Name: 回転壁容器バイオリアクター由来3D上皮細胞モデルの培養とその応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 学ぶ回転壁容器バイオリアクターを用いた3D上皮細胞培養法。マイクロキャリアビーズ上で細胞凝集体を形成し、in vivo様のオルガノタイプモデルを構築する技術を解説。組織工学や感染症研究への応用も紹介します。

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著者は、彼のタンパク質分析のための彼女の技術的専門知識とアンドリュー·ラーセンのためにブルックイェルムに感謝します。この作品は、代替の研究開発財団（MMHK）グラントとNIH NIAID性感染症と局所殺ウイルス剤共同研究センターIU19 AI062150-01（MMHK）によって一部で賄われていた。我々は感謝して図の再利用のための生殖の生物学を認める。

<ol><li>Herbst-Kralovetz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+comparison+of+toll-like+receptor+expression+and+responsiveness+in+primary+and+immortalized+human+female+lower+genital+tract+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia.</a> Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).</li>
<li>Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+three-dimensional+organotypic+human+vaginal+epithelial+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model.</a> Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).</li>
<li>Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www.synthecon.com/bibliography.html">http://www.synthecon.com/bibliography.html</a> (2012).</li>
<li>Khaoustov, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+three-dimensional+assembly+of+human+liver+cells+by+simulated+microgravity%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).</li>
<li>Papadaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+functional+cardiac+muscle%3A+molecular%2C+structural%2C+and+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).</li>
<li>Ishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+hepatic+tissue+architectures+from+fetal+liver+cells+obtained+from+a+three-dimensional+culture+with+a+rotating+wall+vessel+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor.</a> J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).</li>
<li>Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+for+the+study+of+attach+and+efface+lesion+formation+by+enteropathogenic+and+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli.</a> Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).</li>
<li>Nickerson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+assemblies%3A+novel+models+for+the+study+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).</li>
<li>Honer zu Bentrup, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+models+of+human+colonic+epithelium+to+study+the+early+stages+of+enteric+salmonellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis.</a> Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).</li>
<li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates%3A+alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).</li>
<li>Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+three-dimensional+organoid+model+for+evaluation+of+the+interaction+of+uropathogenic+Escherichia+coli+with+terminally+differentiated+human+urothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells.</a> Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).</li>
<li>Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Huh7+cell+culture+system+for+the+study+of+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection.</a> Virol J. 6, 103(2009).</li>
<li>Duray, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+tissue+ex+vivo+by+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi.</a> J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).</li>
<li>Margolis, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+trafficking+and+HIV+infection+of+human+lymphoid+tissue+in+a+rotating+wall+vessel+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Beer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+preclinical+testing+of+nonoxynol-9+as+potential+anti-human+immunodeficiency+virus+microbicide%3A+a+retrospective+analysis+of+results+from+five+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).</li>
<li>Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immunity+at+mucosal+surfaces+of+the+female+reproductive+tract%3A+stratification+and+integration+of+immune+protection+against+the+transmission+of+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections.</a> J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).</li>
<li>Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+identification+of+proteins%2C+mucins%2C+and+their+O-glycosylation+in+the+endocervical+mucus+during+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle.</a> Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).</li>
<li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+models%3A+Innovative+platforms+for+studying+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).</li>
