Name: シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: 学ぶDNAファミリーシャッフルによる合成AAVカプシドライブラリーの構築法。複数の血清型からカプシド遺伝子を断片化・再構成し、100万以上のキメラ変異体を創出。遺伝子治療用ベクターの分子進化と細胞特異的標的化に応用可能。

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作者は感謝してハイデルベルク大学で優秀CellNetworksのクラスタで同様にチカとハインツシャラー（CHS）の基礎によって彼らのラボは、チームメンバーとの仕事の優れたサポートを認める。我々はDNAファミリーシャフリングを介して分子のAAVの進化は、三年前に我々の最初の出版以来、非常にアクティブなフィールドになるので、仕事に関連する出版物のすべての著者に謝罪しました感謝は、スペースの制約からここでは引用できませんでした。

<ol><li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+virus+evolution+to+vector+revolution%3A+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
<li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li>
<li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22humanized%22+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA%2Fshort+hairpin+RNA+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li>
<li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li>
<li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes%3A+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li>
<li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector%3A+directed+evolution+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li>
<li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes%3A+vector+toolkit+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li>
<li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+gene+delivery+vectors%3A+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li>
<li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li>
<li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+%28scAAV%29+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li>
</ol>

すべての著者は、開示することは何もないことを宣言します。

ここでは、DNAシャフリングを介して家族や細胞や動物の進化に不可欠な実験の手順およびAAVキャプシドエンジニアリングのためのガイドラインを概説しています。本質的には、これらのプロトコルは、2008年3我々は最初のAAVのフィールド内で報告手順の標準化バージョンです。他の人の研究のフォローアップの突風は、多くの変更、 例えば 、10から13を報告しているが、我々の現在のバージョンでは、アップスケーリングし、あらゆるニーズへの適応への従順ながら再現性のある結果をもたらす基本的な戦略を表しています。 全体の手順を標準化するために我々の努力にもかかわらず、いくつかの手順は、まだ試行錯誤ベースのアプローチを必要とします。これは特に、DNase Iで、このようなインキュベーション時間などの反応条件は、（ 図の例を参照してください。3）に非常に敏感であるという事実に起因するcap遺伝子の断片に適用されます。我々は、範囲の開始断片...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>インビトロジェン</td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン（PEI） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 408727 </td></tr><tr><td>制限酵素</td><td> NEB </td><td>さまざまな</td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td> NEB </td><td> M0202T </td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>キアゲン</td><td> 28704 </td></tr><tr><td>备考IIポリメラーゼキット</td><td> Finnzymes（NEB） </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> HotStarハイファイポリメラーゼキット</td><td>キアゲン</td><td> 202602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes（NEB） </td><td> F-540S（キットの一部） </td></tr><tr><td> EDTA（25mM）の</td><td>インビトロジェン</td><td> 18068-015（キットの一部） </td></tr><tr><td>トリス</td><td>ロート</td><td> 4855.2 </td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>ロート</td><td> K029.2 </td></tr><tr><td>のdNTP（10mMの、100μl）を</td><td>インビトロジェン</td><td> 18427013 </td></tr><tr><td>イオジキサノール（OptiPrep） </td><td>軸シールド</td><td> 1114739 </td></tr><tr><td> Phenolred </td><td>メルク</td><td> 107241 </td></tr><tr><td>プラスミドメガ準備キット</td><td>キアゲン</td><td> 12181 </td></tr><tr><td>超遠心</td><td> Beckman-Coulter社</td><td>オプティマL90K </td></tr><tr><td>クイックシールの遠心チューブ</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> 342414 </td></tr><tr><td>エレクトロ·ユニット</td><td>バイオ·ラッド</td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td> Vapo保護</td></tr><tr><td>加熱ブロック</td><td> BIOER </td><td> MB-102 </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX81 </td></tr><tr><td> FACSアナライザ</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MegaX DH10B T1R細胞</td><td>インビトロジェン</td><td> C640003 </td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ</td><td>メルク</td><td> 101695 </td></tr><tr><td>アデノウイルス-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td>プラスミドpBluescript II KS（+） </td><td>ストラタジーン</td><td> 212207 </td></tr><tr><td> cap5F（太字の黄色、cap5特異的配列のパック私のサイト）： GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td>カスタムプライマー</td></tr><tr><td> cap5R（緑、太字でcap5特異的配列のASC Iサイト）： GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td>カスタムプライマー</td></tr></tbody></table>

シャッフルdnaファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（aav）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、有益な特性の1のユニークな組み合わせにより、治療用ヒト遺伝子導入のための最も強力かつ有望な車両の一部を表しています。これらは、基礎となる野生型ウイルスと高力価、高純度、臨床グレードの組換えベクター2の生産のための高度な方法論のapathogenicityが含まれています。他のウイルス以上のAAVシステムの更なる特定の利点は、当然、まだすべて簡単に一般的なプロトコルの1,2を使用してベクトルとして操作することができる本質的な特性で異なる血清型に発生するの富の可用性です。また、私たち自身を含むグループの数は、最近、どちらか、複数の入力の血清型の資産、またはその分離、単一の特性を向上させるを組み合わせて合成ベクトルを作成するためのテンプレートとして、これらの天然のウイルスを使用するための戦略を考案した。これらの目標ARを実現するためにそれぞれの技術電子どちらDNA家族シャフ3、部分的相同性に基づいて再組み立てに続いて様々なAAVキャプシド遺伝子のつまり断片化（通常はほとんどのAAV血清型のために&gt; 80％）、またはペプチドディスプレイには通常7つのアミノ酸の4,5、 すなわち挿入ペプチドは、理想的に所望の細胞型への再ターゲティングを媒介ウイルスキャプシドの露出したループ。最大の成功のために、両方の方法は、約100万の異なるカプシド変異体のライブラリを生成するためにプロトコルがアップスケーリングされることにより、高スループットな方法で適用されます。各クローンは、その後多数の親ウイルスのユニークな組み合わせ（DNAシャフリングア​​プローチ）から構成されるか、同じウイルスのバックボーン（ペプチドディスプレイアプローチ）内の独特のペプチドが含まれています。その後の最後のステップでは、ほとんど、または選択プロセスの理想的なすべての要件を満たす個々のカプシドを濃縮するために、標的細胞上のそのようなライブラリの選択を繰り返します。後者は、好ましくは、櫛抗AAV抗体と反応するすべてのキャプシドのインスタンスを除去するための負の選択とそのような興味のある特定の細胞型の成長としてINES正圧、、、。この組み合わせは選択を生き残った合成キャプシドは、おそらく任意の天然AAV分離で発見されなかったであろう方法で、特定のアプリケーションのニーズと一致している可能性が高くなります。ここでは、DNAのファミリー2つの技術の理論と実験のより困難なようにメソッドをシャッフルに焦点を当てています。我々は、記述し、実証するシャッフルAAVライブラリの生成と選択（ 図1）の重要なすべての手順を実行し、次に1つのニーズは、分子AAVの進化を成功させるために注意すべきことのプロトコルの落とし穴や重要な側面について説明します。

