採用プロテアーゼ及び酸触媒ラベリングワークフロー

このプレゼンテーションでは、$^{18}\text{O}$濃縮水を用いたタンパク質消化物および合成ペプチドの安定同位体標識のワークフローを実演します。まず、プロテアーゼ触媒によるパレオタイムコース実験において、基質とプロテアーゼを50% $^{18}\text{O}$濃縮水の存在下でインキュベートし、$^{18}\text{O}$原子を取り込ませます。次に、プロテアーゼによる二重標識の手法について説明します。消化後の切断産物を、目的のプロテアーゼおよび50% $^{18}\text{O}$濃縮水の存在下で再度インキュベートします。

EOワークフローでは、酸触媒を用いて、一定の時間間隔で酸素18原子を官能基に導入します。マトリックスを含む反応混合液のアリコートをモールドターゲットプレートにスポットし、質量分析データを取得することで、ペプチド開裂反応のスペクトル時間プロットおよび個々のペプチド種の酸素18導入プロットを生成します。ラベル化された開裂産物が選択され、MS/MSベースの配列同定が行われます。最終的に、これらのワークフローは、定量的および定性的なプロテオーム研究のための汎用性の高いツールとなります。

本手法は、複雑な蛋白分解経路における速度決定段階や反応中間体の特定など、プロテアーゼ研究分野における重要な疑問の解決に役立ちます。パレオタイムコースによって同定された蛋白分解シグネチャーは、基質特異性に関する重要な知見を提供します。さらに、タイマーズデータ（timers of data）においても速度論的情報が活用されます。

私の研究室のポストドクターが、ここから手順を実演します。paleoタイムコースワークフローは、プロテアーゼによる触媒作用で取り込まれた酸素18に基づき、タンパク質分解切断反応のダイナミクスをモニタリングします。20 µLの反応系において、サンプルペプチドを酸素18濃縮水を含むプロテアーゼ反応バッファーに添加します。反応混合液0.5 µLとマトリックス0.5 µLを混合し、Opti MS 384 MALDIターゲットプレートにスポットして、溶媒ドロップレットが室温で乾燥するまで放置します。その間に、反応混合液を2本のチューブに分注します。

サンプルチューブ用のコントロールとサンプルを準備します。目的のプロテアーゼを加え、推奨される酵素反応温度でインキュベートします。指定した時間経過で添加します。

0.5 µLのアリコートを分取し、0.5 µLのマトリックスと混合してマルチターゲットプレートにスポットします。この後、本パレオポストダイジェスチョンラベリングワークフローで後述するように、MALDI-TOF MS解析により反応速度論を分析します。trypsinなどのプロテアーゼは、酸素18を取り込むカルボキシル酸素交換反応を触媒します。酸素18ラベリングを行わずにタンパク質消化を行った後、切断産物をPepClean C18スピンカラムに通し、残留するプロテアーゼ活性を除去します。

次に、$^{18}\text{O}$濃縮水を含む20 $\mu\text{L}$のトリプシン反応バッファーでサンプルを再懸濁します。0.5 $\mu\text{L}$のアリコートを分取し、等量のマトリックスと混合します。その後、OptiMS PNAP 384 MALDIターゲットプレートにスポットし、風乾させます。

次に、反応溶液をコントロールチューブとサンプルチューブに分注します。サンプルチューブにトリプシンを加え、37 °Cでインキュベートします。反応をモニタリングするため、0.5 µLのアリコートを採取します。

0.5 µLのマトリックスと混合し、MALDIプレートにスポットします。このカルボキシル酸素交換反応のダイナミクスをMaldi Toof MSM S解析により分析します。IEOタイムコースワークフローは、酸性ペプチドの側鎖および末端基の酸触媒カルボキシル酸素交換反応に基づいています。

まず、50 nMの各ペプチドを、0.1%最終濃度のトリクロロ酢酸の有無にかかわらず、1:1の$^{18}$O濃縮水とともにインキュベートします。反応液から0.5 µLずつ分注し、48日間毎日、マトリックスとともにMALDIターゲットプレートに直接共晶させます。定期的にMALDIターゲットプレートをMALDI-TOF MS/MSにかけ、生成物の分析を行います。このセクションの詳細は、付随する論文に記載されています。

まず、ポジティブイオンモードでMSスペクトルを3連で取得します。マルチプライヤーの校正およびMS取得の設定後、サブスペクトルのシングルショットを取得します。次に、4,000シリーズExplorerデータ取得ソフトウェアからMSデータファイルをエクスポートします。

