回転壁容器バイオリアクター由来3D上皮細胞モデルの培養とその応用

この非従来型のプロトコルでは、ヒト生体内の組織を再現するオルガノタイプ3Dモデルへとヒト上皮細胞を培養するための、簡便かつ堅牢なシステムを提示します。まず、組織培養フラスコ内で上皮細胞をコンフルエントな単層まで培養して回収し、STLVバイオリアクター内でマイクロキャリアビーズと混合します。プラットフォーム上でSTLVを回転させて、低流体剪断力の一定な自由落下環境を作り出すことで、細胞をビーズに付着・増殖させ、96時間後およびその後はおよそ1日ごとに細胞凝集体を形成させます。

凝集体の形成後、細胞代謝を維持するためにSDLV内の培地を補充し、凝集体形成と細胞分化が完了した後は、週に一度、光学顕微鏡でサンプルを画像化して発生の進行状況をモニタリングします。その後、下流の実験的解析およびアッセイのために凝集体を播種します。最終的に、このシステムにより、多岐にわたる科学的研究のための生体内に近い臓器型モデルシステムを構築することが可能です。

従来の細胞培養などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、上皮細胞が分化して組織のような凝集体へと極性化するため、形態学的および機能的に本物のヒト組織と同様の挙動を示すことです。この3Dモデルシステムは、上皮細胞の生物学、宿主と病原体の相互作用、およびシステムに導入される可能性のある細胞種間の複雑な相互作用について、さらなる知見を提供します。アンドレア・ラドキー博士。

私の研究室のポストドクターが、低回転側方血管バイオリアクターの除染手順を実演します。開放ポートをルアキャップで塞ぎます。STLVに95%ethanolを満たし、24時間平衡化させます。

エタノールを除去し、滅菌蒸留水を満たした後、ベンダー提供のツールを使用して24時間インキュベートします。すべてのネジを緩め、STLVからセンタープラグを取り外します。これらを滅菌ポーチに入れ、110 °Cで20分間オートクレーブ滅菌します。STLVを再組み立てし、無菌性を確保するために除染を繰り返します。

次に、STLVのネジを締めます。あらかじめ滅菌済みのワンウェイストップコックを各ポートに取り付けます。次に、10 mLおよび5 mLのルアーロックシリンジからプランジャーを取り外し、プランジャーを包装紙の中に置いておきます。

無菌状態を維持するため、シリンジをストップコックにねじ込みます。STLVが満たされ、5 milliliterシリンジに液が入り始めるまで、10 milliliterシリンジにDPBSを加えます。次に、各シリンジに滅菌プランジャーを挿入し、シリンジのプランジャーを交互に押し出すことで、バイオリアクター内の残留気泡を除去します。

ストップコックを閉め、STLVを回転式垂直プラットフォームに取り付けます。50 mLコニカルチューブ内で漏れがないか監視するため、最低24時間回転させます。250 mgのCytodex microcarビーズに15 mLのDPBSを加え、冷却後にオートクレーブ滅菌します。

上皮細胞用の培養液を用いて、DPBSによる洗浄を3回行います。チューブを回転させてビーズを再懸濁させます。その後、15 millilitersの培養液でビーズを再懸濁します。

まず、1×10⁷個の上皮細胞を組織培養フラスコ内で単層培養します。細胞を回収して計数し、トリパンブルー排除染色により細胞生存率を判定します。その後、細胞を調製済みのビーズに添加します。

すべての細胞を回収するため、コニカルチューブを洗浄します。次に、STLVからDPBSとシリンジを取り除きます。また、10 mL セロロジカルピペットを使用して、センターポートからプラグを取り除きます。

上皮細胞ビーズ懸濁液をSTLVにロードします。コニカルチューブを1回すすぎ、すべての細胞とビーズを転送します。その後、センターポートプラグを元に戻します。

次に、5 mLと10 mLのシリンジからプランジャーを取り外し、プランジャーを包装紙の中に戻します。無菌状態を維持するため、シリンジのポートにオープンストップコックをねじ込みます。STLVに培地を満たします。

プランジャーを交換し、ストップコックを閉じます。次に、新しく播種したSTLV培養液を37 °Cのインキュベーター内で、回転させずに30分間平衡化させます。インキュベーターからSTLVを取り出した後、ストップコックを開きます。

