Name: 採用プロテアーゼ及び酸触媒ラベリングワークフロー 18 O-濃縮水 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶプロテアーゼ触媒および酸触媒による¹⁸O標識ワークフロー。タンパク質消化物への安定同位体導入法を質量分析で評価し、プロテオミクス研究の定量的・定性的解析に活用できます。

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提示LEO-ワークフローはタンパク質消化物や合成ペプチドの安定同位体標識を可能にします。これらのタイムコース実験（ 図1）は、比較および定量的プロテオミクス研究ならびにプロテアーゼの研究にも適用可能である。各ワークフローには、2つの実験の手順（ 図2）から構成されています）は、それぞれ18のO-安定同位体でエンコードされた反応（プロテアーゼ触媒によるペプチド切断の解決されたサンプリング時間;プロテアーゼ触媒によるカルボキシル基の酸素交換反応、酸触媒カルボキシル酸素交換質量分析および18 O-取り込み動態をグラフィカルに表現することにより反応A）とB）分析。 Aの経時実験 I.古経時：タンパク質分解的切断のプロテアーゼ触媒によるラベリング<ol><li> （オプション）タンパク質（10μM）およびペプチド（250μM）のジスルフィド結合は、DTT（最終濃度2.5 mM）で還元される50℃で30分インキュベートすることにより、25mMのNH 4 HCO 3（両方の新たに調製）で</li><li> （オプション）無料システインは、暗所で室温で30分間インキュベートすることにより、25mMのNH 4 HCO 3で（最終濃度10mM）ヨードアセトアミドでアルキル化されています。 </li><li>興味のあるプロテアーゼに応じて、タンパク質/ペプチドのソリューションは、残った液、アルキル化剤を除去するためにクリーンアップする必要があります。タンパク質試料用のバッファを交換するためにペプチドのクリーンアップとVivaspin遠心コンセントレータ（ザルトリウス）のPepClean C-18スピンカラム（サーモ）を使用します。 </li><li> 1:1（v / v）の最終的なH 2を含む：;：20μlのプロテアーゼ反応緩衝液（25mMのNH 4 HCO 3、pH8.0でトリプシン50mMのMES-KOH、pH5.5で、ECE-1）に交換ペプチド/タンパク質/を再溶解（18）O（95％、シグマアイソテック）。 </li><li>前プロテアーゼの添加をゼロ時点サンプルを撤回：ミックス反応混合物の0.5μlと0.5μlのアルファシアノ-4 - ヒドロキシを酸マトリックス（50％アセトニトリル中に10 mg / ml、0.1％TFA）。のOpti-TOF 384 MALDIターゲットプレート（AB SCIEX）上のスポットサンプルを、室温で溶媒液滴のまま乾燥するまで（約5分）。 </li><li> 2つのアリコートに反応液を分割します。室温または特定の酵素のための推奨温度で：;：最初のアリコートは、関心のあるプロテアーゼ（0.04 nMでトリプシン75nmのECE-1）と共にインキュベートされます。第二のアリコートを、プロテアーゼなしでインキュベートされ、コントロールサンプルとして使用されます。第一のアリコートは、プロテアーゼ触媒による18 O標識のための標準試料を表しており、タンパク質分解的切断反応のペプチドやタンパク質同定、タンパク質分解活性の検出およびモニタリングに使用することができます。第二のアリコートは、18 O取り込みがプロテアーゼによって誘導されることを示すために使用されているため、どちらのラベルも切断はこのサンプル用に期待されています。 </li><li>反応液の一部を除去し、DESとしてそれらをスポッティングすることにより反応をフォローフィット思えるような時間間隔でステップ5にcribed。上記の反応条件は4日間（約24箇所）までのタンパク質分解反応を監視するために使用されています。 30分まで、5分毎のサンプリングを開始し、8時間、4日までのすべての8時間まで、2時間まで30分ごとに、すべての時間を見つける。切断産物は、最初の12時間以内に表示されるべきであり、基板は24時間後に完全に加水分解されなければなりません。拡張反応のインキュベーション時間はさらに処理される反応中間体から離散的で安定した反応生成物を定義することができます。リサーチクエスチョンと与えられた酵素 - 基質ペアに応じて、スポッティング倍、培養温度は最適反応サンプリングを確保するために調節されることがあります。 </li><li>最終反応時点をスポットまたは拡張スポッティング間隔の間にされた後、後述するように、MALDIターゲットプレート（セクションB）MALDI-TOF/TOF MS / MS分析に送信されます。 </li></ol> Ⅱ。