に移行しました。この細胞は、以前に観察された局所的なフリル形成が、空間的に閉じ込められたラックの活性化によって引き起こされたことを示した。定量解析のために、標的細胞を4つの象限に分け、このグラフに示すように、局所刺激および全球刺激後の各象限におけるフリル形成の頻度を決定しました。
観察された細胞のいずれも、放射線を伴わないCRBAまたは局所的な卵子(バルク培地中のAdenの有無にかかわらず放射線)でフリル形成を示さなかった。しかし、CRBAを添加してUV照射を行ったところ、全球放射線の全象限で約90%、第1象限のみを照射した場合、ラッフル形成の頻度は100%であったのに対し、第2象限から象限4では30%、25%、30%であった。これらの結果は、ラパマイシンの局所的なアンケージージングを使用して、単一細胞に高度に局在した生理学的効果を誘導できることを示しています。
この場合、ラックの活性化によって引き起こされる膜の波立たせです。このビデオを見れば、光によるsmall g TPAsの活動の空間的時間制御を実現する方法について十分に理解できるはずです。この方法は、原形質膜に移動する特定のタンパク質に依存するあらゆる生理学的プロセスに適用できます。
この手順を試みる際には、各手順の溶液、試薬、および細胞を新たに準備することを覚えておくことが重要です。UV光での作業は非常に危険である可能性があるため、UVメガネなどの予防措置を常に着用する必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、光を用いた小型GTPase活性の時空間制御の方法について説明しています。この技術は、ラパマイシン誘導FKBP-FRBヘテロ二量体形成と光制御システムを用いて、細胞内レベルでの正確な活性化を達成します。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生化学
背景
- 小型GTPaseは細胞内シグナル伝達において重要な役割を果たしています。
- GTPase活性を制御する従来の方法は空間的および時間的精度に欠けています。
- 光ベースの技術はタンパク質活性を操作する新しいアプローチを提供します。
- ラパマイシンは様々な生物学的応用に使用されるよく知られた化学二量体化剤です。
研究目的
- 光を用いた小型GTPase活性の正確な制御方法を開発すること。
- 細胞内レベルでのGTPase機能の理解を深めること。
- 細胞内シグナル伝達経路を研究する研究者にツールを提供すること。
使用した方法
- 細胞は膜結合型FRBとFKBP融合タンパク質で共転染されました。
- フォトケージ化ラパマイシン誘導体が培地に導入されました。
- 生きた細胞イメージング中に特定の領域にUV光を当てました。
- 照射された領域でFKBPとFRBの二量体形成が誘導されました。
主な結果
- 小型GTPase活性の時空間制御に成功しました。
- この方法により、細胞膜での標的操作が可能になりました。
- UV放射なしでは二量体形成が起こらず、特異性が確認されました。
- この技術はGTPase機能を研究する新しい道を開きます。
結論
- 開発した方法は研究者に強力なツールを提供します。
- 生きた細胞内でのタンパク質活性の正確な制御を可能にします。
- このアプローチは細胞内シグナル伝達メカニズムの理解を進めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Precise spatio-temporal manipulation of small GTPase activity enables direct interrogation of signaling pathways that drive cell migration and morphology, critical for early-stage target validation in oncology and cell biology. This method provides rapid, localized protein activation, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence at key discovery inflection points. Its ability to dissect subcellular signaling events informs portfolio decisions on pathway-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid, localized perturbation of small GTPase activity to clarify pathway function.
- Supports functional target validation by linking protein activation to immediate cellular responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating effects to specific subcellular regions.
- Improves predictive confidence for advancing targets implicated in cell migration and morphology.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of modulators affecting GTPase-driven processes.
- Delivers high spatial and temporal resolution for quantitative assay outputs.
- Enables reproducible, standardized activation protocols for comparative compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse across diverse protein targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by manipulating migration factors implicated in metastasis.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of pathway-specific interventions.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying molecular mechanisms underlying cell behavior.
- Supports translational biomarker development through precise control of signaling events.
Pipeline & Workflow Integration
This light-inducible system integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by enabling rapid, localized activation of signaling proteins.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for evaluating compound effects on targeted pathways.
- Analytics: Generates spatially resolved measurements of protein activity and downstream cellular responses.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to disease-relevant models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various protein targets and cellular contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pathway analysis.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable activation protocols.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of pathway-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and protein engineering.
- Needs access to confocal microscopy with UV illumination capabilities.
- Demands rigorous cross-team standardization of transfection and activation protocols.
- Adaptable to multiple cell types and protein targets with appropriate construct design.
- UV safety precautions and fresh reagent preparation are essential for reproducibility.
