in vitroで中皮クリアランスアッセイでそのモデルの卵巣がんの転移の初期段階を

この手順の全体的な目標は、卵巣がんの多細胞ステロイドが中皮単層に浸潤する能力を判断することです。これは、まず、卵巣がん細胞を発現する赤色蛍光タンパク質を低接着培養プレートでインキュベートし、多細胞ステロイドを形成することによって達成されます。次のステップは、フィブロネクチンでコーティングされたガラス底培養皿上に中皮細胞を発現する緑色蛍光タンパク質をプレートして単層を形成することです。

最後のステップは、卵巣がんのphsを低接着プレートから中皮単層を含むプレートに移すことです。最終的に、蛍光タイムラプスビデオ顕微鏡を使用して、制御と実験的卵巣がんの相対的な能力を定量化します。SP 中皮単層で全体を形成する。

この手法が既存のエンドポイントアッセイと比較した場合の主な利点は、蛍光標識細胞とタイムラプスビデオ顕微鏡の組み合わせを使用して、経時的な近心クリアランスのダイナミクスをモニターすることです。卵巣がんのフェが形成される前に、低接着性を調製する必要があります。 96ウェルラウンドボトム培養皿。これらの培養皿を作製するには、96ウェル細胞培養皿の各ウェルに30マイクロリットルのポリヘマ溶液を加えます。

96ウェルプレートを摂氏37度の非加湿インキュベーターで24〜48時間インキュベートしてエタノールを蒸発させ、それぞれにポリヘマの膜を残します。このポリヘマフィルムは、細胞がウェルの底に付着するのを防ぎ、細胞を懸濁液で成長させます。この実験で卵巣がん細胞を発現する赤色蛍光タンパク質は、低接着培養プレートの準備ができたら、カスタム細胞培養培地である10%ベース培地で培養します。

トリプシンは、最初にPBSでプレートを洗浄し、次に1ミリリットルのトリプシンを追加し、プレートを摂氏37度で45分間インキュベートすることにより、卵巣癌細胞のプレートです。トリプシンを急冷するために10%塩基培地を追加した後、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。900 RCFの卓上遠心分離機で細胞を3分間ペレット化し、上清を吸引して細胞を10%ベース培地に再懸濁します。

ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントした後、細胞の濃度を10%ベース培地の50マイクロリットルあたり100細胞に調整し、96ウェルポリヘマコーティング培養皿の各ウェルに均一に懸濁した希釈細胞懸濁液の50マイクロリットルを追加し、96ウェルプレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターで16時間インキュベートして、卵巣癌細胞が一緒に集まるようにします。 各ウェルに単一の多細胞ステロイドを形成します。この手順を開始するには、フィブロネクチンを使用して6ウェルガラス底マットテックディッシュのウェルを準備します。2ミリリットルのフィブロネクチンPBS溶液をディッシュの各ウェルに加え、B室温で30分間インキュベートします。

中皮細胞単層を形成するための緑色蛍光タンパク質発現中皮細胞は、10%塩基培地で培養したトリプシンは、中皮細胞のプレートを目に入れ、900RPMで3分間の卓上遠心分離機でスピンダウンします。上清を吸引し、細胞を10%塩基培地に再懸濁し、10%塩基培地で所望の濃度に調整します。マットテックディッシュの30分間のフィブロネクチンインキュベーションが完了したら、2ミリリットルのPBSでウェルを洗浄し、PBSを吸引し、6ウェルのマットテックディッシュの各ウェルでウェルあたり10〜5番目の中皮細胞を6回プレート化する。

マットテックディッシュを摂氏37度の細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートし、中皮細胞がディッシュに付着して単層を形成するようにします。このアッセイを開始するには、ピペットを使用して96ウェルポリヘマコーティングプレートから卵巣癌PHEを収集し、中皮細胞単層洗浄を含む6ウェルマットテックディッシュの1つのウェルから培地を吸引し、2ミリリットルのPBSで1回洗浄し、96クジラプレートからのPHEのすべてをマットテックディッシュの1ウェルに加えます。これは、画像化できない皿の部分にPHEが着陸することを説明するために画像化されるステロイドの数の約3倍です。

視野ごとに1つのステロイドのみを画像化したいため、ステロイドの凝集は避ける必要があります。皿を左右に優しく揺らして、ステロイドが単層全体に均等に分散してから付着します。マットテックディッシュを倒立広視野蛍光顕微鏡のステージに置きます。

8時間以上のタイムラプス撮影が可能。電動ステージを使用して、複数のOID相互照合イベントを持つ皿内の複数の位置を画像化します。1回の実験で、卵巣がん細胞PHEは皿の底に落ち着き、中皮細胞に付着します。

Monolayerは、10分ごとに8時間、20以上のsphe単分子膜相互作用のG-F-P-R-F-Pおよび位相画像を収集します。中皮細胞クリアランスアッセイでは、卵巣がん細胞PHEを発現するRFPがGFP発現中皮細胞単層に侵入し、単層に穴を生じます。穴のサイズは、元素ソフトウェアまたはImage J.The穴のサイズを8時間での穴のサイズを対応するRFP画像のステロイドのサイズで割ることにより、初期回転楕円体サイズに正規化することにより、元素ソフトウェアまたはImage J.The穴のサイズを、対応するRFP画像内のステロイドサイズで割ることにより、初期回転楕円体サイズに正規化されます。 中皮細胞クリアランスアッセイは、遺伝子改変された卵巣がん細胞SPHEの浸潤能を比較するために使用でき、卵巣がん細胞ステロイドがクリアする分子メカニズムを解明することができます。

この例における中皮単層は、O VCA4 33卵巣癌細胞の中皮クリアランス能力である。Talon oneの発現が弱まったPhsを、コントロールOVCA 4 33 OIDsと比較した。拡散PHEによって単層に生成された穴を測定し、各グループの6つの位置を平均化しました。

このグラフに示されているように、タロン1ノックダウンステロイドによって作成された平均クリアランス面積は、制御ステロイドによって作成された平均面積よりも有意に小さく、タロンがOVCA4 33卵巣癌spsによる中皮クリアランスに必要であることを示唆しています。このタイムラプス動画は、コントロールOVCA4 33赤色ステロイドが緑色の中皮単層に侵入している様子を示しています。この次のタイムラプス映画は、OVCA 4 33の赤いステロイドとタロン1の弱まった表現が緑の中皮単層に侵入しているものです。

前のムービーと比較すると、ステロイド中のTalon一発現が減衰すると中皮クリアランス能力が低下することが明らかです。このビデオを見れば、タイムラプスビデオ顕微鏡を使用して、卵巣がん、多細胞ステロイド、および中皮細胞単分子膜の相互作用を経時的にモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。