Name: 組合せの合成と高分子膜とナノ粒子のライブラリからのハイスループットタンパクリリース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶ、生分解性ポリアンヒドリド膜とナノ粒子ライブラリの組合せ合成法とタンパク質放出のハイスループット検出法。この手法により、創薬や組織工学向けバイオマテリアルの迅速な設計開発が可能になる。

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著者らは、財政支援のためのONR-MURI賞（NN00014-06-1-1176）と米陸軍医学研究および資材コマンド（グラントNo W81XWH-10-1-0806）を認める。この材料はグラントNo EEC 0552584と0851519の下で国立科学財団によってサポートされた仕事に基づいています。

1。コンビナトリアルライブラリー合成ポリマーは、（高分子化学に変化させる） -ロボットのセットアップについては図1を参照してください。 <ol><li> （濃度= 25 mg / ml）を、適当な溶媒中で、各モノマーを溶解し、10ccのガスタイトシリンジにそれぞれロードします。 </li><li>各注射器の最後に溶媒耐性ルアーロックキャピラリーチューブを取り付けます。 </li><li>シリンジポンプ（新時代プログラマブルシリンジポンプ）に注射器を所定の位置にロックします。 </li><li>開始位置にリニアアクチュエータ（Zaber）を設定します。 </li><li>リングスタンドのクランプを使用して、モノマーの堆積の開始バイアル/ウェルに両方のキャピラリーチューブの端を置きます。 </li><li>そのよく所望の共重合体の組成に応じてそれぞれにポンプ各モノマーの可変ボリュームをLabVIEWプログラムを開始します。これは、目的のボリュームを分配するためにバイアル/ウェルとし、各ポンプにキャピラリーチューブを下げるためにZ軸アクチュエータを指示することにより、プログラムの中で達成されます。ねーXTは、プログラムは次のバイアル/ウェルの位置に移動するために、そのホームポジションとX軸とYアクチュエータに戻り、Zアクチュエータに指示します。各ウェルは、モノマーの所望の体積がそれに振り込まれるまで、これが行われている。 </li><li>モノマーの堆積後、マルチウェルまたはマルチバイアルモノマーライブラリは、予備加熱真空オーブンに転送され、縮重合反応の持続時間のために真空下でインキュベートした。 CPHの場合：SAの合成反応は、180℃で実施する1.5時間のためのC、0.3トルが、これらの反応条件が異なるポリマーシステム間で異なります。 </li></ol> 2。コンビナトリアルブランクおよびタンパク質-ロードされたポリマーナノ粒子及びフィルムライブラリーの作製-ロボットのセットアップについては図1を参照してください。 <ol><li>最初のプログラマブルシリンジポンプ、シリンジ、溶媒（空白のライブラリ）で満たされているか、またはタンパク質を用いた溶媒は、第二注射器で注射しながら（タンパク質 - ロードされたライブラリ）に分散ポンプが空のままになっている。隣接したサンプルホルダー内のナノ粒子製造用のチューブ（非溶媒を別の溶媒の比率は1から100です）、非溶媒で満たされている。映画製作のための空のマルチウェルプレートは、隣接する試料ホルダーにチューブの代わりに利用されています。 </li><li> LabVIEWプログラムを使用し、溶媒は、ライブラリのすべてのポリマーバイアル/ウェルに堆積（濃度= 20 mg / ml）を、1〜5分間インキュベートする。オプションの超音波処理ステップ（40 Hzで30秒）が完了したポリマー溶解を確実に導入することができる。 </li><li>次に、個別のLabVIEWプログラムを開始することによって、サンプルが空の注射器内に引き込まれており、隣接する試料ホルダーに非溶媒（ナノ粒子）または空の井戸（フィルム）のそれに対応する管に堆積した。 </li><li>このプロセスは、個別のポリマーライブラリの各組成物について行われている。 </li><li>ナノ粒子またはフィルム·ライブラリーは、次に溶媒と非溶媒除去（ナノ天秤座のために真空チャンバ内に配置されているRYも）真空ろ過を使用して回復できます。 </li></ol> 3。ハイスループットなタンパク質の放出動態<ol><li> 、ポリマーライブラリーからハイスループットタンパク質の放出動態を調査するための96（2ミリリットル/ウェル）ディープかなって、ポリプロピレン板が変更されているように、上部隣接する列の井戸の壁の1/3（例：AとB、 CとD、EとF、G及びH）をウェルに隣接して削除されます。タンパク質にロードされたフィルムはで作製またはナノ粒子は、高スループットの放出動態の研究を実行するために、このプレートに移さなければなりません。タンパク質にロードされたナノ粒子またはフィルムサンプルは唯一の隣接する列（A、C、E、およびG EX）の1つのウェルに配置する必要があります。