古経時：Postdigタンパク質分解末端のestionラベリング<ol><li> （オプション）タンパク質（10μM）およびペプチド（250μM）のジスルフィド結合は、50℃で30分インキュベートし、25mMのNH 4 HCO 3（両方の新たに調製）にDTT（最終濃度2.5 mM）で還元される</li><li> （オプション）無料システインは、暗所で室温で30分間インキュベートすることにより、25mMのNH 4 HCO 3で（最終濃度10mM）ヨードアセトアミドでアルキル化されています。 </li><li>興味のあるプロテアーゼに応じて、タンパク質/ペプチドのソリューションは、残った液、アルキル化剤を除去するためにクリーンアップする必要があります。タンパク質のバッファー交換のためのペプチドのクリーンアップとVivaspin遠心コンセントレータのためPepClean C-18スピンカラムを使用します。 </li><li>再溶解/クリーンアップされたペプチド製品/タンパク質20μlのプロテアーゼ反応緩衝液（ 例えば、トリプシン：25mMのNH 4 HCO 3、pH8.0）に交換する（ 例えばトリプシン完成に関心のプロテアーゼで、ダイジェストを：0.04 nMで、37℃、12時間）。 </li><li> PepClean C-18スピンカラムによるクリーンアップの切断産物。このステップでは、残存プロテアーゼ活性を除去することができます。 </li><li> 1:1（v / v）の最終的なH 2 18 Oを含む：20μlのプロテアーゼ反応緩衝液（25mMのNH 4 HCO 3、pH8.0でトリプシン）でクリーンアップされたペプチド生成物を再溶解/交換</li><li>反応混合物のミックス0.5μlおよび0.5μlのアルファシアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸マトリックス（50％アセトニトリル中に10 mg / ml、0.1％TFA）：事前の酵素の添加をゼロ時点サンプルを撤回します。スポットMALDIターゲットプレート上の試料と乾燥（約5分）になるまで室温で溶媒液滴のままにしておきます。 </li><li> 2つのアリコートに反応液を分割します。室温または特定の酵素のための推奨温度で：最初のアリコートは、関心のあるプロテアーゼ（0.04 nMで例えばトリプシン）と共にインキュベートされます。第二のアリコートを、プロテアーゼなしでインキュベートされ、コントロールとして機能します。最初のアリコートプロテアーゼ触媒による18 O postdigestionラベリングのための標準試料を表しており、ペプチドやタンパク質の定量化のために使用することができます。第二のアリコートは、18 O取り込みがプロテアーゼによって触媒されることを示すために使用されているため、全く標識はこのサンプル用に想定されていません。 </li><li>反応液の一部を除去して、ステップ7で説明し、それらをスポッティングすることにより、反応に従ってください）​​時間間隔でフィット見えるように。例えば、私たちは、トリプシンによって触媒カルボキシル酸素交換反応を監視するために、その後最初に最大30分および15分毎にのために5分毎に斑点を付けた。 </li><li>最終反応時点が目撃されているか、（セクションB）下記のように拡張された間隔の間にスポッティングMALDIターゲットプレートがMALDI-TOF/TOF MS / MS分析に提出された後。 </li></ol> Ⅲ。アレオ-経時：カルボキシル基の酸触媒によるラベリング<ol><li> 1:1（v / v）のtの18 O濃縮水を使用して個々のペプチド（50 nM）をインキュベート0.1％の彼は有無（制御）（v / v）の最終のトリフルオロ酢酸（総体積30μl）を。 </li><li>アルファシアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸マトリックス（50％アセトニトリル中に10 mg / ml、0.1％TFA）で直接MALDIターゲット上の0.5μlとの混合物との共スポッティングを0.5μlアリコートで48日間毎日サンプルの反応生成物プレート。 </li><li>スポッティング間隔の間、そして、セクションBに下記のようにMALDI-TOF/TOF MS / MS分析のためのMALDIターゲットプレートを提出し、最終反応時点のスポッティング後</li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MSのデータ収集と分析<ol><li>質量スペクトルは4800 MALDI TOF / TOFアナライザ（AB SCIEX）に取得されています。 </li><li>分析前に、測定器は±50 ppmと一致するように、6つのピークの最小数の最大質量測定誤差の許容範囲を有するペプチド規格（AB SCIEX TOF / TOF機器のキャリブレーションのための質量標準キット）の混合物で校正されています。 </li><li> MSスペクトル（質量範囲45000 - 2000の許容ベースピーク強度範囲とステップサイズ50）、400 - 3800 - 4000 メートル/ z）は調整可能なレーザー強度（3400と正イオンモードを用いて三重に獲得されます。シングルショットは合計400ショット/スペクトルと、サブスペクトルを取得し、800のサブスペクトル後に発効する停止条件（合格または不合格）が取得されるか400のサブスペクトルパス合格基準。低濃度サンプルの場合や複雑な生物学的背景の存在下でMS検出範囲の下限は800のm / zに引き上げるべきである。また、LC分離したり、前述のように、サンプルクリーンアップステップと塩と他の干渉成分を除去することが必要かもしれません。 </li><li> MSデータファイル（。T2Dファイル）は4000シリーズExplorerデータ収集ソフトウェアからエクスポートして、スペクトル処理、ピーク検出のマスコットDistillerのソフトウェア（マトリックスサイエンス）を利用して、社内の研究室情報システムにインポートされます。同位封筒自動的にメイソンらによって記載されたものと同様のアルゴリズムを用いて決定し、デコンボリューションおよび18 O-混入比率は12であり、当社グループ9で適応した。あるいは、このようなZoomQuant 13とバイパー14と同様に、このような市販のソフトウェアパッケージなどのソフトウェアツールは、 BioWorksエクスプレス（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とマスコットキャラクターDistillerの定量ツールとして（マトリックスサイエンス）18 O型データ15,16をデコンボリューションすることができます18、O-取り込み比（ すなわち 、16を含むペプチドの個々のペプチドの同位体種の相対的な寄与として表されているO、18 O 1ま ​​たは18 O 2）を全体同位封筒へ。 </li><li>各時間経過の実験のために、分子量（[M + H] +）、検出されたすべてのペプチド種は、関連付けられたMSデータファイルから抽出された値が100 ppmの質量幅でビニングされるため。 </li><li> A少なくともトン3 [M + H] +のビンを移入するために必要とされるように設定されている。既知の基質の場合では、フィルタリングされたビンのリストがExPASy FindPeptツール17（使用基質ペプチド配列から予測されるタンパク質分解切断製品のリストと比較され<a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ）と200 ppmの質量誤差の許容公差。 </li><li> MS / MSスペクトルをFindPeptツールによって、それらに関連付けられた18 O取り込みを持つビン値に対する予測切断産物の全質量の値で取得されています。 MS / MSデータは、オフモードで固定されたレーザー4200の強度と、CIDガスで、1kVのリフレクターポジティブイオンモードで4800 MALDI TOF / TOFアナライザで取得されています。 50ショットはアップスポットあたり40サブスペクトル（2000ショット/スポットの合計が得られる）との合計に対するサブスペクトル当たり無作為パターンで取得されています。 </li><li> MS / MSデータファイル（。T2Dファイル）は、4000シリーズの爆発からエクスポートされたRERのデータ収集ソフトと社内の検査情報システムにインポートされ、ピークが検出されるとMS / MSピークリストは、対応するビニングMSデータに関連付けられています。 </li><li>無酵素特異性、150ppmの前駆イオンと0.2 Daのフラグメントイオンの質量の許容差：ペプチド同定は、MS / MSピークリストは次の検索パラメータを指定してMASCOT検索エンジンを使用して、SwissProtデータベースに対して検索されます。 </li><li>ペプチド同定はさらにシェフチェンコらによって説明されているようにYシリーズのフラグメントイオンを越え特性18 O取り込みパターンを確認することにより、データエクスプローラソフトウェア（AB SCIEX）を使用して検証することができます18。 </li></ol>スペクトルの時間および18 O-定款プロットのRNAサンプルの調製 スペクトルの時間プロット：各反応時間ポイントのMSデータファイル（。T2Dファイル）を使用して、ASCIIファイルとしてデータエクスプローラソフトウェアからエクスポートされたマクロとデータ解析とグラフィックソフトウェアプログラム（OriginLabの起源などによる）にインポートして、ウォーターフォールプロット（ 図3）として表示されます。 18 O取り込みプロット：各ビニングペプチド切断の製品については、個々のペプチドの同位体種の相対的な寄与（16 O、18 O 1ま ​​たは18 O 2）をすべて反応時間ポイント間で抽出されます（ 図4）を時間に対してプロットした。

