シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

本実験の全体的な目的は、所望の特性を持つ粒子を選択することが可能な、多様性の高い合成アデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドライブラリを作成することです。これは、まず制御されたDNase I消化によってクローニング・選択されたAAVカプシド遺伝子を断片化し、続いて2回のPCR反応によりそれらをキメラ配列へと再構築させることで達成されます。第2ステップとして、得られたPCR産物を複製能を持つAAVコンストラクトに再クローニングし、少なくとも100万種類以上の異なるAAVカプシド遺伝子を含むプラスミドライブラリを構築します。

次に、このプラスミドライブラリーを2 9 3 T細胞に、アデノウイルスヘルパープラスミドと共にトランスフェクションし、標的細胞または動物個体で選択可能なキメラウイルスライブラリーを作製します。その結果、培養細胞または成マウスにおけるレポーター遺伝子の発現増強または特異性向上に基づき、新規合成A A Vベクトルの分子工学的構築および進化が成功したことが示されます。ペプチドディスプレイなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、DNAファミリーシャフリングにより、細胞結合や細胞内輸送から脱殻、核内での遺伝子発現に至るまで、AVカプシドの複数の特性を同時に変更し、改善できる可能性があることです。

本手法は、特定の治療用途に最適なベクターをどのように得ればよいか、あるいは特定の特性を担うウイルスキャプシドのドメインをどのように解析するかといった、遺伝子治療およびウイルス学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法を用いることで、HIVに対するT細胞や肝炎ウイルスに対する肝細胞など、ウイルスの標的細胞に特異的かつ強力に感染するAVベクターの分子進化が可能になるため、本技術の応用範囲はウイルス病原体による感染症を含む多くのヒト疾患の治療にまで及びます。また、本手法はAVの生物学的な知見を提供し、遺伝子治療用AVベクターの改善に利用することが可能です。

本手法は、蛍光タンパク質、3種のレポーター、細胞内酵素、あるいはRNA干渉に関与するタンパク質など、基礎研究や応用研究において重要な他の遺伝子ファミリーにも容易に適用可能です。私たちがこの手法を考案したのは、成マウスの組織片に治療用遺伝子を導入するための適切なベクターを検討していた際のことでした。その過程で、天然に存在するすべてのAVセロタイプには、ヒト集団における高い保有率に起因する免疫反応の頻発や、培養細胞への導入効率は高いもののin vivoでの性能が低いといった欠点があることに気づきました。in vitroでの肝細胞における本手法の視覚的な実演は極めて重要です。なぜなら、DNAベースのAV caps遺伝子の断片化やウイルスライブラリー作製のいくつかの工程は、経験と重要な段階への認識を必要とするため、習得が困難だからです。これにより、さまざまなアデノ随伴ウイルスキャプシド遺伝子を十分な量で日常的に調製することを容易にします。

DNAシャフリングを行うため、これらの遺伝子はまず共通のプラスミドバックボーンにサブクローニングされます。これを達成するために、まず一般的に利用可能なAAVプラスミドから、プライマーcap Fおよびcap Rを用いて、目的のcap遺伝子をPCRで増幅します。次に、これらのcap遺伝子を、特定のプライマー結合部位および制限酵素部位を含むように設計されたプラスミドにクローニングします。この例では、cap遺伝子はPAC1およびASC1部位にクローニングされます。これらの部位は、cap増幅に使用したプライマーおよび受容プラスミドに存在しますが、ほとんどのAAVには存在しません。AAVカプシド遺伝子をコードするプラスミドセットが作成されたら、T3およびT7プライマーを用いて選択したcap遺伝子を増幅し、PCRによるcapシャフリングの手順を開始します。

200 ngのcapプラスミド、最終濃度2 µMの各プライマー、10 µLの5x High Fiveバッファー、および1 µLのHigh Fiveポリメラーゼを含む50 µLのPCR反応液を調製します。この反応により約3 µgのPCR産物が得られ、ライブラリーに組み込むcap遺伝子の数に応じて、最大6回のシャッフリング反応に十分な量となります。まず95 °Cで5分間加熱し、次に94 °Cで15秒、57 °Cで30秒、68 °Cで3分間のサイクルを40回繰り返し、最後に72 °Cで10分間の最終伸長反応を行います。