詳細については、 図4を参照してください。 </li><li> 96深いかなっリリースプレートにナノ粒子の移転後、粒子を沈降させています。 PBS緩衝液（0.1mMの液、pH7.4）を徐々に（列A、C、EとG）の各サンプルウェルに添加し、その後、それぞれの隣接ウェルに（列A、B、D、F、およびH）の井戸がいっぱいになると、バッファが隣接している井戸の間を流れる解放されるまで。ナノ粒子の場合、このプロセスでは、粒子がサンプルウェルの底部（列A、C、EとG）のままとよく隣接リリースに移す（列A、B、D、Fのないことを確認するために余分な注意を払って行う必要がある、およびH）。いくつかのケースでは、遠心分離（カラムA、C、EとG）サンプルウェルの底部にナノ粒子のサンプルを定位させることが求​​められる。 </li><li>次に、リリースプレートは蓋で密閉し、実験期間中に撹拌しながら所望の温度（ すなわち 37℃）に配置されます。 </li><li>増分の時点（ すなわち 0.04、1、2、3、5、7、9、12、15、19、24、30日）にリリースさ蛍光標識タンパク質の量は、9400台風フラット蛍光スキャナーを用いて定量化されている（ GEヘルスケア）。リリースプレートは、スキャナの表面上に配置され、適切な励起レーザーや発光filteを使用してスキャンRS、およびリリースウェル（列A、B、D、FおよびH）でリリースされたタンパク質の蛍光強度（イメージクワント）定量化される。これは、既知の濃度のタンパク質標準は蛍光消光のためのタンパク質量とアカウンティングを計算するためのウェルプレートに含まれていることが示唆された。 </li></ol> 4。代表的な結果ポリマーライブラリの製作時には、キャラクタリゼーションはこのコンビナトリアル手法1,7,8,11を検証するために、1 H NMR、GPC、およびFTIRを用いて行われています。 10,000〜20,000の分子量の範囲は、g / molで、多分散指数の範囲は1.5から3.0で、化学組成は、正確かつ無水物の合成12月15日 、従来の方法との合意であることが示されている。同様に、ナノ粒子のライブラリのSEM画像は、従来から製造されたナノ粒子のその2と同様の表面形態、サイズ、サイズ分布を示した。タンパク質リリースkineti無水物ナノ粒子またはフィルムからのCSは、以前説明したように修正された1ウェルプレート中で行われる。結果は、タンパク質のローディングおよび高分子化学（ 図2及び図3）1,12,14,16依存バーストの有無にかかわらず近似ゼロ次の放出を明らかにした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" /> 図1コンビナトリアル高分子膜とナノ粒子の製造装置。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" /> 図2 CPHからアルブミンテキサスレッドウシ血清（TRBSA）のハイスループットリリース：SAのポリマーナノ粒子のライブラリ。 CPH-リッチポリマーの化学的性質は最も遅いを離すのに対し、SA-リッチポリマーの化学的性質は、最も急速にTRBSAカプセル化解除してください。エラーバーは標準偏差を表すると、n = 4である。ピーターセンらの許可を得て転載。ら 1。著作権2010 American Chemical Societyの。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" /> 図3 CPTEGからアルブミンテキサスレッドウシ血清のハイスループットリリース（TRBSA）：CPHポリマーフィルムライブラリ。 CPH-リッチポリマーの化学的性質は最も遅いを離す一方CPTEG富む高分子化学は、最も急速にTRBSAカプセル化解除してください。エラーバーは標準偏差、n = 3の場合を表しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" /> 図4： &quot;の前に&quot;隣接する二つの井戸を示す画像と96ディープかなっポリプロピレン板で&quot;の後に&quot;修正。右側の &quot;後&quot;修正画像も、カプセル化された蛍光分子を有するポリマーフィルム（左の井戸の底）を添加することを示して緩衝溶液中に2ウェル間で放出される。放出された蛍光分子は、その後よく右側で検出される。

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
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<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
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<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

