Name: 生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶ光を用いた小さなGTPase活性の時空間制御法。フォトケージングラパマイシンとFKBP-FRB二量化系を組み合わせ、生きた細胞の細胞内レベルで秒単位のタイムスケールでタンパク質活性を精密に操作する手法です。

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本研究では、NIHの研究資金（TIへDK090868とGM092930）によってサポートされていました。ケージラパマイシンアナログの保留中の特許があります。

1。プラスミドDNAのトランスフェクション<ol><li>プラスミドDNAを追加し、0.5μgの膜係留FRB（以下、LDRと呼ばれる）と0.5μgのFKBP-Tiam1（T-細胞リンパ腫の浸潤や転移を誘発するタンパク質1：RAC活性剤）37.5μLのdH 2 Oに蛍光タンパク質でタグ付け1μlのトランスフェHDを追加します。 </li><li> 20分間室温でボルテックスし、インキュベートします。一方、ステップ1.3から1.8に進みます。 </li><li> 50μlのポリ-D-リジンで8ウェルチャンバーの各ウェルを洗浄します。 </li><li>のdH 2 Oで各ウェルの中央を洗う</li><li> 80から85パーセントコンフルエントNIH-3T3細胞をトリプシン処理し、10 mlの培地（10％FBSを含むDMEM）に希釈する。 </li><li>懸濁液375μlを削除し、3分間1750 rpmで遠心します。 </li><li>ペレットを乱さないように注意しながら、培地を吸引除去する。 </li><li> DMEMのw / 10％FBSを再懸濁し、750μlを添加します。 </li><li>のdH 2 O / DNA /トランスフェHDソリューションに細胞懸濁液を加え、穏やかに混ぜる。 </li><li> 250を追加します。各ウェルに細胞/ DNA懸濁液の液（3ウェルにいっぱいになります）。 </li><li> 15から18時間のために°C、5％CO 2で37トランスフェクションした細胞をインキュベートします。 </li></ol> 2。 CRB-溶液の調製<ol><li>ケージラパマイシン-ビオチン付加物（CRB）を合成。詳細については、 &quot;CRBの合成スキーム&quot;を参照してください。簡潔に、ケージとビオチン部分が別々に用意されています。ケージ部分は、その後、ラパマイシン（LCラボ）、その後、CRBを与えるためにクリック反応7によってビオチン部分に結合された製品に結合している。 </li><li> DMSO中のCRBの1μMのストック溶液を準備します。 </li><li> 0.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにPBS 250μlで1mgのアビジンを溶解する。 </li><li>溶解アビジンにCRBのストック溶液を1μlを追加します。反転数回混和する。 </li><li> CRB-アビジンコンジュゲート（CRB-もたらすために室温で15分間インキュベート）ソリューションを提供します。 </li><li>バインドされていない小分子を排除し、CRB-サイズ排除カラムを用いて精製する。 </li></ol> 3。顕微鏡と細胞内レベルでのライト照明<ol><li>血清は12時間FBSを含まないDMEMでトランスフェクトした細胞を飢えさせる。 </li><li>穏やかに、細胞から培地を吸引除去すると、準備400nMのCRB-ソリューション（ステップ2.6から）250μlを加える。 </li><li>ディスク顕微鏡を回転させて、光治療の前と後細胞内分解能で生きた細胞内のタンパク質の動態を可視化する（ 図2a）を用いた。 UV照度は落射蛍光光（ 図2b）と紫外LEDの光（365 nm）のための光学部品を結合させることによって達成された。 </li><li> MetaMorphソフトウェアは、15秒ごとにトランスフェクトした細胞の蛍光画像をキャプチャするために使用された。 </li><li> UV光により励起され蛍光色​​素で被覆したガラス板を使用することによって照明スポットの座標とサイズを定義します。サイズは缶異なる倍率で対物レンズを適用することにより、異なるコアサイズの光ファイバを選択することによって変化させることができます。 </li><li>膜の波打ちのバックグラウンドレベルを決定した後、細胞の周囲に照射UV光。次の2つの手順では、ローカライズされた効果の前に対比することです。 </li><li>グローバル水銀ランプによって提供された365nmの光で細胞を照射します。 </li><li> DMSOの後、PBSでuncaged、そのため、元ラパマイシン（最後の400 nM）を溶解し、グローバルな効果を誘導するイメージング室にソリューションを追加します。 </li></ol> 4。代表的な結果代表的な結果の一例を図3に示します。ローカライズの携帯端急速に誘導され形成の近くの小さな領域での紫外線照射は、照射領域と近いだけフリル。これはWHIの両方の、我々は、その後世界的に紫外線で細胞を照射し、実際に地元の活動であった、またはバルクメディアにラパマイシンを加えていることを確認するにはchは、膜全体のグローバルフリルの形成を誘導した。定量分析のために、私たちは4つの象限に標的細胞を分割し、フリル、ローカル時の各象限の形成と同様に、コントロール（図4）を含む様々な条件の下でグローバルな刺激後の周波数を数えた。それだけで、UV照射、CRB-、地元の波打ちを誘導する適切なFKBP-FRBの構成要素の組み合わせです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" /> 図1。ケージラパマイシン-アビジンコンジュゲート（CRB-A）と紫外光を用いて空間的に閉じ込められたタンパク質の二量体の模式図。 UV照射は、化学dimerizer（HE-ラパ 、C40-O-（2 -ヒドロキシエチル） -ラパマイシン）とその副産物のリリースでは、その結果、ラパマイシンおよびビオチン間のリンカーを切断する。リリースdimerizerは、細胞内に拡散し、FKBP-POI（興味のあるタンパク質）とプラズマMEMBの間に二量体化を誘導するRANEは、照射領域（青丸）の近くにFRBを固定。 UV照射することなく、FKBPとFRBは、それ故に何の効果も生産しない、（赤い十字）関連付けられているわけではない。 （著作権@ ACS2011）6 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" /> 図2。カスタマイズされた共焦点蛍光顕微鏡の画像。共焦点顕微鏡の（a）は正面図（Axiovert 200、ツァイスを反転）。 EPI蛍光およびUV照射のためのカップリングユニット（b）のクローズアップ、トップビュー。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" /> ローカライズされたUV照射により誘導されるトランスフェクトしたNIH3T3細胞の3。空間に閉じ込めフリルの形成図 。 YFPタグの付いたFKBP-Tiam1（RACアクチベーター）とLDR（FRBを膜に固定）でトランスフェクトされたNIH3T3線維芽細胞の共焦点蛍光画像は、Lとの縁の近くに狭い領域で照射を受けた15秒は、バルクメディアのCRB-共役の存在下で210秒で起動するための365 nmでEDが点灯します。この治療は1063​​年で1秒の水銀ランプとグローバルイルミネーション秒および1560秒でラパマイシン、最終的な400nmのグローバル添加した。セルは初め（）でほとんど波打ち活性を示さなかったが、空間的にローカライズされた照明（黄色の丸）（b）の後の波打ち閉じ込められた認められた。セルは、ローカルフリル形成はRacの空間的に閉じ込められた活性化によって引き起こされたことを示す、グローバルイルミネーションおよびラパマイシン（CD）を添加した後にグローバルなフリルの形成を示した。スケールバー：10μmである。 （著作権@ ACS2011）6 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" /> 図4：トランスフェクトしたNIH3T3細胞の象限のフリル形成の頻度。 CRB-と、次のグローバルUV照射は、13細胞で行われた。CRB-を使用したローカルのUV照射</strong&gt;さらに（UV照射なし）、アビジンの有無にかかわらず地元のUV照射は、それぞれ、13、5と6のセルに実装されました。観測された細胞のいずれも、UV照射、またはローカルUV照射バルクメディアのアビジンの有無にかかわらずなしCRB-とフリルの形成は認められなかった。我々は低バックグラウンドフリル形成と細胞からデータを収集しますが、これは、我々はラパマイシン（最後の400 nm）の加算の結果として、グローバルなフリルの形成を確認して、それぞれの実験の後にチェックラパマイシン誘発性フリル形成の能力を持っていた。これらの結果は、CRB-およびローカルのUV照射は、細胞内のローカルフリル形成に必要であることを示した。 （著作権@ ACS2011）6 略語： FKBP：FK506結合タンパク質 FRB：FKBP-ラパマイシン結合タンパク質 Tiam1：T-細胞リンパ腫の浸潤や転移を誘発するタンパク質1（RAC GEF） LDR：リン-DSAGリンカーFRB（リン：LynキナーゼのN末端11アミノ酸） HE-ラパ：C40-O - （2 -ヒドロキシエチル） -ラパマイシン CRB：ビオチン部分とケージラパマイシン CRB-：アビジンにコンジュゲートcrbを

