Name: 上皮細胞ライセートからのGSTタグ付き突然変異体のRhoタンパク質（GST-RhoAは（G17A））を使用してアクティブロー-GEFの親和性降水 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学ぶRhoA特異的GEF活性化の追跡法。GST-RhoA(G17A)融合タンパク質を用いた親和性降水アッセイにより、培養細胞におけるGEFの活性化をWestern blottingで検出・定量化する手法を解説。

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この作品は、ヘルスリサーチのためのカナダ研究所（CIHR）（MOP-97774）と自然科学とカナダの工学研究評議会（：480619 NSERC、助成金NR）によって賄われていた。 KSはKRESCENT新奨励賞（カナダ、カナダの腎臓学会と健康研究のカナダ研究所の腎臓財団の共同受賞）と、研究とイノベーションのオンタリオ州省か​​らの早期研究者賞を受賞しています。 FWは李嘉誠の奨学金によってサポートされています。

1。 E.の変容をpGEX-RhoAの（G17A）を構築した大腸菌 <ol><li> 100ミリリットルのdH 2 Oで2.5グラムのLBと1.5 gの寒天を溶解させたLB-寒天培地を準備します。オートクレーブと親指のルールとして、フラスコを快適に保持することができるときであると推定50から55°Cに冷却する。 </li><li>のdH 2 Oで50 mg / mlに溶解することによりアンピシリン（Amp）の在庫を準備するシリンジフィルターを、未使用のアリコートを凍結します。 1.1からLB-寒天培地にアンプの株式を100μl（最終濃度50μg/ mlの）を追加します。ミックスと10cmの細菌皿（15〜20ミリリットル/皿）に注ぐように渦。それが固化（15-30分）と2〜3週間は4で反転使用されていないプレート℃で保存することができます。 </li><li> E.を変換するには大腸菌は 、すぐに氷浴中でDH5αコンピテント細胞のアリコートを解凍します。 25から50 ng /μlにまで希釈しpGEXRhoA（G17A）DNA 1μlを追加します。氷上で30分間混合し、インキュベートするチューブをフリックします。 42℃の熱ショック℃で45秒間、C、2分間氷上に戻って置きます。 900＆ムーを追加します。、L SOC培地、振とうしながら37℃で1時間成長します。 </li><li>曲がった滅菌パスツールピペットを用いてLB-寒天-Ampのプレート上で形質転換した細菌の50〜100μlを広げる。 5分間、37℃のインキュベーター内でプレートの右側をインキュベートし、その後反転し、一晩成長します。 </li><li>単一のコロニーは、GST-タグタンパク質（ステップ2.1）を調製するためのプレートから取得されます。将来の使用のために、ラップや店舗プレートは約3週間、4℃で反転します。さらに、細菌株は、振とうしながら37°Cで一晩2ミリリットル滅菌LB-Ampのに成長して個々のコロニーで、より長期保管のために準備することができます。 -80 1:1の比率と凍結の滅菌80％グリセロール℃でアリコートを混ぜる</li></ol> 2。 GST-RhoAの（G17A）ビーズの調製<ol><li> 1 LのdH 2 0〜25 gのLBを追加し、オートクレーブでLBを準備します。ときにクール、株式から50 mlのLB（50μg/ mlの最終濃度）に50μlのアンプを追加します。よく隔離されたCOLを接種する形質転換した細菌のONYと攪拌しながら37℃で一晩成長します。ときに完全な密度（OD 600&gt; 1.0）450ミリリットルLB-Ampので希釈し、37℃でさらに30分間成長℃で</li><li> 10ミリリットルのdH 2 Oで0.238グラムを溶解することにより、イソプロピルBD-ガラクトピラノシド（IPTG）の100 mMのストック溶液を調製-20℃でアリコートでストア細菌は、500 mlの培養液にIPTGを500μlの100mM（最終濃度100μM）を添加することによりRhoタンパク質を生成するために誘導する。 22から24℃に温度を下げると〜16時間の時間成長します。 </li><li> 4℃で10分間、3600グラムで培養を回転させる必要に応じて、500 mlの培養液を遠心分離のための50 mlチューブに分けることができます。 -80℃で少なくとも1時間（好ましくは一晩）のペレット（s）を凍結℃、 </li><li> 200ミリリットルの溶解20mM HEPESを含む緩衝液（0.95グラム）/ pHが7.5を準備し、150mMのNaCl（1.75グラム）、5 mMのMgCl 2（0.203グラム）1パーセントTX-100（2ミリリットル）。 1M DTT（10ミリリットルのdH 2 O中の1.542グラムのストック溶液を調製）、100 mMのPMSF（0.174 g/10分ミリリットルエタノール）。溶解バッファー+を準備するには、1mMのDTT（ストックの10μL）および1mM PMSF（株式の100μl）を1つの完全なミニプロテアーゼインヒビタータブレットを10ミリリットルを補足するものです。 </li><li>氷の上で作業し、10 mlの溶解バッファーを追加する+ペレットに、ステップ2.3から。穏やかなボルテックスとピペッティングにより完全に再懸濁します。発泡は避けてください。 50％のパルスを4に設定で1分間、氷上で超音波洗浄します。 4℃で15分間15,000〜20,000 gで超音波処理したライセートをスピンし、滅菌キャップを15 mlのチューブに明らかに超音波処理し（上清）を取り外します。 </li><li>穏やかに15 mlのチューブに75％のスラリーと転送335μlを含むオリジナルのチューブとを混合することによってグルタチオンセファロースを準備します。ビーズをピペッティングするために広い口径の先端を使用しています。 10ミリリットルの冷PBSを追加し、4℃で5分間、500グラムのスピン℃に1mlの溶解緩衝液を追加する+ビーズとスピンに、前の洗浄の場合と同様に、上清を捨てる。上清およびadd溶解バッファーを捨てる+ 50％のスラリーを作るために。 </li><li> equil 250μlを加えステップ2.5から上清をビーズスラリーをibrated。 45分間、4℃で回転させます。 </li><li> 20mMのHEPES（2.38グラム）を含む500ミリリットルHBS / pH7.5お ​​よびのdH 2 O中150mMのNaCl（4.38グラム）を準備1MのMgCl 2（10ミリリットルのdH 2 Oで0.952グラム）と1M DTT（10ミリリットルのdH 2 Oで1.542グラム）のストック溶液を準備します。 HBS +を準備するには、わずか5 mMのMgCl 2（ストックから50μL）および1 mM DTT（ストックから100μl）を一緒に使用する前に、100ミリリットルを補足するものです。 </li><li> 4℃で5分間、500gで、ステップ2.7からビーズを回転させる10 mlの溶解バッファー+と2倍の上清と洗浄ビーズを破棄し、10ミリリットルHBS +で2倍。最終洗浄後、HBSでビーズを再懸濁することにより50％のスラリーを作る+ BDバキュロプロテアーゼ阻害剤（50倍BDバキュロ/ mlの20μl）を補充した。 </li><li> β-メルカプトエタノールを含む2×Laemmliサンプルバッファーで最終的なビーズの調製10μlを希釈する。ウシ血清アルブミン（BSA）の基準を作成します。 2 mg / mlのストックを（1のBSAの0.02グラム使用0ミリリットルのdH 2 O）。のdH 2 O及び10μlのLaemmliの（最後の10μg）を5μlの株式の5μl;と7.5μlのdH 2 Oで10μlのLaemmli緩衝と2.5μlの株式10μlのLaemmliの（最後の20μg）をして株式の10μlを混ぜて（最終5μg）を。すべてのサンプルを（5分）ゆでる。ビーズサンプルを回転させ、10％SDS-ポリアクリルアミドゲル上でBSAの標準と分子量マーカーで上清を実行します。 </li><li>染色Comassieブルー（10ミリリットルの酢酸で0.1グラム、40 mlのメタノールおよび50 mlのdH 2 O）と脱色液（500ミリリットルのdH 2 O、400mlのメタノールと100ミリリットルの酢酸）を準備します。室温で保管してください。 20〜30分間ゲルを染色し、染料を除去する（それが複数回再利用することができます）と二回脱色液ですすいでください。バンドがはっきりと見えるようになるまで数時間穏やかに振盪しながら脱色し続けています。 </li><li>リファレンス（ 図2）としてBSA標準を使用してビーズに結合されたGST-RhoAの（G17A）の濃度を推定する。 Aliquoトン1.5 mlマイクロ遠心チューブに10月15日〜μgのタンパク質を含むビーズの等量。お店のビーズは4℃で日以内に使用します。 -80℃で凍結°HBSのC数日以内に使用するために3:1の比率で+ /グリセロール。 </li></ol> 3。ヌクレオチドフリーRhoAの（G17A）ビーズとGEFプルダウンアッセイ<ol><li>合流点から10cm皿で細胞を成長させる。血清は、少なくとも3時間を奪うと、必要に応じて扱う。 </li><li>溶解バッファーを準備します。+ステップ2.4​​のように。十分に700μL/ディッシュに加え、ピペッティングの誤差を考慮して、いくつかの余分な量の溶解バッファーを準備します。使用直前にプロテアーゼ阻害剤を追加します。 </li><li>氷の上で作業し、皿から培地を除去し、氷冷HBSで洗浄する。すべてのHBSを削除し、700μlの溶解バッファーを追加する+各ディッシュに。すべての分野をカバーするためにスワールプレートは、こすり、番号を1.5 mlのチューブに溶解液を収集します。 4℃で1分、15,000 gで遠心上清をアッセイに使用されます。 </li><li>あなたの携帯番号は、すべて同等である場合料理は、あなたがタンパク質アッセイを行っ省略、および3.5のステップに移動することができますテストされている。そうでなければBio-Rad社のクイックタンパク質アッセイを用いて各上清のタンパク質濃度を測定し、体積と濃度の上清を均等化。