Name: 異なる動物モデルにおけるNADPHオキシダーゼ活性の生物発光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学ぶNADPHオキシダーゼ由来活性酸素種の生体内発光イメージング法。マウスの3つの炎症モデルを用いて、侵襲性を最小限に抑えたリアルタイムモニタリングにより、炎症におけるROS動態を可視化し、治療戦略の開発に貢献します。

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この作品は、NIHのRO1 AI079253と退役軍人局によって資金を供給された。

1。動物モデル<ol><li>マウス：P47-phoxの使用/ -マウスでは、年齢と性別をマッチC57BL6/DBAマウスを。インスティテューショナル·動物実験委員会の実験のための認可を受けなければならない。 </li><li>麻酔：麻酔を誘導するために、連続イソフルラン管理システムを使用してください。気化器システム（VetEquip）は（2-3％）イソフルランで満たされている。マウスが外部刺激に応答して、呼吸、動き、角膜反射を観察することによって、完全に麻酔されていることを確認。 </li><li>外科的処置：70％エタノールで手術領域（ベンチ）をスクラブ。滅菌手袋と清潔な手術衣とマスクを着用してください。髪をクリッピングし、切開が行われるエリアに、70％エタノールで交互ベタジンを適用することにより、マウスを準備します。無菌の表面に手術を行い、滅菌器を使用します。目を覚まして、自由に移動するまで、術後マウスを監視します。 </li><li>気管内ザイモサン管理<ol><li>麻酔を投与1.2で説明したように。 </li><li>ベタジンと70％エタノールで手術領域（首）を消毒し、外科切開により気管を露出させる。 </li><li> 27ゲージの針で突き刺す気管および滅菌PBSに溶解した0.5μg/μLの溶液（25gのマウスの総体積50μl）を用いて1μg/ gの用量でザイモサン（セントルイス、MO）を注入。 </li><li>クローズマウスの首は無菌条件下で5から0無菌絹縫合糸で巻いた。 </li><li> 4時間及び24時間後の画像。 </li></ol></li><li>盲腸結紮及び穿刺<ol><li> 1.2で説明したように麻酔を管理します。 </li><li>手術部位（腹部）で髪をクリップしてベタジンと70％エタノールで消毒してください。 </li><li>正中開腹術を行い、盲腸を識別します。 </li><li> 4から0絹縫合糸と、21ゲージの針を1パスで結紮に対して遠位穿刺盲腸で露光盲腸の先端50％をライゲーションする。 </li><li> 4から0無菌絹縫合糸で切開を閉じます。 </li><li> 4時間後の画像と（24時間）。 </li></ol></li><li>オーラル四塩化炭素（CCl 4）投与<ol><li> 1.2で説明したように麻酔を管理します。 </li><li>経口胃管栄養法によりトウモロコシ油に溶解CCl 4の （2μg/ gで、セントルイス、ミズーリ州）を管理する。四塩化炭素投与の手順はIBC / EHS方針に従って、指定された領域で実行する必要があります。 </li><li> 4時間及び24時間後の画像。 </li></ol></li></ol> 2。生物発光画像を取得する<ol><li>発光モードに設定IVIS 200（Xenogenコーポレーション、アラメダ、カリフォルニア州）イメージングシステムを、初期化して、電荷結合素子（CCD）をロックするために、温度を待つ。 </li><li>露光時間、ビニング（媒体）とF /ストップ（8）の設定を選択します。 </li><li>正常な体温を維持するために加熱されたステージ上でのイメージングチャンバー内に仰臥位にマウスを置きます。ノーズコーンを介して、1.2で説明したようにマウスがIVISイメージング室にいる間麻酔を管理します。 </li><li> L-012を投与する<html> （20μg/ g）をイメージングのために選択された各時点における眼窩注射により静脈内（10μg/μLの）滅菌PBSに溶解した。 </li><li> L-012注射後2分で始まる画像をキャプチャします。我々は通常、40秒露出を使用しています。 </li></ol> 3。関心領域を使用してデータ解析<ol><li>リビングImageソフトウェアV.4.2（Xenogenコーポレーション、アラメダ、CA）を使用してデータを分析します。 </li><li>画像を開いて、インタレスト·ツールの領域の測定を選択します。 </li><li>胸部および/または腹部の上にマウスの写真画像の上に擬似色のデジタル画像を（光子検出を表す）を重ね合わ後の利息の形状や大きさの領域を選択します。 </li><li>関心領域からの信号強度（光子束）を定量化する。 </li></ol> 4。統計<ol><li>個々の時点でBonferroniの事後テストで2-way ANOVAを実行するための統計解析ソフトウェア·パッケージを使用しています。 </li></ol>TLE &quot;&gt; 5。代表的な結果ザイモサンは、炎症誘発性酵母細胞壁製品とNADPHオキシダーゼ3の強力な活性化因子である。我々は以前にその気管ザイモサンを示しphoxのP47-/で、より堅牢な好中球の肺の炎症と炎症性サイトカインの産生を誘導する-マウス1、野生型と比較した。ザイモサンチャレンジ後のマウス-ここでは、私たちの目標は、野生型とP47-phoxの/の肺におけるROS産生を比較することであった。 4時間および24時間後のマウス-気管ザイモサン投与後4時間後に、我々は、ベースラインと同様にP47-phoxの/に比べて野生で光子放出の増加と比較して、野生型マウスでは胸の上に光子放出の大幅な増加が観察された。これとは対照的に、P47-phoxの/生物発光シグナル-マウスはザイモサン処理（ 図1-B）後4時間でベースラインレベルにとどまっている。したがって、NADPHオキシダーゼはbに表示されます電子ザイモサン投与後の肺内のROS生成の主要な源。 次に、我々は、CLP誘発性敗血症モデルにおけるROS産生を評価した。敗血症、急性肺損傷（ALI）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）4,5を含む末端器官の損傷に関連する生命を脅かす症候群です。 ROS媒介損傷は敗血症誘発多臓器不全を駆動する重要な因子であると考えられている。私たちは、ROSが有意に胸（4時間）の上とベースラインと比較して野生型マウスでCLPに続く腹部（24時間）以上に増加したことが分かった。しかし、P47-phoxの/のROSレベル-マウスの時点（ 図2 AC）の両方でベースラインレベルと同様であった。これらの結果は、CLP誘発性敗血症のマウスモデルにおけるROSの生成はNADPHオキシダーゼ依存であることを示している。 最後に、我々はCCl 4誘発肝傷害モードでROS産生を検出するために、生物発光イメージングを使用リットル。 四塩化炭素は、肝細胞の壊死を引き起こし、急性肝障害や肝線維症6の両方をモデル化するために使用されています。炎症やけがの前述のモデルとは対照的に、我々は、腹部におけるROS産生は控えめに（約35％）P47-phoxの/にベースラインと比較して増加していたことがわかった- 4時間以下のCCl 4投与のマウス。マウス（ 図3-B） -しかし、 四塩化炭素誘発性のROS生成の大きさは、P47-phoxの/よりも野生型マウスでは有意に大きかった。これらのデータは、両方P47 phoxの含有NADPHオキシダーゼ依存性および非依存性のROS産生が急性四塩化炭素誘発肝傷害で起こることを示唆している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" /> ザイモサン処理後の肺の中の図1：ROS産生。 A）代表bioluminescenROS産生のCEイメージング。マウスや腹部の発光がザイモサン処理によって変更されていません-胸に加えて、発光が野生型とP47-phoxの/の両方で腹部上に検出可能であることに注意してください。野生型とP47-phoxの/の胸からB）の光子数-ザイモサンの（IT）の気管内単回注射後のマウス。生物発光イメージングは​​、ベースライン、4時間、および24時間で行った。胸上の関心領域からの発光は示さ擬似カラースケールを用いて同定した。結果は平均として提示されている±SE、nはグループあたり= 6-9、* = p &lt;0.05で。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank">拡大図はこちらをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" /> 図2 ROSの検出は、以下のCLP。 ROSの産生、Bの）代表生物発光イメージング）胸から光子カウント、および野生型とP47-phoxの/の腹部からC）の光子カウント-ベースライン時にマウス、4時間、およびCLP後24時間。結果は平均として提示されている値±SE、群あたりn = 4-5、* = p &lt;0.05で。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank">拡大図はこちらをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" /> 後腹部のCCl 4誘発肝傷害における図3 ROS産生。経口CCl 4の治療後、ベースライン時のマウス、4時間、および24時間- ROS産生と野生型とP47-phoxの/の腹部からB）の光子数の）代表生物発光イメージング。のn = 4-5グループごと、* = p &lt;0.05で、結果は平均±SEとして提示されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank">にはここをクリックして拡大図</a> </&gt;。

