組合せの合成と高分子膜とナノ粒子のライブラリからのハイスループットタンパクリリース

このビデオでは、生分解性ポリ無水物フィルムとナノ粒子ライブラリーのコンビナトリアル合成と、これらのライブラリーからのタンパク質放出のハイスループット検出について説明します。まず、ガラスキュベットに組成的に多様なモノマーを堆積するために使用されるハイスループット自動堆積装置。ポリ縮合反応は、摂氏180度、0.3°Cで1.5時間行われます。

これらの反応条件は、C-P-H-S-Aポリ無水物ポリマー合成に特異的です。自動蒸着装置を使用して、溶媒とカプセル化用の任意の成分がポリマーライブラリーを含むキュベットに堆積されます。超音波処理は、ポリマーの完全な溶解および追加成分の均一な分散を確実にするために投与することができる。

次に、溶解したポリマーを非溶媒のチューブに移し、ナノ沈殿によってナノ粒子ライブラリーを作製します。ナノ粒子は、真空乾燥または濾過によって回収され、次いで、改質された96ウェルリリースプレートに移される。最後に、タンパク質をロードしたライブラリーを生理学的条件下でインキュベートし、蛍光空間検出法を用いてタンパク質放出速度を評価します。

最終的には、ポリマーの特性または放出環境条件の関数としてタンパク質放出速度を示す結果を得ることができます。このアプローチが他の従来の一度に1つのサンプルの手法と比較した場合の主な利点は、複数のサンプルを同時に合成できることです。その後、これらのサンプルをハイスループットでスクリーニングし、タンパク質ポリマー、細胞ポリマー、または宿主ポリマーの相互作用を調べることができます。

これにより、薬物送達や組織工学のためのこれらの生体材料の合理的な設計と開発が促進されます。手順を実演するのは、私の研究室の術後であるLa Tricia Petersonです。ビデオのこのセクションでは、ハイアットスループット堆積装置を使用して、ポリマー合成後に組成的に異なるモノマーライブラリーを堆積させます。

この装置は、ブランクまたはタンパク質をロードしたポリマーフィルムまたはナノ粒子の組み合わせライブラリを製造するために使用されます。自動化されたプラットフォームは、2つのプログラム可能なシリンジポンプと、コンピューター上のコンピューターに直列に接続された3つのリニアアクチュエーターで構成されています。LabVIEWソフトウェアは、シリンジポンプとアクチュエータにコマンドを指示するために使用されます。

10 ccのガスタイトシリンジは、ルアーロックフィッティングを介して接続された金属キャピラリーチューブを備えたシリンジポンプにロードされ、ポリマー溶液をガラスキュベットに分配します。このデモンストレーションでは、seic acidまたはSAをone six Biss para oxy heaneまたはCPHとともに使用して、Texas Red Boan血清アルブミンをカプセル化するナノ粒子のライブラリを作成します。このビデオの手順と付属のドキュメントは、さまざまなポリマーフィルムおよびナノ粒子ライブラリを製造およびテストするために適合させることができます。

ライブラリーを合成するには、まず、各モノマーとクロロホルムを最終濃度25ミリグラム/ミリリットルでガラスバイアルに溶解します。次に、シリンジのルアーロックエンドを通して溶液を吸引することにより、各溶液を10 ccガスタイトシリンジにロードします。気泡を取り除きます。

次に、耐溶剤性ルアーロックステンレス鋼キャピラリーチューブをシリンジの端に取り付けます。キャピラリーチューブをクランプに固定し、リングスタンドに取り付けます。次に、両方のキャピラリーチューブの端を開始ベテに配置します。

モノマー成膜用。シリンジをプログラム可能なシリンジポンプに置き、ラボビューソフトウェアで所定の位置にロックします。ソフトウェアでリニアアクチュエータを開始位置に設定します。

SAおよびCPHモノマーのガラスキュベットへのx、y、Z軸への自動蒸着を開始します。アクチュエーターは、キャピラリーチューブを各Qに適切に配置し、各モノマーのプログラムされた量をそれらに注入して、組成的に異なるモノマーライブラリを作成します。モノマー堆積後。

モノマーライブラリーを予熱した真空オーブンに移し、摂氏180度、0.3ツアーで1.5時間インキュベートして、縮合重合を可能にします。インキュベーション後、ポリマーライブラリーの作製が完了します。次に、タンパク質を担持したポリマーナノ粒子が生成されます。

タンパク質をロードしたナノ粒子ライブラリーを作製するためのタンパク質ロードポリマーフィルムライブラリー作製については、添付のプロトコールを参照してください。この場合のタンパク質、テキサス赤ウシ血清アルブミンを適切な溶媒に添加すると、ポリマーライブラリーを溶解できるはずです。ここでは、塩化メチレンは1ミリリットルあたり2ミリグラムの濃度で使用されます。

