'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

この手順の全体的な目的は、混合コンソーシアムから単一のビリオンを単離し、得られたゲノム材料をシーケンシングすることで、培養を必要とせずに多様な環境からウイルスを同定することです。これは、まずフローサイトメトリーによるソーティングを用いてアガロースビーズ上に単一ビリオンを単離することで達成されます。その後、共焦点顕微鏡を用いて単一ビリオンのキャプチャを確認します。

次に、ビリオンからゲノム物質を単離し、多重置換増幅（MDA）を用いて増幅させ、シーケンシングに必要な量のDNAを生成します。最後に、ハイスループット技術を用いてウイルスDNAをシーケンシングし、ビリオンゲノムの十分なカバレッジを得ることで、ゲノムアセンブリとアノテーションを大幅に効率化します。最終的に、コンティグサイズを拡大するためのシーケンスサブサンプリング手法を用いたバイオインフォマティクス解析により、単離されたビリオンの解析が可能になります。

この手法は、アノテーションされていない膨大な量のリリプランクトン遺伝子にゲノム的なコンテキストを与えることで、ウイルス生態学分野における重要な疑問への回答に寄与し、多様な生態系からの新しいゲノムの発見を可能にします。一般的に、この手法に不慣れな方は、単一のビリオンの増幅と単離が現在の技術の限界に近いものであるため、困難に直面することがあります。私たちは、リリプランクトンコミュニティへのMDAの適用を評価していた際に、単一のウイルス粒子を分取し、シーケンシングすることで、これらの複雑なコミュニティから完全なウイルスゲノムを構築できることに気づき、この手法を考案しました。カスタムの前方散乱光光電子増倍管（FSCPMT）を備えたフローサイトメーターを用いてウイルスを分取します。まず、ウイルス粒子を0.1 µmフィルターでろ過したTris-EDTAで希釈します。T4およびλファージ粒子を含む混合群の場合、S/N比を最大化するために、FSCPMTを1000に、SSCを200に設定してください。

コントロールサンプルを走行させた後、染色したウイルス懸濁液を約100 µL、計5,000イベントになるまで走行させます。次に、SYBR Green IおよびFSCPMTプロットを用いて、ウイルス粒子の中心にタイトなゲートを設定します。続いて、37 °Cに冷却したTBEバッファー調製の1%低融点アガロース5 µLをPTFE顕微鏡スライドの各ウェルに加え、スライドをフローサイトメーターにロードして、分取したウイルス粒子を回収します。

ソーティングを開始し、共焦点レーザー走査顕微鏡でのウイルスの深さの検出を容易にするため、一部のウェルに10個以上のウイルス粒子イベントをキャプチャします。ソーティングが完了したら、フローサイトメーターからスライドを取り出し、ウイルス粒子を埋め込んだ各ウェルに、37 °Cに冷却した低融点アガロースをさらに5 µL加えます。単一のビリオンの場合、共焦点レーザー走査顕微鏡の励起波長を488 nmに設定します。次に、63 xの長作動距離対物レンズを用いて埋め込まれた粒子をイメージングし、単一の粒子のみが存在し、複数のウイルスが重なり合っていないことを確認します。単一のウイルスを含むウェルが特定されたら、カミソリ刃を用いて目的のアガロースビーズをスライドから取り除き、滅菌済みのPCRチューブに入れます。

ウイルス粒子をin-situで溶解させるため、チューブを94 °Cに設定したサーモサイクラーのヒートブロックに3分間置きます。次に、改変MDAを行った後、ゲノムDNAを1.7 mLのエッペンドルフチューブに移し、増幅されたゲノム物質を精製するために、TBEバッファー中の3 M酢酸ナトリウムを1/10量加えます。サンプルを55 °Cで10分間保持してアガロースを溶解させ、その後、酵素を添加する前に温度を下げるため、チューブを42 °Cに移します。ここで、各チューブに2 UのBeta-agaraseを加え、2時間インキュベートします。

次に、各チューブに1容量の緩衝飽和フェノール溶液を加えます。激しく混合し、室温で 3,500 ×g で15分間遠心分離します。DNAを含む上清を新しい 1.7 mL エッペンドルフチューブに移します。続いて、100%イソプロパノール1容量とGlyco-Blue 1 µLをチューブに加え、チューブを反転させて混ぜ合わせます。再度、今回は 4 °C で 28,000 ×g で60分間遠心分離した後、ペレットを乱さないように注意しながらイソプロパノールをデカンテーションし、各チューブに 70%エタノール 150 µLを加えます。室温で 28,000 ×g で10分間遠心分離します。エタノールをデカンテーションし、DNAペレットを風乾させた後、適切な量のTris-EDTA緩衝液でDNAを再懸濁します。アガロースビーズ内のSYBR Green I染色されたウイルス粒子のこの3次元再構成像は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、アガロースに捕捉・埋め込まれた後、各ウェルに単一のビリオンが得られたことを視覚化し、確認できることを示しています。挿入図は、単離されたウイルス粒子の高倍率像です。

ここでは、アガロースビーズ内の染色された単一ウイルス粒子の相対蛍光のプロファイルプロットを示します。この最後の図のシリーズは、最初の5塩基対を除いて、この代表的なウイルスのLambdaゲノムのほぼ全体が回収されたことを示しています。ここでは、同定された単一ウイルスゲノムのGCプロットを示します。この図は、lambdaのゲノムマップを示しています。最後に、代表的な単離・増幅されたバクテリオファージlambdaにおける単一ウイルスゲノムのマッピングを示します。X軸はゲノム上の位置を、Y軸はカバレッジ率を示しています。

この手順を試みる際は、無菌操作を行い、汚染を確実に回避するために時間をかけることが重要です。本手順の後、全ゲノム解析を行う前に、単離したビリオンの分類を評価するために他の手法を用いる場合があります。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリー（FACS）、共焦点顕微鏡、および全ゲノム増幅を用いて単一のビリオンを単離する方法を十分に理解できるはずです。