必要な合成条件と合成されるポリマーのガラス転移温度（Tg s）の知識は、ライブラリの製作のために不可欠です。 T gはsが室温以下である場合には、ナノ粒子の製造工程は、ポリマーの Tg以下に制御された温度環境で実施する必要があるかもしれません。さらに、注意が高温や溶剤に接触するすべての機器がそれらの条件を処理するために適合しなければならないことを保証するために取られるべきである。このプロトコルのパラメータのいくつかは、合成または粒子/フィルムのために異なるポリマーシステムに対応するために（ すなわち 、温度、真空、インキュベーション時間、溶媒、非溶媒、ポリマー濃度、非溶剤の溶剤比率等）を調整することができる製造。いくつかのケースでは、ナノ粒子は（真空乾燥して溶媒を除去するのに十分な）長い期間のために溶媒中で安定していないので、2つの代替溶剤レム楕円形の方法を用いることができる。 1）粒子がゆっくりと、遠心分離し上清を、溶媒をデ​​カントし、残りの粒子は、乾燥または2）粒子を真空濾過によって分離することができ、その後、乾燥させることができる。ブランクまたは...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>電動XYZステージ：3倍、T-LSM050A、軸当たり50ミリメートル旅行</td><td> Zaberテクノロジーズ</td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000シングルシリンジポンプ</td><td>新時代のヒートポンプシステム</td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td>パイレックス* Vista *のリムレス再利用可能なガラス培養管</td><td>コー​​ニング</td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td>ガラスキュベット</td><td>科学的な戦略</td><td> G102 </td></tr><tr><td> LabVIEWの</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td> 776671から35 </td></tr><tr><td> SGEのガスタイトシリンジ、ルアーLocの</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 509507 </td></tr><tr><td> U96ディープウェルプレート1.3ミリリットルと2.0ミリリットル</td><td>サーモサイエンティフィック：ヌンク</td><td> 278743 </td></tr><tr><td>まあキャップマット</td><td>サーモサイエンティフィック：ヌンク</td><td> 276000 </td></tr><tr><td>台風9400 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 63-0055-79 </td></tr><tr><td>ワットマングレード50円90ミリメートル</td><td>ワットマン</td><td> 1450-090 </td></tr></tbody></table>

組合せの合成と高分子膜とナノ粒子のライブラリからのハイスループットタンパクリリース

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

無水物は、優れた生体適合性および薬物送達機能を備えた生体材料の一種である。彼らは従来のワンサンプルを1つずつ合成技術で広く研究されてきたが、より最近のハイスループットアプローチがポリアンヒドリド1の大きなライブラリーの合成および試験を可能に開発されました。これにより、より効率的な最適化と薬剤およびワクチン送達用途のためのこれらの生体材料の設計プロセスを容易にするでしょう。この作品の方法は、生分解性ポリ無水物膜およびナノ粒子のライブラリーのコンビナトリアル合成し、これらのライブラリーからのタンパク質放出のハイスループット検出について説明します。このロボット操作方法（ 図1）では、リニアアクチュエータ、シリンジポンプは、ユーザーエラーを排除し、ハンズフリーで自動化されたプロトコルを使用可能には、LabVIEW、によって制御されます。さらに、この方法は、赤、ミクロスケールのポリマーライブラリーの迅速な製造を可能に多変量ポリマー系の創出をもたらしながら、バッチサイズをucing。ポリマー合成にこのコンビナトリアルアプローチは、それが従来の1ポリマーを合成するのにかかる時間に相当する量で、15の異なるポリマーまで​​の合成を促進します。また、コンビナトリアル高分子ライブラリ（ナノ粒子）の非溶媒にまたは真空乾燥（フィルム用）による溶媒や降水量のフィルムやポリマーライブラリが解散した場合においてナノ粒子を含む空白またはタンパク質にロードされた幾何学的形状に加工することができます。以前に1記載の高分子ライブラリに蛍光標識タンパク質をロードする際、タンパク質の放出動態を蛍光ベースの検出方法（ 図2および図3）を用いた高スループットで評価することができる。この組み合わせのプラットフォームは、従来の方法で検証されています2、ポリ無水物膜およびナノ粒子のライブラリはと特徴づけられている<sup&gt; 1のH-NMRとFTIR。 インビトロ細胞毒性、サイトカイン産生、表面マーカーの発現、接着、増殖、分化に ;、ライブラリはタンパク質放出動態、安定性および抗原性のためにスクリーニングされており、 生体内で生体内分布と粘膜付着1〜11インチここに開発されたコンビナトリアル手法は、順番に、生体材料の性能を最適化するために、in vitroおよび in vivo でスクリーニングすることができるタンパク質にロードされたナノ粒子及びフィルム·ライブラリーのハイスループットポリマー合成および製造を可能にします。

この方法では、生分解性ポリ無水物膜およびナノ粒子のライブラリのコンビナトリアル合成し、これらのライブラリーからのタンパク質放出のハイスループット検出について説明します。