その後、スペクトル処理およびピーク検出にMascot Distillerソフトウェアを利用している社内情報システムにインポートします。同位体エンベロープをデコンボリューションし、$^{18}\text{O}$取り込み率を自動的に決定します。ここで$^{18}\text{O}$取り込み率は、同位体エンベロープ全体に対する個々のペプチド同位体種の相対的な寄与分として記録します。ビンリストをフィルタリングし、各タイムコース実験について、100 ppmの質量幅で少なくとも3つの値をビンに割り当てます。

関連するMSデータファイルから、検出されたすべてのペプチド種の分子量を抽出します。次に、Xpaceyを用いて、質量誤差許容範囲を200 PPMに設定し、ペプチドセットを検索します。得られたビンリストを、基質ペプチド配列から予測されるタンパク質分解切断産物のデータと比較します。

find pepツールによって予測された開裂産物のすべての質量値、および18Oの取り込みが認められるビン値について、msmsスペクトルの取得に進みます。サブスペクトルあたり最大40個のサブスペクトルを1スポットにつきランダムなパターンで50ショット収集し、msmsファイルをエクスポートします。その後、ピーク検出のためにMSMSデータファイルを解析システムにエクスポートし、ペプチド同定のために、対応するbend MSデータに関連付けられたMSMSピークリストを作成します。

Mascot検索エンジンで、酵素特異性「なし」、プリカーサーイオンの許容誤差を150 PPM、フラグメントイオンの質量許容誤差を0.2 Daltonに設定します。M-S-M-S-PリストをSwiss Proデータベースに対して検索します。ペプチドの同定は、さらにData Explorerソフトウェアを用いて、スペクトル時間プロットにおけるフラグメントイオン全体の特徴的な18O取り込みパターンを確認することで検証可能です。

マクロを使用して、データエクスプローラーソフトウェアのASCIファイルから各反応時間点のMSデータファイルをエクスポートします。次に、それらのファイルをデータ解析およびグラフ作成ソフトウェアにインポートし、ウォーターフォールプロットとして表示して、各曲げ部分の酸素18取り込みプロットを作成します。ペプチド切断生成物から、すべての反応時間点における個々のペプチド同位体種の相対的な寄与を抽出し、時間を軸にプロットします。

このようなスペクトル時間プロットは、タンパク質分解切断反応のダイナミクスを示しています。本実験では、内皮変換酵素1による生物活性ペプチド endo および C の切断を分析します。ウォーターフォール表示により、タイムコース実験のMSスペクトルをプロットし、基質の分解と中間生成物および最終生成物の出現を同時にモニタリングします。

切断産物はMSMSおよびその同位体エンベロープにおける特徴的な18O組み込みシグネチャーによって同定されます。トリプシンのこの反応機構は、セリンプロテアーゼがペプチド切断産物への最大2つの18O原子の組み込みを媒介することを示しています。プロテアーゼベースのラベル化ワークフローにおいて、ペプチド結合切断反応により、新たに生成されたペプチド切断産物に対して50%の単一18O組み込み率が得られます。トリプシンのような、反応産物に再結合するプロテアーゼは、カルボキシ酸素交換反応を介して2つ目の18O原子の組み込みをさらに触媒します。

平衡状態で、酸素18ラベルは、未標識、単一標識、および二重標識の生成物に1:2:1の比率で分布します。タンパク質分解末端の消化前標識ワークフローでは、ペプチド結合の切断は起こりません。その代わりに、最大2つの酸素18原子の導入は、排他的にカルボキシル酸素交換反応に基づいています。

したがって、酸素18の取り込みは、ペプチド切断産物を再結合させるプロテアーゼにおいてのみ起こります。酸触媒による酸素18標識では、カルボキシ基1つにつき2つの酸素18原子が取り込まれます。本実験を通じて、アンジオテンシンIの同位体エンベロープにおける2ダルトンの整数倍の質量シフトを、酸素18原子の取り込みによってマッピングすることができます。

OPE標識と高分解能質量分析を時間分解的に組み合わせることで、パレオ時間経過法（paleo time course method）を用い、ペプチド産物の生成をダイナミックに分析することが可能になります。このアッセイは、定量的および定性的なプロテオーム研究のための安定化した局所標識ペプチドの作製や、プロトピックペプチドが生成される速度論の評価に使用できます。

Paleoタイムコースは、生理学的に関連のある条件下でタンパク質分解経路を評価するために設計されています。この手法は、ヒトがん微小環境における溶解プロセスの最近の調査への道を開きました。