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

時間分解方法で、安定同位体標識と​​高分解能質量分析を組み合わせることで、古経時方法は、ペプチド生成物の生成の動的解析が可能になります。アッセイは、定量的および定性的プロテオミクス研究のための安定同位体で標識されたペプチドを生成するとプロテオティピックペプチドが生成されることにより反応速度を評価するために用いることができる。さらに、古経時は、特定の、生理学的に関連する条件を ex vivoでタンパク質分解経路を評価するために設計されています。内因性タンパク質、ペプチド、およびプロテアーゼならびに合成ペプチド及び組換えプロテアーゼがワークフローで利用することができる。調査されるべき特定のタンパク質分解反応に応じて、アッセイ条件とスポッティング時間は反応プロセスの最適なサンプリングを提供するために調整することができます。我々の経験では、それは、部屋、低い酵素濃度を使用することによって（ 例えば、タンパク質分解反応を遅くしておくと便利です。便利な手動のサンプリング間隔を可能にする温度）は、他の安定同位体標識方法論と同様に、実験的な18...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> PepClean C-18スピンカラム</td><td>サーモ</td><td> 89870 </td></tr><tr><td>のOpti-TOF 384 MALDIターゲットプレート</td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> 表1材料<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>アルファシアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td>ジチオスレイトール（DTT） </td><td&gt;アクロス</td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド（IAM） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td>酵素-1（ECE-1）を変換エンドセリン</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td>トリプシンゴールド</td><td>プロメガ</td><td> V5280 </td></tr><tr><td>水- 18 O、97原子％ の18 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸（TFA） </td><td>サーモ</td><td> 28904 </td></tr><tr><td> AB SCIEX TOF / TOF機器のキャリブレーションのための質量標準キット</td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> 表2試薬