<ol><li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li>
<li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTP-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li>
<li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+%28FRET%29%3A+Implications+for+signaling+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li>
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<li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific%2C+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li>
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<li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

我々は、秒の時間スケールでの正確な細胞内の場所でのRho GTPase活性を操作するために、FKBP-FRBヘテロシステムと小説ケージド化合物を一緒に採用してテクニックを説明します。 現在のアプローチの3つの制約があります。方法は、プラズマ膜を横切ってdimerizerの拡散を防止または許可に基づいているので、まず、ターゲット細胞の位置は、原形質膜またはその付近である必要があります。 CRBの化学構造のさらなる最適化は、化合物は光照射するまでの二量体化を誘導することなく細胞を入力することが可能になります。そのようなdimerizerでは、我々は理論的にはどこでも細胞内シグナル伝達分子の活性を操作することができます。第二に、化学dimerizers、FKBP-FRBの二量体複合体、またはアクティブに内因性のシグナル伝達分子の分子拡散が大幅に意図した効果の正確な閉じ込めに影響を与えることができます。この効果は、特に発音されます後の時点で、UV照射（例えば、ビーム幅、エネルギー、ビームモード（連続対パルス）など）と関係する化合物の拡散係数に関連付けられたパラメータに依存しています。これら...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ラパマイシン</td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td>トランスフェHD </td><td>ロシュ社</td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td>アビジン</td><td>シグマ</td><td> A9275-10mgの</td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマ</td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td>サイズ排除カラム</td><td> GEヘルスケア</td><td>スピントラップG-25 </td></tr><tr><td>ガラス底8ウェルチャンバー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td>紫外線LED光源</td><td>ラップオプトエレクトロニクス</td><td> UVILED </td></tr><tr><td>共焦点回転するディスク</td><td>横河電機（株） </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>浜松ホトニクス</td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100倍対物レンズ</td><td>ツァイス</td><td>プランアポクロマート</td></tr></tbody></table> CRBの合成スキーム（著作権ACS2011）6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="スキーム1" /></a> 合成条件：（a）BnBr、K 2 CO 3、DMF（b）にf.HNO 3、AcOHで（c）にTFA（d）のプロパルギル-Brを、K 2 CO 3、DMF、（e）のグリセロールは、猫。 PTSA、トルエン（F）のNaBH 3 CN、TiCl 4の 、MeCN中（G）のTf 2 O、ピリジン（h）のメタノール塩酸は、（i）のLiAlH 4、THF（J）TSCL、ピリジンのCH 2 Cl 2（K）はNaN 3、DMF（L）8、2,6 -ジ-t-ブチル、CH 2 Cl 2中 （M）13日のCuSO 4、アスコルビン酸、2 -プロパノール、H 2 O、CH 2 Cl 2で 。

生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなgtpase活性の時空間操作

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

大きな時空間精度で小さなグアノシントリホスファターゼのRhoファミリー（GTPアーゼ）の動的な制御は、様々な細胞機能やイベントの1、2のために不可欠です。その時空の動的な性質は、リアルタイム3それらの活性と局在の可視化によって明らかにされています。分子レベルでの多様な細胞機能における役割のより深い理解を得るために、次のステップは、正確な細胞内局在場所とタイミングでタンパク質の活動の摂動である必要があります。 （1）ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロおよびラパマイシン（2）写真ケージング方法：この目標を達成するために、我々は、光誘起、二つの手法を組み合わせることにより、低分子量GTPaseの時空間、時間的に制御されたアクティベーションの方法を開発した。ラパマイシン媒介FKBP-FRBのヘテロを使用すると、我々は急速に低分子量GTPase includiの活性化または不活性化を誘導するための方法を開発しましたngのRAC 4、ラパマイシンは、FRBが固定されている細胞膜に、FKBP-融合GTPアーゼ、またはそれらの活性化の移行を誘導するCdc42の4、RhoAの4とRasの5。このヘテロシステムと結合するために、我々はまた、ラパマイシン類似体の写真ケージシステムを開発した。写真ケージド化合物は、その活動ケージング基として知られている光開裂性保護基で抑制されている小分子である。完全にヘテロの活性を抑制するために、我々はセル6内の化学dimerizerとして事実上のバックグラウンド·アクティビティにつながる、結果として大規模な複合体が細胞膜を通過できないような高分子につながれているケージラパマイシンを設計しました。 図1は、我々のスキームを示していますシステム。これら二つのシステムの組み合わせにより、我々は局所的に数秒の時間スケールで形質膜へのRac活性化を採用し、細胞内レフで光誘起Racの活性化を達成しましたエル6。

光による小さなGTPase活性の時空間制御の方法が記載されている。このメソッドは、ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロと写真ケージシステムに基づいています。光照射の最適化は、細胞内レベルでの低分子量GTPaseの時空間時間的制御の活性化を可能にします。

生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

Rhoファミリーの低分子グアノシン三リン酸加水分解酵素（GTPase）を高度な時空間的精度で動的に制御することは、さまざまな細胞内...