<ol><li>Segal, B., Han, W., Bushey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+limits+innate+immune+response+in+the+lungs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice.</a> PLoS ONE. 5, e9631(2010).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

生きている動物での活性酸素種の &quot;リアルタイム&quot;測定（ROS）は、蛍光および化学発光プローブを使用することによって達成することができます。蛍光プローブは、弱い信号対雑音比12を有する苦しむ一方で、説明イメージング技術は、ルミノールベース基板のL-012とROSの化学反応後の発光の検出に敏感である。すべての生物発光イメージング技術と同様に、この方法論は、臓器や組織から波長依存光吸収や散乱によって制限されます。マウス-これらの実験は、野生型とP47-phoxの/におけるROSの測定のための適切な実験条件を確立することに焦点を当てていた。これらの遺伝子改変マウスの使用は他の経路によって生成されたROSからP47 phoxの含有NADPHオキシダーゼによって生成されたROSを区別することを可能にする。 phoxの P47 を含む機能性NADPHオキシ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> L-012 </td><td>和光ケミカルUSA社</td><td> 120から04891 </td><td></td></tr><tr><td>ザイモサン</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td><td> Z4250 </td><td></td></tr><tr><td>四塩化炭素</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td><td> 289116 </td><td></td></tr></tbody></table>