採用プロテアーゼ及び酸触媒ラベリングワークフロー<sup&gt; 18</sup&gt; o-濃縮水

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

安定同位体は、生物学質量分析に不可欠なツールです。歴史的に見ると、18 O安定同位体は、広範囲に1から3のタンパク質分解酵素の触媒機構を研究するために使用されている。質量分析ベースのプロテオミクスの出現により、安定同位体濃縮された水の18 O原子の酵素によって触媒された定款は、定量的タンパク質発現レベル（Fenselauとヤオ4県、宮城県、ラオ5とYeによって見直さ比較する一般的な方法となっているら6）18 O標識は、化学物質（ 例えば iTRAQ、ICAT）と（ 例えば SILAC）代謝標識技術7に簡単かつ低コストの代替手段を構成する。利用プロテアーゼに応じて、18 O標識は、切断産物3のC末端カルボキシル基に2つの18 O原子までの取り込みをもたらすことができ</sup&gt;。標識反応は、2つの独立したプロセスが、ペプチド結合切断とカルボキシル酸素交換反応8に細分することができる。酵素18 O標識の私たちのパレオ（P 18 O濃縮水をmploying 電子 abeling rotease-ssisted リットル ）の適応では、独特の同位体比の挙動を得るために50パーセント18 O濃縮水を利用した。高解像度のマトリックス支援レーザー脱離イオン化 - 飛行時間型タンデム質量分析（MALDI-TOF/TOF MS / MS）との組み合わせでは、特徴的な同位体エンベロープは特異性の高いレベルで切断産物を同定するために用いることができる。我々は以前に検出し、特徴づける内因性プロテアーゼ9とタンパク質分解反応10-11を監視するために古の方法論を使用してきました。パレオは、タンパク質分解的切断反応の本質をエンコードしているので、実験のセットアップは簡単で、生化学ENRIです切断産物のchmentステップは回避することができます。古法は容易にタンパク質分解的切断反応のダイナミクスと生理的条件を表す複雑な生物学的サンプル中のタンパク質分解の（ii）の分析の監視（i）が経時実験に拡張することができます。古経時実験は、複雑なタンパク質分解経路反応における律速処理ステップと反応中間体を識別するのに役立ちます。さらに、古反応は、私たちはそのようなその切断産物を再結合し、第二18 O原子の取り込みを触媒することが可能であるセリンプロテアーゼトリプシンなどのタンパク質分解酵素を識別することができます。このような&quot;二重標識&quot;酵素はペプチドが排他的にカルボキシル酸素交換反応によって標識されている、postdigestion 18 O標識のために使用することができます。私たちの3番目の戦略は酵素を超え18 O濃縮水を採用ラベリング延び、18 O安定同位体標識を導入するために酸性のpH条件を使用していますペプチドにatures。

我々は、動的にタンパク質分解酵素によって生成されたペプチドの切断産物に18 O安定同位体の取り込みを監視するために古経時ワークフローを使用していました。提示されたアプローチは比較的異なる基板とプロテアーゼの組み合わせに分解性プロセシング経路を研究するための多目的ツールです。反応の過程で繰り返しタンパク質分解反応をサンプリングすることにより、古経時実験は、基質と生成物の存在量と処理内容の時間分解スナップショットを提供します。ターゲットプレート上の酸性マトリックス溶液とのコ·スポッティングサンプルが酵素反応とマトリックスの結晶化がさらに試料組成を保持し停止します。したがって、時点を遡及的に酵素反応の終結後MALDI-TOF/TOF MS / MSで分析することができます。これらの実験のワークフローのデータが豊富な自然に適応するために、我々は18のO-incorporatを計算する半自動バイオインフォマティクスシステムを実装各ペプチドのイオン比図3は、ECE-1によるペプチドEndokinin Cの処理の代表的なスペクトルの経時変化のプロットを示します。古経時データ...

採用した安定同位体標識のワークフロー<sup&gt; 18</sup&gt; O-濃縮水（LEO-ワークフロー）を定量的および定性的プロテオミクス研究のための多目的ツールです。プロテアーゼアシスト（古）のワークフローでは、<sup&gt; 18</sup&gt; O原子は、タンパク質分解切断、およびプロテアーゼによって媒介されるカルボキシル酸素交換反応によって導入されます。酸触媒（アレオ）ワークフローでは、<sup&gt; 18</sup&gt; O原子は低pHでカルボキシル酸素交換によって導入されます。

採用プロテアーゼ及び酸触媒ラベリングワークフロー<sup&gt; 18</sup&gt; O-濃縮水

安定同位体は、生物学的質量分析において不可欠なツールです。歴史的に、$^{18}\text{O}$安定同位体は、触媒作用の研究に広く利用されてきました...