10 ccシリンジにTexas Red BSA含有溶媒を充填し、最初のシリンジポンプに入れます。次に、清潔で空の2ccシリンジを2番目のシリンジポンプに入れ、15ミリリットルの非溶媒(この場合はペンタン)を含むチューブをバイアルプラットフォームに隣接するチューブホルダーに入れます。次に、ラボでは、ソフトウェアを表示して、プログラムを選択して自動溶媒蒸着プロセスを開始します。

プログラムの開始後、溶媒はポリマーライブラリーを含むキュベットに堆積され、ポリマー濃度は1ミリリットルあたり20ミリグラムになります。すべての溶媒が堆積したら、ポリマーを1〜5分間溶解させます。これに続いて、オプションのシンジケーションを行い、ポリマーの完全な溶解と均一なタンパク質分散を確保します。

次に、ラボビューでサンプル転送プログラムを開始します。その後、ライブラリー内の溶解した各ポリマーサンプルを空のシリンジに引き出し、サンプルホルダー内の対応する非溶媒チューブに分注します。各サンプルが移されたら、ナノ粒子ライブラリーを水銀真空10mmの真空チャンバーに入れるか、溶媒が除去されるまで真空ろ過を使用して、タンパク質を充填したナノ粒子を回収します。

カプセル化されたBSAの放出を調査するには、プレート内の他のすべての隣接するカラムの各ウェル壁の上半分インチを削除することによって変更された深い96溶接ポリプロピレンプレートから始めます。列AとB列、C列とDENFとGNHの間の各ウェルの上部を取り外すと、全容量移動まで充填されたときに、隣接するウェルの各ペア間の液体の流れが可能になります。テキサスレッドBSA標準は、ミリリットルあたり1000〜10マイクログラムの範囲で、ディープ96ウェルプレートに

これらは、タンパク質量の計算に使用され、PBS緩衝液中のナノ粒子の所望の質量を再構成し、次いで超音波処理して粒子を均一に分散させる蛍光色素の消光も考慮します。次に、ナノ粒子ライブラリーをディープ96ウェルプレートに移し、サンプルがウェルプレートの底に沈殿するまで待ちます。次に、ピペッターを使用して、ウェルの上部から最大4分の1インチまで、隣接するすべてのウェルにPBSバッファーをゆっくりと満たします。

隣接する井戸には、井戸間を自由に流れるように十分なバッファーが必要です。次に、剥離板を蓋で密封し、攪拌しながら摂氏37度に置きます。増分ポイントでの実験期間中は、9, 400 Typhoonフラットベッド蛍光スキャナーを使用して、適切な励起、レーザー、および発光フィルターを使用してプレートをスキャンします。

スキャン後、画像定量ソフトウェアを使用して、各リリースで放出された蛍光色素標識タンパク質の量を定量化します。さて、Texas Red BSAは、このビデオで説明されているように、SAおよびCPHモノマーから合成されたポリマーナノ粒子ライブラリにカプセル化され、ポリマー化学の関数としてのタンパク質放出速度を決定しました。タンパク質をロードしたナノ粒子を摂氏37度で1ヶ月間インキュベートし、その間、タンパク質放出の定量化のために、増分ポイントで蛍光スキャンを取得しました。

ここに示すように、このハイドロスループット法は、A-C-P-H-S-Aポリ無水物ナノ粒子ライブラリーからのテキサスレッドBSA放出速度を決定するために利用されました。化学依存性の傾向は、Sarichフィルムケミストリーからの放出速度の増加とともに観察されました。標準的なタンパク質定量アッセイを使用した場合も同様の結果が得られました。

別の実験では、CPT CPHポリ無水物フィルムライブラリからのテキサスレッドBSA放出は、ここに示すように、ほぼゼロ次の放出速度が観察され、cpegリッチフィルムはタンパク質を最も急速に放出し、生分解性薬物送達デバイスとして医療分野での潜在的なアプリケーション。これらの結果は、高分子化学を変化させることにより、治療薬またはワクチン抗原の所望の放出プロファイルを制御できることを示しています。この手順に続いて、タンパク質の安定性、細胞毒性、細胞活性化、InVivo生体内分布などの領域を調査するために、他の組み合わせ法が開発されました。

これらの側面は、薬物送達および組織工学のための生体材料の合理的な設計にとって重要です。このプロトコル全体を通じて、適切なPPEを着用し、安全な実験室手順を実践することを忘れないでください。