<li>Vamvakidou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+breast+tumoroids%3A+An+in+vitro+assay+for+investigating+cellular+heterogeneity+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery.</a> J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).</li>
<li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+three-dimensional+tissue-engineered+bone+constructs+under+microgravity-simulated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions.</a> Artif Organs. 34, 118-125 (2010).</li>
<li>Vertrees, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+model+of+lung+cancer+using+cultured+transformed+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells.</a> Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).</li>
<li>Hwang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+murine+embryonic+stem+cells%2C+alginate+encapsulation%2C+and+rotary+microgravity+bioreactor+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 499-507 (2009).</li>
<li>Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional+cartilage+tissue+using+stem+cells+from+synovial+lining%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study.</a> Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここに提示RWVバイオリアクター技術の活用は、より生理学的に関連する器官の細胞培養モデルに、現在の細胞培養系を前進させる能力を研究者に提供することがあります。 RWVバイオリアクター細胞培養システムは、タイトジャンクション、ムチン産生、細胞外のプロセス（すなわち微）、および細胞の極性を含む生体のような特性にして3-Dの細胞凝集体を形成する細胞を可能にする低剪断の微小環境を提供します。ここで提示されたデータと例の大半はRWVシステムに成長した膣上皮細胞を使用しているしかし、RWVシステムも小腸および大腸、肺、膀胱、肝臓、扁桃上皮細胞を含む培養他の上皮細胞の種類に使われている3-D器官モデル1、7-13、18を形成する 。さらに、このシステムは、上皮細胞以外の培養細胞の種類に使用されており、複雑な、multicelの現在開発中lular器官培養モデルは、進行中の2、18である。 ここで説明するプロトコルは、ガイドとして使用することを意図されており、目的の細胞タイプに基づいて変更する必要...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®488 </td><td>インビトロジェン</td><td> A21131 </td><td> 1:500希釈で使用</td></tr><tr><td> FACSDiva </td><td> BD </td><td></td><td>フローサイトメーター</td></tr><tr><td> β-tublin抗体</td><td>カルビオケム</td><td> 654162 </td><td> 1:5000希釈で使用</td></tr><tr><td>バイオプレックス2000 </td><td> BioRad社</td><td> 171-000205 </td><td> V5ソフトウェア</td></tr><tr><td>バイオリアクターとコンポーネント</td><td> Synthecon </td><td> RCCS-4 </td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td><td> 40μmの細孔径</td></tr><tr><td>コニカルチューブ（50ml）に</td><td>コー​​ニング</td><td> 5-538-60 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td> VWR </td><td> 48366067 </td><td></td></tr><tr><td>サイトカインビーズアレイキット</td><td> BioRad社</td><td>カスタム人間キット</td><td></td></tr><tr><td> Cytodexビーズ</td><td>シグマ</td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td>ギブコ</td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> ED-500G </td><td>エチレンジアミン四酢酸</td></tr><tr><td>上皮に特異的な抗体（ESA） </td><td>ケミコン</td><td> CBL251 </td><td> 1:50希釈で使用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>ギブコ</td><td> 10438 </td><td>不活化熱</td></tr><tr><td> HARV（使い捨て） </td><td> Synthecon </td><td> D-405 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>シグマ</td><td> 258148 </td><td> 37パーセント</td></tr><tr><td>インボルクリン抗体</td&gt; <td>シグマ</td><td>私は9018 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td> VWR </td><td> 16004-368 </td><td></td></tr><tr><td> MTT試薬</td><td> MPバイオメディカル、LLC </td><td> 194592 </td><td> 3 - （4,5 - Dimethylthiazolyl 1-2）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロミド</td></tr><tr><td> MUC1抗体（顕微鏡） </td><td>サンタクルス</td><td> SC-7313 </td><td> 1:50希釈で使用</td></tr><tr><td> MUC1抗体（フローサイトメトリー） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 559774 </td><td>また、CD227と呼ばれる、テストあたり20μLを使用し</td></tr><tr><td> パラホルムアルデヒド </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15710 </td><td> DPBSで4％に希釈し</td></tr><tr><td>ペトリ皿（小） </td><td> BDファルコン</td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td>フィルタ付きポリスチレンチューブ</td><td> BDファルコン</td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td&gt;ポリスチレンフローチューブ</td><td> BDファルコン</td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> PR抗体</td><td> DAKO </td><td> M3569 </td><td> 1:100希釈で使用</td></tr><tr><td>ゴールドを長引かせる</td><td>インビトロジェン</td><td> P36931 </td><td> DAPIと取り付けメディア</td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74903 </td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> 71725 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌袋</td><td> VWR </td><td> 11213-035 </td><td></td></tr><tr><td>コック（片道） </td><td>メデックス</td><td> MX5061L </td><td></td></tr><tr><td>シリンジ（10ml）に</td><td> BD </td><td> 309604 </td><td>ルアーロックチップ</td></tr><tr><td>シリンジ（5mL）を</td><td> BD </td><td> 309603 </td><td>ルアーロックチップ</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>インビトロジェン</td><td>T10282 </td><td></td></tr><tr><td> VP5抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC-13525 </td><td> HSV-2抗体クローン6F10、1:5000希釈で使用</td></tr></tbody></table>