ポリアンヒドリドは、優れた生体適合性と薬物送達能を持つバイオマテリアルの一種である。これらは、...を用いて広範に研究されてきたが、

このビデオでは、生分解性ポリアンヒドリドフィルムおよびナノ粒子ライブラリのコンビナトリアル合成と、これらのライブラリからのタンパク質放出の高スループット検出について説明します。まず、高スループット自動堆積装置を用いて、組成の異なる多様なモノマーアレイをガラスキュベットに堆積させます。その後、180 °C、0.3 torの条件下で1.5時間のポリ縮合反応を行います。これらの反応条件は、C-P-H-S-Aポリアンハイドライドポリマーの合成に特有のものです。自動分注装置を用いて、溶媒およびカプセル化のためのコンポーネントを、ポリマーライブラリを含むキュベットに分注します。ポリマーを完全に溶解させ、追加コンポーネントを均一に分散させるために、超音波処理を行うことができます。次に、溶解したポリマーを非溶媒が入ったチューブに移し、ナノ沈殿法によってナノ粒子ライブラリを作製します。ナノ粒子を真空乾燥またはろ過によって回収し、修飾した96ウェルリリースプレートに移します。最後に、タンパク質を封入したライブラリを生理的条件下でインキュベートし、蛍光検出法を用いてタンパク質の放出速度論を評価します。最終的に、ポリマーの特性や放出環境の条件に応じたタンパク質放出キネティクスを示す結果を得ることができます。従来の単一サンプルを個別に扱う手法に対するこのアプローチの主な利点は、複数のサンプルを同時に合成できることです。これにより、タンパク質-ポリマー間、細胞-ポリマー間、または宿主-ポリマー間の相互作用について、これらのサンプルをハイスループットにスクリーニングすることが可能になります。これにより、薬物伝達や組織工学に向けたこれらのバイオマテリアルの合理的設計と開発が加速します。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるLa Tricia Petersonが行います。ビデオのこのセクションでは、ポリマー合成後、組成が異なるモノマーライブラリーを堆積させるために、ハイスループット堆積装置を使用します。この装置は、ブランクまたはタンパク質を担持したポリマーフィルムおよびナノ粒子のコンビナトリアルライブラリを作製するために利用されます。この自動プラットフォームは、コンピュータに直列に接続された2台のプログラム可能なシリンジポンプと3つのリニアアクチュエータで構成されています。シリンジポンプとアクチュエータへのコマンド送信にはLabVIEWソフトウェアが使用されます。10 ccのガス密閉シリンジをシリンジポンプに装着し、ルアーロック継手で金属キャピラリーチューブを接続して、ポリマー溶液をガラスキュベットに分注します。この実演では、セリ酸（SA）と1,6-ビス（パラ-ヒドロキシフェニル）ヘキサン（CPH）を用いて、Texas Red-BSA（ウシ血清アルブミン）を封入したナノ粒子ライブラリを作製します。本ビデオおよび付属資料の指示は、広範なポリマーフィルムおよびナノ粒子ライブラリの作製と試験に応用することが可能です。ライブラリを合成するには、まず各モノマーをクロロホルムに溶解し、最終濃度を25 mg/mLとしてガラスバイアルに入れます。次に、ルアーロック端から溶液を吸引し、各溶液を10 ccのガス密閉シリンジに充填します。気泡はすべて取り除いてください。次に、溶媒耐性のあるルアーロックステンレス製キャピラリーチューブをシリンジの端に取り付けます。キャピラリーチューブをクランプで固定し、リングスタンドに装着します。その後、両方のキャピラリーチューブの先端をスタートベタに配置します。モノマーの堆積用です。シリンジをプログラマブルシリンジポンプにセットし、LabVIEWソフトウェア上で位置を固定します。ソフトウェアを使用して、リニアアクチュエータを開始位置に設定してください。x軸、y軸、およびZ軸に沿って、SAおよびCPHモノマーをガラスキュベットへ自動的に分注します。アクチュエータによってキャピラリーチューブが各キュベットに適切に配置され、プログラムされた量の各モノマーがポンプで注入されることで、組成が異なるモノマーライブラリが作成されます。モノマーの分注後、モノマーライブラリーを予熱した真空乾燥機に移し、180 °C、0.3 tourで1.5時間インキュベートして縮合重合させます。インキュベーション後、ポリマーライブラリーの作製が完了します。次に、タンパク質を担持させたポリマーナノ粒子を作製します。タンパク質含有ナノ粒子ライブラリーを作製するには、タンパク質含有ポリマーフィルムライブラリー作製に関する付属のプロトコルを参照してください。この場合、ポリマーライブラリーを溶解可能な適切な溶媒に、タンパク質（ここではTexas red bovine serum albumin）を添加します。