このプレゼンテーションでは、$^{18}\text{O}$濃縮水を用いたタンパク質消化物および合成ペプチドの安定同位体標識のワークフローを実演します。まず、プロテアーゼ触媒によるパレオタイムコース実験において、基質とプロテアーゼを50% $^{18}\text{O}$濃縮水の存在下でインキュベートし、$^{18}\text{O}$原子を取り込ませます。次に、プロテアーゼによる二重標識の手法について説明します。消化後の切断産物を、目的のプロテアーゼおよび50% $^{18}\text{O}$濃縮水の存在下で再度インキュベートします。EOワークフローでは、酸触媒を用いて、一定の時間間隔で酸素18原子を官能基に導入します。マトリックスを含む反応混合液のアリコートをモールドターゲットプレートにスポットし、質量分析データを取得することで、ペプチド開裂反応のスペクトル時間プロットおよび個々のペプチド種の酸素18導入プロットを生成します。ラベル化された開裂産物が選択され、MS/MSベースの配列同定が行われます。最終的に、これらのワークフローは、定量的および定性的なプロテオーム研究のための汎用性の高いツールとなります。本手法は、複雑な蛋白分解経路における速度決定段階や反応中間体の特定など、プロテアーゼ研究分野における重要な疑問の解決に役立ちます。パレオタイムコースによって同定された蛋白分解シグネチャーは、基質特異性に関する重要な知見を提供します。さらに、タイマーズデータ（timers of data）においても速度論的情報が活用されます。私の研究室のポストドクターが、ここから手順を実演します。paleoタイムコースワークフローは、プロテアーゼによる触媒作用で取り込まれた酸素18に基づき、タンパク質分解切断反応のダイナミクスをモニタリングします。20 µLの反応系において、サンプルペプチドを酸素18濃縮水を含むプロテアーゼ反応バッファーに添加します。反応混合液0.5 µLとマトリックス0.5 µLを混合し、Opti MS 384 MALDIターゲットプレートにスポットして、溶媒ドロップレットが室温で乾燥するまで放置します。その間に、反応混合液を2本のチューブに分注します。サンプルチューブ用のコントロールとサンプルを準備します。目的のプロテアーゼを加え、推奨される酵素反応温度でインキュベートします。指定した時間経過で添加します。0.5 µLのアリコートを分取し、0.5 µLのマトリックスと混合してマルチターゲットプレートにスポットします。この後、本パレオポストダイジェスチョンラベリングワークフローで後述するように、MALDI-TOF MS解析により反応速度論を分析します。trypsinなどのプロテアーゼは、酸素18を取り込むカルボキシル酸素交換反応を触媒します。酸素18ラベリングを行わずにタンパク質消化を行った後、切断産物をPepClean C18スピンカラムに通し、残留するプロテアーゼ活性を除去します。次に、$^{18}\text{O}$濃縮水を含む20 $\mu\text{L}$のトリプシン反応バッファーでサンプルを再懸濁します。0.5 $\mu\text{L}$のアリコートを分取し、等量のマトリックスと混合します。その後、OptiMS PNAP 384 MALDIターゲットプレートにスポットし、風乾させます。次に、反応溶液をコントロールチューブとサンプルチューブに分注します。サンプルチューブにトリプシンを加え、37 °Cでインキュベートします。反応をモニタリングするため、0.5 µLのアリコートを採取します。0.5 µLのマトリックスと混合し、MALDIプレートにスポットします。このカルボキシル酸素交換反応のダイナミクスをMaldi Toof MSM S解析により分析します。IEOタイムコースワークフローは、酸性ペプチドの側鎖および末端基の酸触媒カルボキシル酸素交換反応に基づいています。まず、50 nMの各ペプチドを、0.1%最終濃度のトリクロロ酢酸の有無にかかわらず、1:1の$^{18}$O濃縮水とともにインキュベートします。反応液から0.5 µLずつ分注し、48日間毎日、マトリックスとともにMALDIターゲットプレートに直接共晶させます。定期的にMALDIターゲットプレートをMALDI-TOF MS/MSにかけ、生成物の分析を行います。このセクションの詳細は、付随する論文に記載されています。まず、ポジティブイオンモードでMSスペクトルを3連で取得します。マルチプライヤーの校正およびMS取得の設定後、サブスペクトルのシングルショットを取得します。次に、4,000シリーズExplorerデータ取得ソフトウェアからMSデータファイルをエクスポートします。