異なる動物モデルにおけるnadphオキシダーゼ活性の生物発光イメージング

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPHオキシダーゼは、抗菌剤および抗真菌宿主防御を仲介する重要な酵素である。抗菌宿主防御における役割に加えて、NADPHオキシダーゼは、炎症反応を調節する重要な1シグナリング機能を持っています。したがって、NADPHオキシダーゼ由来のROS生成の &quot;リアルタイム&quot;の動態に測定する方法の開発が防衛、炎症やけがをホストするために関連するメカニズムを理解するための貴重な研究ツールであることが期待されています。 慢性肉芽腫症（CGD）は重篤な感染症や過度の炎症を特徴とNADPHオキシダーゼの遺伝性疾患です。食細胞NADPHオキシダーゼの活性化は、その細胞質サブユニット（P47 phoxの 、P67 phoxの 、およびp40 phoxの ）および膜結合flavocytochrome（gp91 phoxおよびP22 phoxのヘテロ二量体で構成される）へのRacの移行が必要。損失CGDでこれらのNADPHオキシダーゼコンポーネントの結果のいずれかの機能変異の。 CGDの患者と同様に、gp91 phoxの欠損マウスとP47 phoxの欠損マウスは、欠陥のある食細胞NADPHオキシダーゼ活性と障害ホスト防御13、14を持っています。上記のNADPHオキシダーゼ成分を含んでいて食細胞に加えて、他の種々の細胞型は、NADPHオキシダーゼの異なるアイソフォームを発現している。 ここで、我々は生きているマウスではROS産生を定量化すると炎症やけがのモデルでROS生成にNADPHオキシダーゼの貢献を線引きする方法を説明します。このメソッドは、電荷結合素子（CCD）によって記録される発光を発するように、L-012（ルミノールのアナログ）と反応し、ROSに基づいています。 L-012プローブの元の説明では、L-012-依存性化学発光は完全にこの反応で検出された主なROSはスーパーであったことを示す、スーパーオキシドジスムターゼにより廃止されましたオキシドアニオン15。その後の研究では、L-012は、反応性窒素種16、17を含む他のフリーラジカルを検出することができることが示されている。ヒェランら17 ホルボールミリスチン酸アセテート、NADPHオキシダーゼの強力な活性化因子、のその局所適用を示し、発光プローブのL-012を使用してマウスで検出することができオキシダーゼ依存ROS生成をNADPHに導いた。このモデルでは、彼らは、L-012-依存発光はP47 phoxの欠損マウスでは廃止されたことを示した。 我々は、野生型マウスとNADPHオキシダーゼ欠損P47 phoxの-/内ROS生成比較して-次の3つのモデルのマウス2：ザイモサン、NADPHオキシダーゼを活性化することができる壁由来製品プロ炎症性真菌細胞の1）気管内投与、2）盲腸結紮及び穿刺（CLP）、二次急性肺の炎症や損傷を伴う腹腔内敗血症のモデル、3）経口四塩化炭素（ 四塩化炭素）、ROS依存肝損傷のモデル。これらのモデルは、具体的にそれぞれ、非感染性の炎症、複数菌による敗血症、毒素誘発性臓器障害の文脈においてNADPHオキシダーゼ依存ROS生成を評価するために選択した。 P47に野生型マウスでは生物発光を比較phoxの-/ -マウスたちは、これらのモデルにおける生物発光信号にP47 phoxの含有NADPHオキシダーゼによって生成ROSの具体的な貢献を線引きすることができます。 P47に比べて野生型マウスでは増加したROSレベルを示した生物発光イメージング結果phoxの-/ -マウスでは、NADPHオキシダーゼは、炎症性刺激に応答して活性酸素の発生の主な原因であることが示された。この方法は、in vivoで炎症時ROS生成の&quot;リアルタイム&quot;モニタリングのための低侵襲なアプローチを提供します。

NADPHオキシダーゼは、食細胞内の活性酸素種の主要な供給源（ROS）です。なぜならROSのはかない性質のために、生きている動物のROSレベルを測定し、監視することは困難である。生きたマウスにおけるROSのシリアル定量化のための低侵襲的方法が記載されている。

異なる動物モデルにおけるNADPHオキシダーゼ活性の生物発光イメージング

NADPHオキシダーゼは、抗菌および抗真菌の宿主防御を媒介する重要な酵素である。抗微生物宿主防御における役割に加えて、NADPH...