回転壁容器バイオリアクター由来3d上皮細胞モデルの培養とその応用

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

身体の経験、そのアーキテクチャに影響を与える環境条件、細胞間の通信、および全体的な関数の細胞や組織。 in vitroでの細胞培養モデルで正確に目的の組織を模倣するためには、文化の発展環境が考慮すべき重要な側面です。一般的に使用される従来の細胞培養システムのフラット2次元（2-D）不浸透性の表面に上皮細胞を伝播します。多くの従来の細胞培養系から学んだされていますが、多くの知見は、潜在的に生理学的に関連する微小環境の欠如の結果として、人間の臨床試験または組織外植片で再現可能ではありません。 ここでは、革新的な回転壁容器（RWV）バイオリアクター技術を用いて、2次元細胞培養の培養条件の境界の多くを克服する培養系を説明します。我々と他の器官RWVから派生したモデルはstructurを再現することが示されている同様に人間の外植組織1-6外部からの刺激への電子、機能、本物の人間の反応。 RWVバイオリアクターは、低生理流体剪断条件下で上皮細胞の増殖を可能にする懸濁培養システムです。バイオリアクターは、2つの異なる形式で、高アスペクト回転容器（HARV）または彼らは曝気ソースによって異なっている低速回転側容器（STLV）に来る。上皮細胞は、多孔質、コラーゲンコートしたマイクロビーズ（図1A）との組み合わせで、選択したバイオリアクターに追加されます。細胞がバイオリアクターの定数自由落下（図1B）の間に成長の足場としてビーズを利用しています。バイオリアクターによって提供された微小環境は細胞は、しばしば標準的な2-D培養条件（図1D）の下で観察されなかっ生体に似た特性で表示（3-D）は、3次元凝集体を形成することができます。これらの特性は、タイトジャンクショ​​ン、MUCが含まれていin vivoでのタンパク質の局在化、およびその他の上皮細胞型固有のプロパティで私たちの生産、基底/心尖部の向き、。 完全に分化した3-D集計に上皮細胞の単層からの進行は、細胞の1型、7月13日に基づいて変わります。バイオリアクターからの定期的なサンプリングでは、上皮細胞凝集体形成、細胞分化マーカーと生存率（図1D）のモニタリングが可能になります。一度細胞分化および凝集体形成が確立され、細胞がバイオリアクターから採取され、2-D細胞について行った同様のアッセイは、いくつかの考慮事項（図1E-G）で3-D集約に適用することができます。本研究では、我々はどのようにRWVバイオリアクターシステムと潜在的なアッセイおよび3-D集計を実行することができます分析の様々な文化の3-D上皮細胞凝集体への詳細な手順について説明します。これらの分析は含まれていますが、M /構造が、これらに限定されないorphological分析（共焦点、走査型および透過型電子顕微鏡）、サイトカイン/ケモカインの分泌と細胞内シグナル伝達（サイトメトリービーズアレイおよびウェスタンブロット解析）、遺伝子発現解析（リアルタイムPCR）、薬物/毒物分析と宿主 - 病原体相互作用。これらのアッセイの利用は、メタボロミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、他のアレイ·ベースのアプリケーションなど、より詳細なと広大な研究のための基盤を設定します。私たちの目標は、多様な科学的興味を持つ研究者によって使用されるように容易な、堅牢なシステムでは、 生体組織の人間を再現器官の3次元モデルを生成するために、培養ヒト上皮細胞の非従来型の手段を提示することである。

上皮細胞が3-D細胞凝集体の形成をもたらす生理的条件下で成長することができ、回転細胞培養システムが記載されています。凝集体は、ディスプレイを生成<emin vivoでの&gt;</em&gt;のような特性は、従来の培養モデルで観察され、科学的な調査の多数のためのより正確な器官のモデル系としては機能しません。