その後、スペクトル処理およびピーク検出にMascot Distillerソフトウェアを利用している社内情報システムにインポートします。同位体エンベロープをデコンボリューションし、$^{18}\text{O}$取り込み率を自動的に決定します。ここで$^{18}\text{O}$取り込み率は、同位体エンベロープ全体に対する個々のペプチド同位体種の相対的な寄与分として記録します。ビンリストをフィルタリングし、各タイムコース実験について、100 ppmの質量幅で少なくとも3つの値をビンに割り当てます。関連するMSデータファイルから、検出されたすべてのペプチド種の分子量を抽出します。次に、Xpaceyを用いて、質量誤差許容範囲を200 PPMに設定し、ペプチドセットを検索します。得られたビンリストを、基質ペプチド配列から予測されるタンパク質分解切断産物のデータと比較します。find pepツールによって予測された開裂産物のすべての質量値、および18Oの取り込みが認められるビン値について、msmsスペクトルの取得に進みます。サブスペクトルあたり最大40個のサブスペクトルを1スポットにつきランダムなパターンで50ショット収集し、msmsファイルをエクスポートします。その後、ピーク検出のためにMSMSデータファイルを解析システムにエクスポートし、ペプチド同定のために、対応するbend MSデータに関連付けられたMSMSピークリストを作成します。Mascot検索エンジンで、酵素特異性「なし」、プリカーサーイオンの許容誤差を150 PPM、フラグメントイオンの質量許容誤差を0.2 Daltonに設定します。M-S-M-S-PリストをSwiss Proデータベースに対して検索します。ペプチドの同定は、さらにData Explorerソフトウェアを用いて、スペクトル時間プロットにおけるフラグメントイオン全体の特徴的な18O取り込みパターンを確認することで検証可能です。マクロを使用して、データエクスプローラーソフトウェアのASCIファイルから各反応時間点のMSデータファイルをエクスポートします。次に、それらのファイルをデータ解析およびグラフ作成ソフトウェアにインポートし、ウォーターフォールプロットとして表示して、各曲げ部分の酸素18取り込みプロットを作成します。ペプチド切断生成物から、すべての反応時間点における個々のペプチド同位体種の相対的な寄与を抽出し、時間を軸にプロットします。このようなスペクトル時間プロットは、タンパク質分解切断反応のダイナミクスを示しています。本実験では、内皮変換酵素1による生物活性ペプチド endo および C の切断を分析します。ウォーターフォール表示により、タイムコース実験のMSスペクトルをプロットし、基質の分解と中間生成物および最終生成物の出現を同時にモニタリングします。切断産物はMSMSおよびその同位体エンベロープにおける特徴的な18O組み込みシグネチャーによって同定されます。トリプシンのこの反応機構は、セリンプロテアーゼがペプチド切断産物への最大2つの18O原子の組み込みを媒介することを示しています。プロテアーゼベースのラベル化ワークフローにおいて、ペプチド結合切断反応により、新たに生成されたペプチド切断産物に対して50%の単一18O組み込み率が得られます。トリプシンのような、反応産物に再結合するプロテアーゼは、カルボキシ酸素交換反応を介して2つ目の18O原子の組み込みをさらに触媒します。平衡状態で、酸素18ラベルは、未標識、単一標識、および二重標識の生成物に1:2:1の比率で分布します。タンパク質分解末端の消化前標識ワークフローでは、ペプチド結合の切断は起こりません。その代わりに、最大2つの酸素18原子の導入は、排他的にカルボキシル酸素交換反応に基づいています。したがって、酸素18の取り込みは、ペプチド切断産物を再結合させるプロテアーゼにおいてのみ起こります。酸触媒による酸素18標識では、カルボキシ基1つにつき2つの酸素18原子が取り込まれます。本実験を通じて、アンジオテンシンIの同位体エンベロープにおける2ダルトンの整数倍の質量シフトを、酸素18原子の取り込みによってマッピングすることができます。OPE標識と高分解能質量分析を時間分解的に組み合わせることで、パレオ時間経過法（paleo time course method）を用い、ペプチド産物の生成をダイナミックに分析することが可能になります。このアッセイは、定量的および定性的なプロテオーム研究のための安定化した局所標識ペプチドの作製や、プロトピックペプチドが生成される速度論の評価に使用できます。Paleoタイムコースは、生理学的に関連のある条件下でタンパク質分解経路を評価するために設計されています。この手法は、ヒトがん微小環境における溶解プロセスの最近の調査への道を開きました。