我々は分子DNAファミリーシャフリングを介して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）の遺伝子治療ベクターを設計し、進化するための基本的なテクニックを示しています。さらに、一般的なガイドラインや文化やマウスの標的細胞上の強化されたプロパティを持つ個々のキメラキャプシドの選択と分析のための代表的な例を提供しています。

シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、そのユニークな特性により、ヒトへの治療目的の遺伝子導入において最も強力で有望なベクターの一つとされています。

engineering-evolution-synthetic-adeno-associated-virus-aav-gene

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここでは、生成する効率的かつ再現性のある戦略、力価、およびアデノ随伴ウイルスベクターの品質管理バッチについて述べる。それは高価にベクトル準備を取得するユーザーをことができます (1013ベクトル ゲノム/mL x ≥ 1)...

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

ここでは、細胞スタックで増殖した付着HEK 293細胞とアフィニティークロマトグラフィー精製を用いた研究用AAVベクターの大規模生産に関する詳細な手順を提供する。このプロトコルは一貫して&gt;1 x 1013...

大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成

次世代AAVの作成のための新規特性を持つ候補のバーコード化によるAAVペプチドディスプレイライブラリの生成とその後の検証。...

アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド変異体のエンジニアリング、バーコード化、スクリーニングによる次世代遺伝子治療ベクターの単離(英語)

ここでは、遺伝子治療ベクターの臨床開発を支援するために、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応によるヒト涙液中のアデノ随伴ウイルスベクターのコンプライアント検出における優れた実験室慣行の開発と検証のためのプロトコルを提示します。...

涙液のバイオシェディング研究におけるアデノ随伴ウイルスベクターの検出のための検証可能な液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応アッセイ

組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、臨床および前臨床の遺伝子導入に広く使用されています。rAAVの用途としてはあまり評価されていませんが、精製を必要とせずに培養細胞を強力に形質導入できることです。rAAVに不慣れな研究者向けに、導入遺伝子カセットクローニング、粗ベクター産生、細胞培養形質導入のプロトコルを提供しています。...

未精製組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた培養細胞における導入遺伝子発現

アデノ随伴ウイルスは浮遊細胞培養で産生され、二重ヨージキサノール密度勾配遠心分離によって精製されます。ウイルスの総収量を増やし、ウイルス沈殿のリスクを低減し、最終的なウイルス生成物をさらに濃縮するためのステップが含まれています。予想される最終力価は10,12 ウイルス粒子/mLに達し、前臨床 in vivo...

In vivoアプリケーションのためのヨジキサノール密度勾配遠心分離によるアデノ随伴ウイルスの浮遊培養産生と精製

この原稿では、最適化されたヘパリンベースのアフィニティークロマトグラフィー法を使用して、アデノ随伴ウイルスベクターを生成および精製するための詳細なプロトコルについて説明します。シンプルでスケーラブル、かつ費用対効果の高いアプローチを提供し、超遠心分離の必要性を排除します。得られたベクターは、高い純度と生物学的活性を示し、前臨床試験でその価値を証明しています。...

シングルステップおよび半自動ヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルによるアデノ随伴ウイルスベクターの単離

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターゲノムコピーの正確な定量は重要ですが、標準化されたプロトコルはまだ確立されていません。このプロトコールでは、精製されたAAVサンプルを調製し、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(dd_PCR)を実施してウイルスゲノムの力価を確実に定量するための検証済みの方法について説明します。...

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

本プロトコルは、遺伝子治療のために間葉系幹細胞(MSC)由来の細胞外小胞バイオミメティクスを製造・精製する方法を導入することを目的としています。ナノ小胞はMSC由来の脂質二重層に閉じ込められ、目的遺伝子を保持する組換えAAVを腔内に封じ込めています。このナノベシクルは生 体内...

遺伝子送達の強化を目的とした間葉幹細胞膜包覆ナノ小胞の開発

プラスミドDNAからのインフルエンザウイルスの救助は、インフルエンザの研究者がインフルエンザウイルスの生物学のさまざまな側面を研究するために組換えウイルスを生成するために、そして潜在的なベクトルまたはワクチンとして使用することを可能にする基本的かつ本質的な実験的な手法です。...

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

学ぶDNAファミリーシャッフルによる合成AAVカプシドライブラリーの構築法。複数の血清型からカプシド遺伝子を断片化・再構成し、100万以上のキメラ変異体を創出。遺伝子治療用ベクターの分子進化と細胞特異的標的化に応用可能。

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