PCR産物を精製した後、Kyraへの再構築に向けたcap遺伝子断片を作成するために、制御されたDNA消化を行います。この手順で最も困難な点の一つは、Kyraへの再構築に有用な特定の範囲のDNA消化cap断片を得ることです。この目的を達成するため、まず十分な量の精製cap遺伝子を準備し、条件を変えて複数の並行反応を行います。消化反応を均等に設定するには、さまざまなcap PCR産物を合計4 µgになるように54 µLの水に混合し、次に6 µLのDS反応緩衝液と0.5 µLのDNAs oneを慎重に反応液に加えます。チューブを3回転倒混和し、短時間遠心した後、直ちに25 °Cのヒーティングブロックに置きます。

この最初の反応を1分間インキュベートします。次に、2番目の消化反応を調製し、25 °Cで1分15秒間インキュベートします。このようにして、インキュベーション時間を15秒刻みで変化させ、1分から2分までの複数の並行反応を設定します。

25 millimolar EDTAを6 µL添加して、各反応を停止させます。チューブを短時間ボルテックスし、75 °Cで10分間インキュベートします。複数の並行反応により、DNAで消化された5つのキャップサンプル（インキュベーション時間を変えたもの）が得られます。標準的な1%AROSゲルを用いて、キャップフラグメントを精製してください。

理想的には、1分、45秒、または2分から開始した場合のこの例に示されているように、100から500 base pairsの間にスメアが確認されるべきです。DNAファミリーシャフリングでは、まず部分的な相同性に基づいてセルフプライミングを行うPCRにより、キャップ断片がフルレングス配列に再構成されます。精製断片500 nanograms、10 x fusion buffer 10 microliters、10 millimolar dntps 1 microliter、DMSO 1.5 microliters、およびfusion 0.5 microlitersを用いて、50 microliterの反応系を調製します。

2種類のポリメラーゼを用いて98°Cで30秒間インキュベートした後、98°Cで10秒、42°Cで30秒、72°Cで45秒のサイクルを40回繰り返し、最後に72°Cで10分間のステップを行います。次に、保存された隣接配列に結合するプライマーを用いた2回目のPCRにより、再構築されたキャップ遺伝子を増幅し、その後のクローニングに利用します。例えば、SAFおよびSAR、またはCUFおよびCURを用いて、1回目のPCR産物2 µL、各プライマー（最終濃度2 µM）、塩化マグネシウム0.5 µL、5x high-FIバッファー10 µL、およびhigh-FIポリメラーゼ1 µLを含む50 µLの反応系を構成します。

その後のクローニングに十分な収量を確保するため、16〜24回のPCRを行うことが推奨されます。PCR産物をプールし、全長キャップバンドを精製した後、次のステップとして、精製したキャップ遺伝子プールをPAC oneおよびASC oneで消化し、複製能を持つAAVプラスミドにクローニングします。レシピエントプラスミドは、AAV P5プロモーターの制御下にあるAAV2 rep遺伝子を挟むAAV逆末端反復配列、およびPAC oneとASC oneを保持しています。

repの下流にある制限酵素部位により、シャッフルされたcapプールのインフレームクローニングが可能です。矢印で示されたLSEプライマー結合部位は、cap遺伝子のシーケンシングに有用です。capフラグメントと適切に切断したレシピエントプラスミドバックボーンを3:1のモル比で混合します。最終DNA濃度が15 ng/µLとなるように、20回のトランスフォーメーションに十分な総量40 µLのマスターミックスを作成します。

16 °Cで一晩インキュベートし、翌日にライゲーション反応液をE. coliに形質転換します。2 µLのライゲーション反応液を30 µLのエレクトロコンピテントE. coliと混合し、あらかじめ冷却したエレクトロポレーションキュベットに移して氷上で静置した後、1.8 kV、200 Ω、25 µFで電気穿孔を行います。時定数は5 msに近い値である必要があります。直ちに1 mLの予熱したSOC培地を加え、250 mLフラスコに移します。

このようなエレクトロポレーションを20回行うことで、約1×10⁶種類の異なるクローンを持つダイバーシティのライブラリが得られます。プールした形質転換体に等量の予熱したSOC培地を加え、37 °C、180 RPMで1時間振盪します。その後、プールした形質転換体40 mLを、アンピシリン添加LB培地800 mLに加え、同じ条件下でさらに16時間培養し、市販のキットを用いてライブラリープラスミドDNAを精製します。