ここでは、塩化メチレンを2 mg/mLの濃度で使用します。10 ccシリンジに溶媒を含むTexas Red BSAを満たし、1台目のシリンジポンプにセットします。次に、清潔で空の2 ccシリンジを2台目のシリンジポンプにセットし、15 millilitersの非溶媒（本例ではペンタン）を含むチューブをバイアルプラットフォームに隣接するチューブホルダーに配置します。続いて、LabViewソフトウェアでプログラムを選択し、自動溶媒堆積プロセスを開始します。プログラムを開始すると、ポリマーライブラリを含むキュベットに溶媒が分注され、ポリマー濃度が 20 mg/mL になります。すべての溶媒の分注が完了した後、1 ～ 5 分間静置してポリマーを溶解させます。続いて、ポリマーを完全に溶解させ、タンパク質を均一に分散させるために、必要に応じてシンジケーション（攪拌）を行います。次に、LabVIEWでサンプル転送プログラムを開始します。ライブラリ内の各溶解ポリマーサンプルを空のシリンジで吸引し、サンプルホルダーにある対応する非溶媒チューブに分注します。各サンプルの転送が完了したら、ナノ粒子ライブラリを10 mmHgの真空チャンバーに置くか、または溶媒が除去されるまで吸引ろ過を行い、タンパク質担持ナノ粒子を回収します。カプセル化されたBSAの放出を調査するために、まず、プレート内の隣接する1列おきの各ウェルの壁の上半分（0.5インチ）を削除して改造した、ディープ96ウェルポリプロピレンプレートを用意します。列AとB、CとD、EとF、GとHの間の各ウェルの上部を取り除くことで、全量まで液体を満たした際に、隣接するウェルのペア間で液体が流れるようになります。1000から10 µg/mLの範囲のTexas red BSA標準液を、このディープ96ウェルプレートに分注します。これらはタンパク質量の算出に使用され、フルオロクロムの消光も考慮されます。目的の質量のナノ粒子をPBSバッファーで再構成し、超音波処理して粒子を均一に分散させます。次に、ナノ粒子ライブラリをディープ96ウェルプレートに移し、サンプルがウェルプレートの底に沈殿するまで待ちます。続いて、ピペッターを用いて、隣接するすべてのウェルに、ウェル上端から1/4インチまでPBSバッファーをゆっくりと満たします。隣接するウェル間で緩衝液が自由に流れるよう、十分な量の緩衝液を入れる必要があります。次に、リリースプレートを蓋で密封し、37 °Cで攪拌しながら保持します。実験期間中の増分時間点において、適切な励起、レーザー、および放出フィルターを用いて、9, 400 Typhoonフラットベッド蛍光スキャナーでプレートをスキャンします。スキャン後、画像解析ソフトを用いて、各放出時に放出された蛍光色素標識タンパク質の量を定量します。本ビデオで説明したSAおよびCPHモノマーから合成されたポリマーナノ粒子ライブラリーにTexas Red BSAを封入し、ポリマー化学の関数としてタンパク質放出速度を決定しました。タンパク質をロードしたナノ粒子を37 °Cで1ヶ月間インキュベートし、その間に段階的なタイムポイントで蛍光スキャンを行い、タンパク質放出量を定量しました。ここで示すように、このハイスループット法を用いて、A-C-P-H-S-A ポリ無水物ナノ粒子ライブラリーからの Texas Red BSA の放出キネティクスを決定しました。Sarich フィルムの化学組成に応じて放出速度が増加するという傾向が観察されました。標準的なタンパク質定量アッセイを用いた場合にも、同様の結果が得られました。別の実験において、CPT CPHポリ無水物フィルムライブラリからのTexas Red BSAの放出を評価したところ、ここに示すように、ほぼ0次放出速度論が観察され、CPEG含有量の多いフィルムでタンパク質が最も速く放出されました。これは、生分解性薬剤放出デバイスとして、医学分野への応用の可能性があります。これらの結果は、ポリマー化学を変更することで、治療薬やワクチン抗原の望ましい放出プロファイルを制御できることを示しています。この手順に続き、タンパク質の安定性、細胞毒性、細胞活性化、およびInVivoでの生体内分布などの領域を調査するための、他のコンビナトリアル手法が開発されています。これらの側面は、薬物送達および組織工学のためのバイオマテリアルの合理的な設計において重要です。本プロトコルの全行程において、適切な個人用保護具（PPE）を着用し、安全な実験手順を遵守してください。

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Research

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