'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析
2013年5月26日
単一のウイルスゲノム（SVG）は、単一のビリオンのゲノムを分離して増幅する方法である。混合された集合体のウイルス懸濁することにより、ビリオンを捕捉し、下流の処理中にゲノムせん断を低減、アガロースを含む個別のウェルを有する顕微鏡スライド上にフローサイトメトリーを用いてソートされる。全ゲノム増幅は、配列決定のために適しているゲノム材料をもたらす複数の置換増幅（MDA）を用いて達成される。
この手順の全体的な目標は、混合コンソーシアムから単一のバリアンを分離し、得られたゲノム材料の配列を決定して、培養を必要とせずにさまざまな環境からウイルスを同定することです。これは、まず、flowのサイトメトリーソーティングを用いて単一のバリアンをaroビーズ上に単離することによって達成されます。その後、シングルイオンキャプチャーを共焦点顕微鏡でバリデーションします。
次に、ゲノム材料をイオンから単離し、多重置換増幅またはMDAを使用して増幅して、シーケンシングに必要な量のDNAを生成します。最後に、ウイルスDNAはハイスループット技術を使用して配列決定され、ビリオンゲノムの過剰なカバレッジを生成し、ゲノムの組み立てとアノテーションに実質的に役立ちます。最終的には、シーケンスサブサンプリングアプローチを使用してコンサイズを大きくすることを目的としたバイオインフォマティクス技術により、単離されたボンの分析が可能になります。
この手法は、アノテーションされたOCプランクトン遺伝子の膨大なプールにゲノムの文脈を与えることで、ウイルス生態学の分野における重要な疑問に答えるのに役立つだけでなく、さまざまな生態系からの新しいゲノムの発見を可能にします。一般に、この方法に不慣れな人は、単一イオンの増幅と単離が現在の技術の限界を押し広げているため、苦労する可能性があります。我々は、ベロプランクトンコミュニティでのMDAの使用を評価していたときに、この方法のアイデアを最初に持ち、単一のウイルス粒子と配列を選別することが可能であることに気付き、したがって、これらの複雑なコミュニティから完全なウイルスゲノムを組み立てるカスタム前方散乱光電子増倍管またはF-S-C-P-M-Tを備えたフローサイトメーターを使用してウイルスを選別するために、ウイルス粒子を0.1ミクロンのフィルター付きトリスで希釈することから始めます。 T 4 とラムダファージ粒子を含む混合集合体の EDTA は、F-S-C-P-M-T を 1000 に、SSC を 200 に設定して、S/N 比を最大化します。
対照サンプルを流した後、約100マイクロリットルの持続性ウイルス懸濁液を合計5, 000イベントまで分析します。次に、サイバーグリーンのプロットとF-S-C-P-M-Tプロットを使用して、ウイルス粒子の中心にタイトなゲートを配置します。次に、A-P-T-F-E顕微鏡スライドの各ウェルに摂氏37度に冷却したTBEバッファーに1%低融点のarosを5マイクロリットル加え、スライドをフローサイトメーターにロードして、選別されたウイルス粒子を捕捉します。
ソーティングを開始し、一部のウェルで10個以上のウイルス粒子イベントを捕捉し、共焦点レーザー走査型顕微鏡でのウイルスの深さの検出を支援します。選別が完了したら、スライドをフローサイトメーターから取り出し、さらに5マイクロリットルの低融点アロスを摂氏37度に冷却して各ウェルに加えます。ウイルス粒子を単一バリオンに埋め込みます。
共焦点レーザー走査型顕微鏡を488ナノメートルに設定します。次に、励起により、63 x の長作動距離対物レンズを使用して埋め込まれた粒子を画像化し、1 つの粒子のみが存在し、複数のウイルスが互いに重なっていないことを確認します。次に、単一のウイルスを含むウェルが特定されたら、カミソリの刃を使用してスライドから目的のアグロスビーズを取り除き、滅菌PCRチューブに入れます。
チューブを摂氏94度に設定したサーモサイクラーのヒートブロックに3分間置き、ウイルス粒子をその場でシラシにします。次いで、改変MDAを行った後、ゲノムDNAを1.7ミリリットルのeinor tubeに移し、TBE緩衝液中に3モル酢酸ナトリウムの10番目の容量を添加し、増幅したゲノム材料を精製するために、サンプルを摂氏55度で10分間置いてarosを溶解し、次いでチューブを摂氏42度に移動して温度を下げてから酵素を添加する。次に、各チューブに2ユニットのβ aaseを加え、チューブを2時間インキュベートします。
次に、各チューブに1容量の緩衝液飽和フェノール溶液を加えます。激しく混合し、チューブを室温 G.At 500倍で15分間遠心分離し、SUPERNATANTSを含むDNAを新しい1.7ミリリットルのeinorチューブに移します。次に、100%イソプロパノール1容量とグリコブルー1マイクロリットルをチューブに加え、チューブを再度遠心分離した後、チューブを反転させて混合します。
今回は28,000倍Gと摂氏4度で60分間です。イソプロパノールをデカントし、ペレットを乱さないように注意し、各チューブに150マイクロリットルの70%エタノールを追加します。チューブを28, 000回で10分間回転させます。
Gを室温で。エタノールを自然乾燥させ、DNAペレットをデカントし、DNAを適量のトリスEDTAバッファーに再懸濁します。このサイバーグリーンの3次元再構成は、アグロスピードで染色された1つのウイルス粒子を共焦点レーザー顕微鏡で可視化し、アロスに埋め込まれた後に各ウェルで単一のビリオンが得られることを確認し、インセットは単離されたウイルス粒子のより高い倍率を示しています。
ここでは、arosビーズ内の染色された単一ウイルス粒子の相対蛍光のプロファイルプロットが示されています。この最後の一連の図は、最初の5つの塩基対を除くラムダゲノムのほぼ全体が、この代表的なウイルスについてどのように回復したかを示しています。以下は、単一のウイルスのGCプロットです。
同定されたゲノムが示されています。この図は、ラムダのゲノムマップを示しています。最後に、代表的な単離および増幅された細菌ファージラムダについて、単一のウイルスゲノムのマッピングが示されています。
X軸はゲノムの位置を示しています。Y 軸はカバレッジの割合を示します。この手順を試みるときは、滅菌技術を使用し、汚染が回避されるように時間をかけることが重要です。
この手順に続いて、全ゲノムシーケンシングの前に単離されたバリアンの分類法を評価するために、他の方法を使用してもよい。このビデオを見れば、蛍光活性化細胞ソーティング、共焦点顕微鏡、および全ゲノム増幅を使用してシングルバリアを分離する方法がよくわかるはずです。
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概要
シングルウイルスゲノミクス（SVG）は、混合ウイルス懸濁液から単一のウイルス粒子（viron）のゲノムを分離し増幅するように設計された方法です。この技術はフローサイトメトリーを分類に使用し、全ゲノム増幅には複数置換増幅（MDA）を用いて、その後のシーケンシングを可能にします。
主要な研究構成要素
科学分野
- ウイルス学
- ゲノミクス
- 微生物学
背景
- 単一のウイルス粒子を分離することで、培養なしでウイルスゲノムを研究できます。
- フローサイトメトリーは、ウイルス粒子をアガロースビーズに分類するために使用されます。
- 共焦点顕微鏡は、単一のウイルス粒子の捕獲を確認します。
- ゲノム分析には、ハイスループットシーケンシング技術が使用されます。
研究の目的
- 混合コンソーシアムから単一のウイルス粒子を分離すること。
- ウイルスの識別のためにゲノム物質をシーケンシングすること。
- バイオインフォマティクスを通じてゲノムアセンブリとアノテーションを強化すること。
使用した方法
- ウイルス懸濁液のフローサイトメトリック分類。
- 捕獲したウイルス粒子からのゲノム物質の分離。
- DNA増幅のための複数置換増幅（MDA）。
- 包括的なゲノムカバレッジのためのハイスループットシーケンシング。
主要な結果
- 混合サンプルからの単一のウイルス粒子の成功的な分離。
- MDAを通じてシーケンシングに十分なDNAの生成。
- ゲノムアセンブリに役立つハイカバレッジシーケンシング。
- データ分析のためのバイオインフォマティクス技術の適用。
結論
- SVGは多様な環境におけるウイルスゲノムの研究に効果的です。
- この方法は処理中のゲノム破壊を減少させます。