プランジャーを使用して気泡を取り除き、ストップコックを閉じます。次に、インキュベーター内でSTLVを20 RPMの連続回転に設定します。96〜120時間後、シリンジを取り外し、STLV内のビーズと細胞を沈降させるために両方のストップコックを開いて培地を交換します。

細胞が定着したら、シリンジを用いてサイドポートから培地の約75%を吸い出し、供給プロトコルを実行します。その後も、細胞の代謝状況に応じて必要に応じて培地を補充し続けてください。また、5〜7日ごとに凝集体の増殖と生存率をモニタリングします。

凝集体のせん断を避けるため、先端から約2 cmを切断し、滅菌した1000 µLピペットチップを使用します。センターポートから凝集体を200 µL慎重に採取し、1.5 mLチューブ2本に分注します。分注した液の一方を細胞生存率のモニタリングに使用します。ビーズから細胞を分離した後、トリパンブルー排除法により生存率を評価します。

細胞凝集体のイメージングのための染色。2つ目の1.5 mLの凝集体分注量に0.5〜1 mLの培地を加え、カットオフチップ付きの1000 µLピペットを用いて小型ペトリ皿に移し、凝集体をイメージングする。

一部の上皮細胞モデルにおいて倒立光顕微鏡を使用する場合、凝集体の回収に約1週間前から、培養の通気を改善するために凝集体を使い捨ての容器に移し替える必要があります。解析を行う際は、STLVからシリンジを取り外し、サイドポートから培地の約50%を捨てます。センタープラグを取り外し、中央ポートからすべての内容物を50 milliliterのコニカルチューブに慎重に注ぎ入れます。

STLVを5 mLの培地で2回洗浄し、洗浄液を回収した凝集体と合わせます。次に、凝集体を50 mLコニカルチューブからHarvに移します。1週間後、分化したヒト上皮凝集体をSTLVバイオリアクターシステムで培養し、潜在的なアッセイ形式、アッセイ、および分析のために凝集体を慎重に回収します。

SEMおよびTEM画像は、STLVで39日間培養したヒト腟細胞から収集したものである。3D凝集体が、組織と同様の超微形態的特徴（微小隆起、陥入、細胞内分泌小胞、および頂端面の微絨毛）を示すことに注目されたい。3D腟細胞の共焦点免疫蛍光顕微鏡画像は、ムチンおよび上皮細胞および終末分化に特異的なマーカーの発現を示している。これらの生理学的に関連した表現型は、化合物の毒性を評価するための優れたプラットフォームとしても機能する。

細胞生存率、代謝、または増殖の測定に一般的に用いられるMTTアッセイは、さまざまな化学物質や化合物の毒性を測定するために使用できます。あるいは、トリパンブルー排除法によって試験化合物処理後の毒性を測定することも可能です。この例では、NONOXINOL nineでの処理後、膣凝集塊は子宮頸部外植えモデルと同様の毒性反応を示しましたが、単層培養とは異なるプロファイルを示しました。

これらの3D凝集塊は機能的な応答性を示し、例えば、toll-like受容体によって認識される微生物由来の分子で刺激すると、応答してIL-6タンパク質などの前炎症性サイトカインを分泌し、プロゲステロン受容体の転写発現が認められます。また、膣細胞において、ホルモン刺激に応答する受容体も観察されます。

この3D凝集塊は、病原体やホルモン分子に応答する能力を持つだけでなく、単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）の感染を機能的に維持させることが可能です。HSV-2に感染した3D腟凝集塊の共焦点顕微鏡画像により、感染が確認できます。また、凝集塊内の個々の細胞の物理的および機能的特性はフローサイトメトリーによって定量化でき、例えば、個々の腟細胞におけるMuc1の表面発現を測定するフローサイトメトリーアッセイなどが挙げられます。

3D膣凝集塊は、単層培養での分化後と比較して、表面におけるmucin 1の発現率が低いことが示されました。この手法により、組織生物学および感染症分野の研究者は、構造や刺激に対する生理的反応を研究することが可能になりました。これらの器官類似モデルを用いることで、ヒトの生物学的特性をより正確に再現することができます。