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Research

JoVE Journal

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生物学

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、GTPアーゼおよびキナーゼドメインの両方をコードし、細胞内でリン酸化されたマルチドメインタンパク質である。ここでは、それによってその全体的なセルラphophorylationレベルを測定する手段を提供する、32 Pオルトリン酸を用いて細胞内LRRK1とLRRK2を標識するためのプロトコルを提示する。...

ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。...

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

DNA及びタンパク質は、配列特異的親和性またはDNAまたはタンパク質トランスフェラーゼおよび合成補因子類似体を用いた蛍光レポーター基で標識される。酵素の補因子特異​​性に応じて、アジリジンまたは二活性化補助因子アナログは、一次元または二段階標識のために用いられる。...

メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

ここでは、アジド含有アミノ酸を遺伝的に取り込み、続いてアジドを分子プローブとカップリングすることにより、抗体フラグメントに化学プローブを部位特異的に導入するプロトコールを提示します。これは、ひずみ促進型アジド-アルキン環化付加(SPAAC)によるものです。...

ひずみ促進アジド - アルキン環付加することにより、効率的で部位特異的抗体ラベリング

組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。...

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

このプロトコルでは、定量的かつ包括的に複数の栄養源の代謝を調査する実験手順について説明します。このワークフローは、同位体トレーサー実験と分析手順の組み合わせに基づいて決定する微生物による消費された栄養素の運命と分子 synthetized...

複数の栄養源の微生物代謝を調査するため同位体トレーサー実験の組み合わせに基づいてワークフロー

ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

酵母サッカロマイセスセレビシエから新たに転写されたRNAを敏感かつ特異的に精製するためにチオレートされたウラシルを使用する。...

4-チウラシル(Ers4tU)を使用したビボにおけるRNAの非常に迅速かつ特異的な代謝標識

タンパク質チオール酸化は、通常の生理学的および病態生理学的条件下で重要な意味を持ちます。レジンアシストキャプチャー、アイソバリック標識、質量分析を利用して、タンパク質の可逆的に酸化されたシステイン残基の部位特異的同定と定量を可能にする定量的レドックスプロテオミクス法の詳細について説明します。...

タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語)

小胞放出の動態を測定する能力は、神経伝達の基本のいくつかの洞察を提供することができます。ここでは、海馬ニューロン培養における前シナプス小胞の放出速度を測定するために赤色蛍光色素FM...

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

学ぶプロテアーゼ触媒および酸触媒による¹⁸O標識ワークフロー。タンパク質消化物への安定同位体導入法を質量分析で評価し、プロテオミクス研究の定量的・定性的解析に活用できます。

採用プロテアーゼ及び酸触媒ラベリングワークフロー

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