ウイルスライブラリーの作製は、HEC 2 9 3 T細胞へのa a vライブラリーのトランスフェクションから始まります。この手順を開始するために、HEC 2 9 3 T細胞を10枚の15 cm四方ディッシュに播種し、37 °Cで48時間培養します。各トランスフェクションにおいて、以下の2種類の試薬混合液を2本の別々のチューブに調製します。以下に、10枚のプレートあたりの分量を、1本目のチューブについて記載します。

7.9 mLの塩化ナトリウムとDNAを混合し、水を加えて全量を15.8 mLにします。2本目のチューブに、3.52 mLのポリエチレンイミン、7.9 mLの塩化ナトリウム、および4.38 mLの水を加えます。これらの混合液を合わせ、ボルテックスで撹拌し、室温で10分間インキュベートします。その後、溶液を2 9 3 T細胞が入った各ディッシュに均等に分注します。37 °Cでインキュベートしてください。

48時間後、ウイルスライブラリーを回収します。細胞を培地ごと掻き取り、すべてのディッシュから回収した細胞を1本のチューブにまとめ、1200 RPMで15分間遠心分離します。細胞ペレットを6 mLの溶解バッファーで再懸濁し、凍結融解サイクルを5回繰り返します。5回の凍結融解サイクル後、Ben Naseとともに37 °Cで1時間インキュベートします。

次に、細胞残渣を3,750 RPMで20分間遠心分離して沈殿させます。ペーストピペットを用いて、Beckman Quicks seal遠心チューブにウイルス懸濁液5 mLを加え、続いて15%、25%、40%の各アイソデンス溶液を1.5 mLずつ加えて、精製用の勾配を形成します。勾配の最上部まで溶解バッファーを満たし、4°Cで50,000 Kにて2時間超遠心分離を行います。

超遠心分離の完了後、チューブをローターから取り出し、チューブの外側を70% ethanolで清浄します。換気のためにチューブの上部に針を刺し、別の針を用いて40% IOL画分を1.2 milliliters分採取します。25%画分には空の粒子が含まれているため、そこから採取しないよう注意してください。

AAVカプシド。元のプラスミドライブラリーから得られた個々のクローンを用いて組換えAAVベクターを作製し、レポーター遺伝子を発現させ、その機能性と多様性を解析します。その後、培養細胞または動物に精製したウイルスを異なる量で感染させ、形質導入効率を決定します。

ここでは、シャッフルされたcap遺伝子を用いて作製された5種類の異なる組換えYFP発現AAVベクターを感染させた、3つのヒト細胞株の蛍光顕微鏡観察結果を示しています。導入効率を分析する別の手法として、蛍光リポーター遺伝子の発現をFACSに基づいて測定する方法があります。この図は、オリジナルのライブラリーからランダムに選択された18種類の異なる組換えYFP発現AAVベクターを感染させた、4種類の細胞型（ヒト腎細胞、ヒト子宮頸管細胞、マウス線維芽細胞、およびヒトT細胞）における典型的な結果を示しています。

YFPの発現を色分けすることで、可視化を容易にしました。図示されているパーセンテージは導入細胞の割合であり、黒色は0%、白色は各細胞タイプで測定された最高値を示しています。クローンB2（赤色）は、未選択のカプシドに予想される通り、全体的な効率が低いクローンの一例です。これにより、特定の細胞株または動物個体における選択を通じて、求められる特性の大部分またはすべてを備えた単一粒子をウイルスライブラリーからスクリーニングすることが可能になります。

培養細胞において、まずライブラリーのさまざまな分注量とENOウイルス5を共感染させてa a vの増殖を誘導し、その後、細胞を回収して増幅したa a vを抽出して、新たな細胞に再感染させます。細胞への共感染における最適なa a vアデノウイルス比を決定することは重要であり、強力なarius感染の指標となるのが、ウイルス接種から3日後に細胞の円形化および剥離によって認められる細胞変性効果です。この図の左上パネルは未感染の細胞を示しており、その他のパネルは、細胞1個あたりに示された粒子数分のアデノウイルスを感染させた細胞を示しています。a a vの感染および増幅を確認するためのもう一つの有用な読み取り方法は、高度に保存されたa a vカプシドエピトープを認識するB 1抗体を用いたウェスタンブロッティングによるカプシドタンパク質の検出です。

