'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

この手順の全体的な目標は、混合コンソーシアムから単一のバリアンを分離し、得られたゲノム材料の配列を決定して、培養を必要とせずにさまざまな環境からウイルスを同定することです。これは、まず、flowのサイトメトリーソーティングを用いて単一のバリアンをaroビーズ上に単離することによって達成されます。その後、シングルイオンキャプチャーを共焦点顕微鏡でバリデーションします。

次に、ゲノム材料をイオンから単離し、多重置換増幅またはMDAを使用して増幅して、シーケンシングに必要な量のDNAを生成します。最後に、ウイルスDNAはハイスループット技術を使用して配列決定され、ビリオンゲノムの過剰なカバレッジを生成し、ゲノムの組み立てとアノテーションに実質的に役立ちます。最終的には、シーケンスサブサンプリングアプローチを使用してコンサイズを大きくすることを目的としたバイオインフォマティクス技術により、単離されたボンの分析が可能になります。

この手法は、アノテーションされたOCプランクトン遺伝子の膨大なプールにゲノムの文脈を与えることで、ウイルス生態学の分野における重要な疑問に答えるのに役立つだけでなく、さまざまな生態系からの新しいゲノムの発見を可能にします。一般に、この方法に不慣れな人は、単一イオンの増幅と単離が現在の技術の限界を押し広げているため、苦労する可能性があります。我々は、ベロプランクトンコミュニティでのMDAの使用を評価していたときに、この方法のアイデアを最初に持ち、単一のウイルス粒子と配列を選別することが可能であることに気付き、したがって、これらの複雑なコミュニティから完全なウイルスゲノムを組み立てるカスタム前方散乱光電子増倍管またはF-S-C-P-M-Tを備えたフローサイトメーターを使用してウイルスを選別するために、ウイルス粒子を0.1ミクロンのフィルター付きトリスで希釈することから始めます。 T 4 とラムダファージ粒子を含む混合集合体の EDTA は、F-S-C-P-M-T を 1000 に、SSC を 200 に設定して、S/N 比を最大化します。

対照サンプルを流した後、約100マイクロリットルの持続性ウイルス懸濁液を合計5, 000イベントまで分析します。次に、サイバーグリーンのプロットとF-S-C-P-M-Tプロットを使用して、ウイルス粒子の中心にタイトなゲートを配置します。次に、A-P-T-F-E顕微鏡スライドの各ウェルに摂氏37度に冷却したTBEバッファーに1%低融点のarosを5マイクロリットル加え、スライドをフローサイトメーターにロードして、選別されたウイルス粒子を捕捉します。

ソーティングを開始し、一部のウェルで10個以上のウイルス粒子イベントを捕捉し、共焦点レーザー走査型顕微鏡でのウイルスの深さの検出を支援します。選別が完了したら、スライドをフローサイトメーターから取り出し、さらに5マイクロリットルの低融点アロスを摂氏37度に冷却して各ウェルに加えます。ウイルス粒子を単一バリオンに埋め込みます。

共焦点レーザー走査型顕微鏡を488ナノメートルに設定します。次に、励起により、63 x の長作動距離対物レンズを使用して埋め込まれた粒子を画像化し、1 つの粒子のみが存在し、複数のウイルスが互いに重なっていないことを確認します。次に、単一のウイルスを含むウェルが特定されたら、カミソリの刃を使用してスライドから目的のアグロスビーズを取り除き、滅菌PCRチューブに入れます。

チューブを摂氏94度に設定したサーモサイクラーのヒートブロックに3分間置き、ウイルス粒子をその場でシラシにします。次いで、改変MDAを行った後、ゲノムDNAを1.7ミリリットルのeinor tubeに移し、TBE緩衝液中に3モル酢酸ナトリウムの10番目の容量を添加し、増幅したゲノム材料を精製するために、サンプルを摂氏55度で10分間置いてarosを溶解し、次いでチューブを摂氏42度に移動して温度を下げてから酵素を添加する。次に、各チューブに2ユニットのβ aaseを加え、チューブを2時間インキュベートします。

次に、各チューブに1容量の緩衝液飽和フェノール溶液を加えます。激しく混合し、チューブを室温 G.At 500倍で15分間遠心分離し、SUPERNATANTSを含むDNAを新しい1.7ミリリットルのeinorチューブに移します。次に、100%イソプロパノール1容量とグリコブルー1マイクロリットルをチューブに加え、チューブを再度遠心分離した後、チューブを反転させて混合します。

今回は28,000倍Gと摂氏4度で60分間です。イソプロパノールをデカントし、ペレットを乱さないように注意し、各チューブに150マイクロリットルの70%エタノールを追加します。チューブを28, 000回で10分間回転させます。

Gを室温で。エタノールを自然乾燥させ、DNAペレットをデカントし、DNAを適量のトリスEDTAバッファーに再懸濁します。このサイバーグリーンの3次元再構成は、アグロスピードで染色された1つのウイルス粒子を共焦点レーザー顕微鏡で可視化し、アロスに埋め込まれた後に各ウェルで単一のビリオンが得られることを確認し、インセットは単離されたウイルス粒子のより高い倍率を示しています。

ここでは、arosビーズ内の染色された単一ウイルス粒子の相対蛍光のプロファイルプロットが示されています。この最後の一連の図は、最初の5つの塩基対を除くラムダゲノムのほぼ全体が、この代表的なウイルスについてどのように回復したかを示しています。以下は、単一のウイルスのGCプロットです。

同定されたゲノムが示されています。この図は、ラムダのゲノムマップを示しています。最後に、代表的な単離および増幅された細菌ファージラムダについて、単一のウイルスゲノムのマッピングが示されています。

X軸はゲノムの位置を示しています。Y 軸はカバレッジの割合を示します。この手順を試みるときは、滅菌技術を使用し、汚染が回避されるように時間をかけることが重要です。

この手順に続いて、全ゲノムシーケンシングの前に単離されたバリアンの分類法を評価するために、他の方法を使用してもよい。このビデオを見れば、蛍光活性化細胞ソーティング、共焦点顕微鏡、および全ゲノム増幅を使用してシングルバリアを分離する方法がよくわかるはずです。