このビデオでは、UV光を用いて細胞膜におけるタンパク質の活性を制御する方法を実演します。この手法では、細胞に膜結合型FRBタンパク質と、目的のタンパク質に融合させたFKBPタンパク質を共導入（コトランスフェクション）します。その後、培地にフォトケージド・ラパマイシン誘導体を追加します。その後、生細胞イメージング中に、細胞の特定の領域にUV光を照射します。ラパマイシンとビオチンの間のリンカーが切断されて化学的ダイマライザーとその副産物が放出され、放出されたダイマライザーが細胞内に拡散し、照射領域においてFKBP標識標的タンパク質と細胞膜に固定されたFRBとの二量体化を誘導します。UV照射がない場合、FKBPとFRBは会合せず、したがって効果は現れません。データの解析により、目的のFKBP融合タンパク質が、その生理学的な効果に基づき、高度に局所的にリクルートされることが明らかになりました。薬理学的および遺伝学的アプローチなどの既存の手法に対する本技術の利点は、作用速度、標的特異性、および空間分解能を兼ね備えていることです。本技術の意義は、がん細胞の遊走の結果として生じるがんの転移治療への応用にまで及びます。したがって、主要な遊走因子の活性を操作することで、その正確な分子メカニズムを明らかにできる可能性があり、これは治療および完治のための前提条件となります。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるChris Paul Meyerと、技術者のBob de Roseが行います。まず、滅菌済みマイクロ遠心チューブに、プラスミドDNA、膜結合型FRB、蛍光タグ付きFKBP、TIA1、および脱イオン水を混合することからこのプロトコルを開始します。この混合物に1 µLのa few gene HDを加え、ボルテックスします。チューブを室温で20分間インキュベートします。インキュベーションの間に、ガラス製8ウェルチャンバースライドの各ウェルにpoly-L-lysineを50 µL加え、表面をコーティングするために1分間インキュベートし、その後、溶液を吸引して各ウェルの中央を50 µLの脱イオン水で洗浄します。次に、80～85%コンフルエントになったNIH 3T3細胞をトリプシン処理します。細胞を剥離させた後、10% FBSを含むDMEMを10 milliliters加え、懸濁液375 microlitersを15 milliliterの滅菌チューブに移し、1,500 Gで3分間遠心分離します。遠心後、培地を慎重に吸引します。10% FVSを含むDMEMを750 microliters加え、再懸濁します。ピペッティングで数回穏やかに上下に混ぜ、ペレットを懸濁させます。最後に、細胞懸濁液をトランスフェクション溶液に加え、ピペットチップを用いて穏やかに撹拌し、チャンバーの各ウェルに細

spatio-temporal-manipulation-small-gtpase-activity-at-subcellular

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この記事では詳細はマイクロインジェクション法を用いて偏光上皮細胞における低分子量GTPaseの過剰発現と解析に関わる手順を。...

偏上皮細胞へのプラスミドのマイクロインジェクションによる低分子量GTPaseの機能を解析する

ここでは、走化性を調査するための詳細な生細胞イメージングの方法を説明します。我々は、遊走細胞のシグナル伝達事象の時空間ダイナミクスを監視するために蛍光顕微鏡の方法を提示する。シグナル伝達イベントの測定は、私たちはさらにGPCRシグナリングネットワークは真核細胞の化学誘引物質とコントロールの方向マイグレーションの勾配のセンシングを実現する方法を理解することが可能。...

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小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

蛋白質蛋白質の相互作用、生物学的システムにとって重要と拘束運動の研究は、ダイナミクスとタンパク質複合体の機能に対する洞察を提供します。蛋白質の蛍光共鳴エネルギー移動ストップト...

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。...

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

基礎研究および応用研究で広く使用されている典型的な微小管阻害剤は、細胞に広範な影響を及ぼします。最近、フォトスタチンは、微小管の瞬間的、可逆的、時空間的に正確な操作が可能な光スイッチ可能な微小管阻害剤のクラスとして登場した。この段階的なプロトコルは、3Dライブ着床前マウス胚におけるフォトスタチンの適用を詳述する。...

フォトスタチンを用いた生きた着床前マウス胚における微小管細胞骨格の時空間的細胞内操作

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

このプロトコルは、タンパク質活性の可逆的な時空間制御のための設計された青色光活性化アロステリックスイッチ(LightR)ドメインの適用について説明しています。この研究では、Srcチロシンキナーゼをモデルとして利用し、光制御Src(LightR-Src)を開発および特性評価するための精巧なプロトコルを提供します。これは、酵素クラス間でのこのアプローチの多様性を示しています。...

光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

ダイナミンスーパーファミリータンパク質の機能は、GTP加水分解と組み合わせたコンフォメーション変化に依存します。1分子FRET(smFRET)技術を用いて、異なるヌクレオチド負荷状態におけるダイナミン様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスをモニターするシステムについて記述します。...

Dynamin様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスを観察するための1分子FRETイメージング

学ぶ光を用いた小さなGTPase活性の時空間制御法。フォトケージングラパマイシンとFKBP-FRB二量化系を組み合わせ、生きた細胞の細胞内レベルで秒単位のタイムスケールでタンパク質活性を精密に操作する手法です。

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