左側のブロットは、さまざまな量（µL）のa a VライブラリーおよびヘルパーENO virを共感染させた細胞を示しています。最初の2つのレーンは、a a vタンパク質の発現がほとんど検出されない条件の好例であり、これはa a vの感染と増幅が十分であるものの過剰ではないことを示しており、したがって目的とする強固な遺伝子型と表現型の連動が達成されていることを意味します。そのため、これらの上清を0.11 µLまたは10 µL使用して、新鮮な細胞に再感染させました。

ウェスタンブロットの結果を右側のセルに示します。LA cでは、陰性対照としてvのみを感染させました。また、DNAシーケンシングによって、繰り返しの感染ラウンド中のライブラリの多様性をモニタリングすることも極めて重要です。

この図は、AAV2、AAV8、AAV9に基づいたライブラリーから得られたAAVクローンの、セレクション前後のタンパク質配列の比較を示しています。赤線より上の配列は親AAVを示しています。紫色の矢印は相同組換えイベントを示しています。赤色の矢印は、すべてのセレクション済みクローンで認められたAAV2とAAV9の間のクロスオーバーを示しています。動物でのセレクションでは、AAVライブラリーを動物に注入し、PCRによって標的細胞または組織から回収した後、再びクローニングおよびパッケージングを行い、次回の感染ラウンドに用います。

ここでは、末梢ライブラリー注入の1週間後にマウス肝臓から回収した、感染に成功したAAVクローンのレスキュー例を示しています。レーン1には期待される2.2 kilobaseのバンドが見られ、レーン2はテンプレート非添加コントロールです。レーンMにおけるDNAマーカーバンドのサイズはkilobasesで示されています。選択手順に関わらず、濃縮されたカプシド変異体は、最終的に適切な系で検証される必要があります。

培養細胞において、濃縮されたAAVカイメラが優れた性能を示す例をここに示します。色が濃いほど、粒子数あたりの感染能、すなわちクローンとしての感染能が高いことを示しています。AAV-DJは、広範囲の細胞株において、8種類の天然AAV野生型の集合体よりも優れた性能を発揮します。

最後に、マウス肝臓における選択したAAV KYMERAクローンの解析結果を示します。肝癌細胞を用いてAAV DNを選択し、その後、ルシフェラーゼを発現する組換えベクターを作製しました。代表的なマウス（各群3匹）に対し、このベクターまたは対照として、マウス肝臓において最も強力な天然分離株の一つである野生型AAV8に基づいたベクターを等量末梢投与し、1週間後に解析を行いました。AAV DNクローンは肝臓における全体的な発現量はわずかに低いものの、イメージングソフトウェアで肝臓の発現レベルを調整すると、非肝組織へのオフターゲット効果が大幅に低く、この臓器に対してより特異的であることがわかります。

この手法は、適切に実施すれば、AVカプシド遺伝子の増幅から始まり、ウイルスライブラリーの完成までを1週間で行うことができます。この手順を行う際は、ここで提供されるプロトコルが天然のAVセロタイプ選択における我々の経験に基づいたものであることを念頭に置くことが重要であり、他のユーザーが独自のカスタムライブラリーを作成する場合、いくつかの条件を調整し、微調整する必要がある可能性があります。この手順以外にも、非常に多様なライブラリーを生成したり、DNAファミリーシャッフリングを用いて作成・濃縮されたカプシドの特性をさらに向上させたりするために、AGENESISによるペプチドディスプレイ部位特異的変異導入やPCRベースのランダム化などの他の手法を実施することができます。

この技術は、ウイルス遺伝子導入の分野の研究者が、HIV感染やT細胞のように従来のAAV型では十分な結果が得られなかった疾患や関連ターゲット細胞に対する治療戦略を模索することや、ヒト幹細胞およびその他の培養困難な細胞へのベクターベースの遺伝子導入を探索することを可能にしました。このビデオを視聴することで、遺伝子の断片化と再構成を組み合わせ、高度に多様な合成アデノ随伴ウイルスベクターライブラリを構築および進化させる方法に加え、遺伝子導入ベクターとして利用するために、所望の特定の特性を持つ個々のカプシドを濃縮させる目的で、これらのライブラリを培養細胞または動物内で原則的に選択する方法について深く理解できるはずです。アデノウイルスを扱う際は危険を伴う可能性があるため、この手順を行う間は多くの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。