回転壁容器バイオリアクター由来3D上皮細胞モデルの培養とその応用

体内の細胞や組織は、その構造、細胞間相互作用、および全体的な機能に影響を及ぼす環境条件にさらされています。

この非従来型のプロトコルでは、ヒトの生体内組織を再現する器官型3Dモデルへとヒト上皮細胞を培養するための、簡便で堅牢なシステムを提示します。まず、上皮細胞を組織培養フラスコ内でコンフルエントな単層になるまで培養して回収し、STLVバイオリアクター内でマイクロキャリアビーズと混合します。プラットフォーム上でSTLVを回転させて低流体剪断力の一定な自由落下環境を作り出すことで、細胞をビーズに接着・増殖させ、96時間後およびその後はおよそ1日ごとに細胞凝集体を形成させます。凝集体の形成後、細胞代謝を維持するためにSDLVの培地を補充します。凝集体の形成と細胞分化が完了した後は、週に一度、光学顕微鏡で試料の画像を撮影し、分化の進行状況をモニターします。得られた凝集体を、後続の実験的解析およびアッセイのために播種します。最終的に、このシステムを用いることで、多種多様な科学的研究に適した、生体内に近い臓器様モデルシステムを構築することが可能です。従来の細胞培養などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、上皮細胞が分化し、組織のような凝集塊として極性を持つため、形態学的および機能的に実際の人組織と同様に振る舞うことです。この3Dモデルシステムは、上皮細胞の生物学、宿主と病原体の相互作用、およびシステムに導入される可能性のある細胞種間の複雑な相互作用について、さらなる知見を提供します。Dr.Andrea Radkey。私の研究室のポストドクターが、低回転横方向血管バイオリアクターの除染手順について実演します。開放ポートをルアーキャップで塞ぎます。STLVに95% ethanolを満たし、24時間平衡化させます。エタノールを除去した後、滅菌蒸留水で満たし、ベンダー提供のツールを用いて24時間インキュベートします。すべてのネジを緩め、STLVからセンタープラグを取り出します。これらを滅菌ポーチに入れ、110 °Cで20分間オートクレーブします。STLVを再組み立てし、滅菌性を確保するために除染を繰り返します。次に、STLVのネジを締めます。各ポートに、滅菌済みのワンウェイ止水栓を取り付けます。次に、10 mLおよび5 mLのルアーロックシリンジからプランジャーを取り外し、プランジャーを包装紙の中で保管します。無菌状態を維持するため、シリンジをストップコックにねじ込みます。STLVが満たされ、5 mLシリンジに充填され始めるまで、10 mLシリンジにDPBSを注入してください。その後、各シリンジに滅菌プランジャーを挿入し、シリンジのプランジャーを交互に操作して、バイオリアクター内の残存気泡を除去します。ストップコックを閉じ、STLVを回転式垂直プラットフォームに取り付けます。50 milliliterのコニカルチューブ内で漏れがないか確認するため、最低24時間回転させます。15 millilitersのDPBSを250 milligramsのcytodex microcarビーズに加え、冷却後にオートクレーブ処理を行います。上皮細胞用の培養液でDPBS洗浄を3回行います。チューブを回旋させてビーズを再懸濁させます。その後、15 millilitersの培養液でビーズを再懸濁します。まず、1×10⁷個の上皮細胞を組織培養フラスコ内で単層培養します。細胞を回収して計数し、トリパンブルー排除染色により細胞生存率を決定します。その後、準備したビーズに細胞を添加します。すべての細胞を回収するため、コニカルチューブを洗浄します。次に、STLVからDPBSとシリンジを取り除きます。また、10 mLセロロジカルピペットを使用して、センターポートからプラグを取り除きます。上皮細胞ビーズ懸濁液をSTLVにロードします。円錐チューブを一度すすぎ、すべての細胞とビーズを移行させます。その後、センターポートプラグを元に戻します。次に、5 mLと10 mLのシリンジからプランジャーを取り出し、プランジャーを包装紙の中に置いておきます。無菌状態を維持するため、シリンジのポートにオープンストップコックを取り付け、締め込みます。STLVに培地を満たします。プランジャーを交換し、ストップコックを閉じます。次に、新しく播種したSTLV培養液を37 °Cのインキュベーター内で、回転させずに30分間平衡化させます。インキュベーターからSTLVを取り出した後、ストップコックを開きます。プランジャーを使用して気泡を取り除き、ストップコックを閉じます。次に、インキュベーター内でSTLVを20 RPMの連続回転に設定します。