この手順の全体的な目的は、3種類の異なる炎症マウスモデルにおいて、N-A-D-P-Hオキシダーゼ由来の活性酸素種（ROS）の生成をリアルタイムでモニタリングするための低侵襲的なアプローチを提供することです。最初のモデルはXanの気管内投与であり、前炎症分子であるXanを麻酔下にあるマウスの気管内に注入します。XanはN-A-D-P-Hオキシダーゼを活性化させることができる、真菌細胞壁由来の産物です。2番目のモデルは、盲腸結紮および穿刺（CLP）です。ここではマウスの腹部を切開し、盲腸をシルク縫合糸で結紮した後、針で穿刺することで、腹腔内敗血症および二次的な急性肺炎症と損傷を誘発します。3番目のモデルは、四塩化炭素の経口投与です。四塩化炭素は肝細胞壊死を引き起こし、急性肝損傷と肝線維化の両方のモデルとして利用できます。モデルマウスを用いて生物発光イメージングを行い、ROS産生を評価します。得られたデータは、炎症刺激に応答したROS生成の主な供給源がN-A-D-P-Hオキシダーゼであることを示しています。本手法の既存の手法（例えばフローレンスプローブなど）に対する大きな利点は、生体内（in vivo）での炎症時におけるRS生成をリアルタイムでモニタリングするための低侵襲なアプローチを提供できる点にあります。本手法は、肺の炎症および損傷におけるRSの役割など、生体防御における炎症と損傷に関する重要な疑問を解明するのに役立ちます。我々は、宿主防御における活性酸素種の役割についての研究を開始した際に、本手法の着想を得ました。本ビデオで示すROS生成の3つの動物モデルすべてにおいて、この手法を適用しました。P 47 Fox ヌルマウスおよび、年齢と性を一致させた C 57 BL six DBA マウスを使用します。xin の気管内投与に備え、施設内の動物実験委員会から実験の承認を得てください。手術台を 70%ethanol で滅菌し、滅菌パッドで覆います。手術操作は、清潔な手術衣、手袋、マスクを着用し、麻酔用の滅菌器具を使用して行う必要があります。持続的イソフルラン投与システムの気化器に2～3%のイソフルランを満たし、電源を入れます。その後、2～3分後にマウスを麻酔チャンバーに入れ、足指をつねって反応を確認し、呼吸と動きを観察することで、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認してください。呼吸数を約50%減少させる必要があります。次に、バリカンを使用してマウスの頸前部の切開部位を剃毛します。マウスを手術台の上に直線的に配置し、麻酔を維持するためにノーズコーンを装着します。ベタジンと70%エタノールを交互に3回、頸部に塗布します。次に、まっすぐで鋭い鋏を用いて、前頸部の皮膚を約0.5センチメートル切開します。続いて、弯曲鉗子を用いて気管周囲の筋肉を剥離して気管を露出し、Xanを気管内に投与します。27ゲージの針を装着した注射器を用い、軟骨環の間の部位で気管を穿刺してください。次に、針を前方に向け、体重1gあたり1µgのXanをゆっくりと注入します。術後、5-0の滅菌ナイロン縫合糸で切開部を閉鎖します。マウスを平らな紙で覆ったリカバリーケージに入れ、リカバリーケージの半分をヒーティングパッドの上に設置します。マウスが覚醒し、自由に動き回るまで観察します。2回目の結紮と穿刺を行うには、麻酔をかけたマウスの腹部をバリカンで除毛し、手術台の上に仰向けに配置します。その後、ベタジンと70% ethanolで手術部位を消毒します。以前の手順と同様に、メスの代わりにハサミを用いて、腹部正中線の皮膚に1.5 centimeterの切開を加えます。腹膜を切開し、リトラクターで腹腔を開いて、腹腔の左側に位置する盲腸を特定し、露出させます。非圧砕性鉗子を用いて、盲腸を体外に抽出します。次に、露出した盲腸の遠位50%を4-0シルク縫合糸で結紮します。21ゲージの針を用いて、結紮部の遠位側で盲腸に穿孔します。その後、盲腸を腹腔内に戻します。4本の滅菌ナイロン縫合糸を用いて腹壁を閉鎖します。次に、5本の滅菌ナイロン縫合糸で切開部を縫合します。2.5 µgのブプレノルフィンを含む生理食塩水を0.5 mL皮下投与し、これまでと同様に術後の観察を行います。経口四塩化炭素投与は、活性酸素種（ROS）依存性の肝損傷モデルです。四塩化炭素を経口ゾンデで投与するため、マウスを項皮固定して麻酔をかけ、食道と頭部が垂直に一直線になるように保持します。次に、四塩化炭素を満たした22ゲージの投与用針の先端を切歯の後方に挿入し、喉の奥から食道へと導いてプランジャーを押し、四塩化炭素を投与します。投与後は、マウスが回復するまで観察してください。生物発光イメージングは、ROS産生誘導の前、および誘導後4時間と20時間の時点で取得する必要があります。