- バイオインフォマティクスは、分離されたウイルス粒子の分析を強化します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Single Virus Genomics (SVG) enables cultivation-free genomic characterization of individual virions, addressing a critical gap in viral ecology and discovery pipelines. By isolating and amplifying single viral genomes from complex mixtures, SVG supports target de-risking and predictive confidence in early-stage antiviral and phage therapy research. This method enhances portfolio relevance by providing high-resolution genomic data from unculturable viruses, informing mechanistic studies and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral hypotheses by providing genomic context to individual virions from mixed environmental samples.
- Operational Value: Supports biological de-risking through cultivation-free isolation, reducing false negatives in target identification.
- Predictive Value: Generates high-coverage sequencing data that aids in genome assembly and annotation, improving confidence in viral target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-molecular-weight genomic DNA via MDA, enabling reliable downstream sequencing and comparative analysis.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through flow cytometry-based sorting and confocal validation, ensuring reproducible single-virion capture.
- Scalability: Allows processing of thousands of events via flow cytometry, supporting high-throughput screening of viral diversity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viral genome data to preclinical validation by enabling sequence-based taxonomy and functional inference.
- Biomarker Alignment: Supports identification of viral genomic signatures that may correlate with pathogenic potential or host interaction profiles.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in viral target selection through direct genomic evidence.
Pipeline & Workflow Integration
SVG fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and target validation prior to lead identification and preclinical evaluation. Its output—amplified, sequencable viral DNA—directly enables genomic screening and comparative analytics workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating single virons for genomic interrogation, clarifying viral diversity and functional potential in complex communities.
- Screening: Enables assay standardization through flow sorting and MDA amplification, providing reproducible inputs for sequencing-based screening platforms.
- Analytics: Generates quantitative genomic outputs (coverage, GC content, genome maps) that allow cross-condition comparison and variant calling.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing genome-resolved data that can inform biomarker development and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for viral genome characterization across diverse ecosystems, reducing reliance on cultivation-dependent methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in viral target validation by delivering cultivation-free, genome-resolved data from single particles.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through validated single-virion capture via flow cytometry and confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of viral targets, reducing investment in non-viable or poorly characterized candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering high-confidence genomic data that informs advancement decisions in antiviral and phage-derived therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, confocal microscopy, and molecular biology for single-particle handling and amplification.
- Dependent on access to flow cytometers with custom scatter detection and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation, contamination control, and bioinformatic analysis across teams.
- Must account for variability in viral size, density, and staining efficiency when adapting to diverse viral systems or environmental samples.
- Practical limitations include amplification bias and stochastic sampling effects inherent to single-cell/single-virion MDA approaches.