96〜120時間後、シリンジを取り外し、STLV内のビーズと細胞を沈降させるために両方のストップコックを開いて、培地を交換します。細胞が定着したら、シリンジを用いてサイドポートから培地の約75%を抜き取り、給餌プロトコルを行います。その後も、細胞の代謝状況に応じて、必要に応じて培地を補充し続けてください。また、5〜7日ごとに凝集体の増殖と生存率をモニタリングします。凝集体のせん断を避けるため、先端から約2 cmをカットして滅菌した1000 µLピペットチップを使用します。センターポートから凝集体を200 µL慎重に回収し、1.5 mLチューブ2本に分注します。分注した一方のサンプルを用いて細胞生存率をモニタリングします。ビーズから細胞を分離させた後、トリパンブルー排除法により生存率を評価してください。細胞凝集体のイメージングのための染色。0.5から1 mLの培地を2つ目の1.5 mLの凝集体分注量に加え、カットオフチップを用いて小型ペトリ皿に移します。1000 µLピペットチップを用いて凝集体をイメージングします。一部の上皮細胞モデルで倒立光学的顕微鏡を使用する場合、凝集体の回収約1週間前に、培養の通気性を高めるために凝集体を使い捨てのハーフ（容器）に移行させる必要があります。分析を行う際は、STLVからシリンジを取り外し、サイドポートから培地の約50%を捨てます。センタープラグを取り外し、中央ポートからすべての内容物を50 milliliterのコニカルチューブに慎重に注いでください。STLVを5 mLの培地で2回すすぎ、すすぎ液を回収した凝集塊と合わせます。次に、凝集塊を50 mLコニカルチューブからHarvに移動します。1週間後、分化したヒト上皮凝集塊がSTLVバイオリアクターシステムで育成されたため、潜在的なアッセイ形式、アッセイおよび分析に向けて慎重に凝集塊を回収します。SEMおよびTEM画像は、STLVで39日間培養したヒト腟細胞から収集したものである。3D凝集体は組織と同様の超微細構造的特徴を示しており、微小隆起、陥入、細胞内分泌小胞、および頂端面のマイクロヴィリが確認できる。3D腟細胞の共焦点免疫蛍光顕微鏡画像は、ムチンおよび上皮細胞と終末分化に特異的なマーカーの発現を示している。これらの生理学的に適切な表現型は、化合物の毒性を評価するための優れたプラットフォームとしても機能する。細胞の生存率、代謝、または増殖を測定するために一般的に用いられるMTTアッセイは、さまざまな化学物質や化合物の毒性を測定するために使用できます。あるいは、トリパンブルー排除法により、試験化合物の処理後の毒性を測定することも可能です。本例では、NONOXINOL nineによる処理後、膣凝集塊は子宮頸部外植モデルと同様の毒性反応を示しましたが、単層培養とは異なるプロファイルを示しました。これらの3D凝集塊は機能的な応答性を示します。例えば、 Toll様受容体によって認識される微生物由来の分子による刺激を受けると、凝集塊は応答し、IL-6タンパク質を含む前炎症性サイトカインを分泌し、プロゲステロン受容体の転写産物を発現します。また、腟細胞においてホルモン刺激に応答する受容体も観察されます。これらの3D凝集塊は、病原体やホルモン分子に反応する能力を持つだけでなく、単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）の感染を機能的にサポートすることも可能です。HSV-2に感染した3D腟凝集塊の共焦点顕微鏡画像により、感染が確認されます。また、凝集塊内の個々の細胞の物理的および機能的特性は、フローサイトメトリーによって定量化することができ、例えば、個々の腟細胞におけるMUC1の表面発現を測定するためのフローサイトメトリーアッセイなどが挙げられます。3D膣凝集塊は、単層培養での分化後と比較して、表面におけるMuc1の発現率が低いことが示されました。この手法により、組織生物学および感染症分野の研究者は、構造や刺激に対する生理学的反応を研究することが可能になりました。これらの器官型モデルを用いることで、ヒトの生物学的特性をより正確に再現することができます。

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学ぶ回転壁容器バイオリアクターを用いた3D上皮細胞培養法。マイクロキャリアビーズ上で細胞凝集体を形成し、in vivo様のオルガノタイプモデルを構築する技術を解説。組織工学や感染症研究への応用も紹介します。

回転壁容器バイオリアクター由来3D上皮細胞モデルの培養とその応用

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