この操作を行うには、Live Image 4.2 ソフトウェアを開きます。次に、IVIS 200 イメージングシステムを初期化します。「Initialize」をクリックし、システムをルミネッセンスモードに設定してください。ソフトウェアの画面上で電荷結合素子（CCD）の温度が固定されるまで待ちます。露光時間を40秒に設定します。次に、ビニングを中に、F値を1/8に設定します。麻酔をかけたマウスを温度制御ステージ付きのイメージングチャンバーに入れ、仰臥位にしてください。各画像キャプチャの2分前に、これまでと同様に麻酔を投与するためのノーズコーンを装着します。27ゲージの針を装着した1mLシリンジを用いて、ルミナル誘導体L 0 1 2を50 µL静脈内投与してください。後眼窩静脈叢投与を行います。最後に、記載の方法で画像を撮影し、解析します。ビデオの次のセクションでは、Living Imageソフトウェア バージョン 4.2を用いて、収集したデータを解析します。画像を開き、ツールパレットのROIツールをクリックします。次に、ROIツールメニューでROI形状を選択し、ドロップダウンリストから円をクリックします。画像に追加するROIの数を選択してください。ROIツールメニューで、関心領域の信号強度または光子束を定量化するために、胸部および/または腹部上のROI位置を調整します。[measure]ボタンをクリックしてROI測定テーブルを開くと、画像内で作成されたすべてのROIのデータが表示されます。統計解析ソフトウェアパッケージを用いて、野生型とN-A-D-P-Hオキシダーゼ欠損マウスの肺におけるROS生成を比較するため、個々のタイムポイントでBonferroniポストテストを伴う二元配置分散分析（two-way ANOVA）を行います。Xan投与後のP 47 Fox nullマウス。Xanは、本ビデオで説明した通り、ベースライン時、4時間後、および24時間後に投与した。マウスのイメージングをここに示す通りに実施した。野生型マウスでは、ベースラインと比較して投与4時間後および24時間後の胸部における光放出が有意に増加しましたが、P47.Fox snoマウスではこの増加は見られませんでした。このことは、XUS Sand投与後の肺におけるROS生成の主要な源がN-A-D-P-Hオキシダーゼであることを示唆しています。次に、CLP誘発敗血症モデルにおいてROS産生を評価しました。敗血症は、急性肺損傷や急性呼吸不全症候群を含む末端臓器障害を伴う、生命を脅かす症候群です。ROS介在性の損傷は、敗血症誘発性の多臓器不全を促進する重要な因子であると考えられています。このグラフに示されているように、野生型マウスでは、CLP後4時間で胸部に、CLP後24時間で腹部にROSが有意に増加しました。しかし、P 47 Fox欠損マウスにおけるROSレベルは、いずれの時点においてもベースラインレベルと同程度でした。これらの結果は、CLP誘発敗血症マウスモデルにおけるROS生成がN-A-D-P-Hオキシダーゼ依存的であることを示しています。最後に、四塩化炭素誘発性肝損傷モデルにおけるROS産生を検出するために、生物発光イメージングを用いました。先に述べた炎症および損傷モデルとは対照的に、P 47, Fox nullマウスでは、四塩化炭素投与から4時間後の腹部におけるROS産生は、ベースラインに対して約35%とわずかな増加にとどまりました。しかしながら、四塩化炭素によって誘発されるROS産生の程度は、P 47 Fox nullマウスよりも野生型マウスにおいて有意に高い値を示しました。これらのデータは、急性四塩化炭素誘発性肝損傷において、p47phoxを含むNADPHオキシダーゼ依存的なROS生成と、それに依存しないROS生成の両方が起こっていることを示唆しています。野生型マウスにおいてp47ノックアウトマウスと比較してROSレベルの上昇が示されたバイオリミネッセンスイメージングの結果は、炎症刺激に応答したROS生成の主要なソースがNADPHオキシダーゼであることを示しています。この手法は、生体内での炎症時に発生するRSの生成をリアルタイムでモニタリングするための、低侵襲なアプローチを提供します。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶNADPHオキシダーゼ由来活性酸素種の生体内発光イメージング法。マウスの3つの炎症モデルを用いて、侵襲性を最小限に抑えたリアルタイムモニタリングにより、炎症におけるROS動態を可視化し、治療戦略の開発に貢献します。

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