総蛋白量（LLC-PK1細胞に対する一般的に1から1.5 mgのタンパク質）を用い、細胞の種類に依存しています。 </li><li>各上清30μlを削除し、Laemmliサンプルバッファーを減らす30μlの2倍と混合し、沸騰し、ステップ3.7のために脇に置きます。ステップ2.12からGST-RhoAの（G17A）ビーズのアリコートを、残りの上清を追加します。 4℃で45分間回転させる</li><li> 4℃で10秒間6800グラムで、ビーズを回転させる上清を捨て、洗浄の間に同じ方法で紡績、溶解緩衝液で3倍のビーズを洗浄する。完全に30 Gの針を備えた1ccのシリンジを用いて、最終的な洗浄を削除し、Laemmliサンプルバッファーを減らす20μlの2倍を追加します。 5分間沸騰させる。ペレットビーズにスピンして、すぐに上清を実行する（推奨）、またはそれを格納するトン-80°C、後で分析するため。 </li><li>あなたが勉強しているGEFのサイズに適した割合SDS-ポリアクリルアミドゲル上で20μlの全細胞溶解液と沈殿したタンパク質サンプルのすべてを実行します。ウエスタン特異的抗体を用いたブロッティングにより選択したGEFを検出します。 </li></ol> 4。代表的な結果プロトコルのパート1と2はGSH-セファロースビーズとSDS-PAGEによるそのテスト（ 図1上のプロトコルの概要を参照）に結合されたGST-RhoAの（G17A）の調製を説明しています。典型的なクマシー染色したゲルは、 図2に示されています。溶出したタンパク質を含むサンプルは、約50 kDaの（ 図2、レーン6）で単一のバンドを含んでいる必要があります。タンパク質の濃度は、BSAのリファレンスサンプルを用いて推定することができます。 図2の例では、RhoAの（G17A）の濃度は15μg/10μLであると推定される。したがって、10μL/チューブのアリコートを作製した。典型的な収率<html>私たちの手に10ミリリットル細菌の溶菌15から20μgのタンパク質である。プロトコルの第3部では、親和性の沈殿アッセイ（ 図1の概要を参照）について説明します。交換因子GEF-H1の活性化を検出することに成功しGEFアッセイは、 図3に示されています。 RhoAの（G17A）タンパク質は、GEF-H1は、基底活性を有することを示唆し、コントロール（未処理）細胞溶解物からいくつかのGEF-H1を捕獲した。量は、TNF-αは、GEF-H1 5,7を活性化するという概念と一致して、しかし、炎症性サイトカインの腫瘍壊死因子-α（TNF-α）で処理した細胞の増加を沈殿させた。重要なのは、全細胞溶解物は、治療は、GEF-H1のレベルを変化させなかったことを示唆し、制御と処理サンプル中のGEF-H1同様の量を示し、アッセイで使用する入力が等しくなります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> 図1：プロトコルの概要。 ove_content &quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> 図2ビーズの調製プロトコルの代表的な結果です。成功したGST-RhoAの（G17A）ビーズの調製とクマシー染色したゲルが表示されます。ビーズサンプルおよびBSAタンパク質標準は、10％アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEにより分離した。ビーズをテストするには、GST-RhoAの（G17A）を含む最終的なビーズスラリー10μlの5分間Laemmliサンプルバッファーと煮を減らすことで1:1に希釈されています。ビーズは簡単にスピンし、上清をゲル上にロードされていました。次のサンプルがロードされた：レーン1：分子量マーカー（MW）（FroggaBio BLUeyeは、タンパク質ラダーをジウム）、レーン2-4：5、10および20μg（BSA）ウシ血清アルブミン、レーン5は空です。レーン6：10新たに調製したRhoAの（G17A）ビーズμlの。分離が完了した後、ゲルをクマシーブルーを用いて染色し、続いてタンパク質を明らかにするために脱色されています。 GST-RhoAの（G17A）タンパク質の分子量は約50です。<html> 48 kDaのマーカーのレベルのまわりでkDaおよび実行されます。この特定のサンプルではGST-Rhoタンパク質の濃度はμg/10約15μLスラリーと推定されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> GEF-H1のTNF-α誘導活性を示す図3代表的なGEF活性化アッセイ。コンフルエントLLC-PK1細胞は、5分間10 ng / mlのTNF-αで処理した。治療後の細胞を溶解し、アクティブなGEFををGST-RhoAの（G17A）バインドされたビーズを用いて捕獲された。沈殿したタンパク質（上ブロット）および全細胞ライセート試料（底ブロット）でGEF-H1の存在は、西洋抗GEF-H1抗体（セルシグナリング）でブロッティングを用いて検出した。成功した結果を示す同等の入力、相対非処理細胞と比べTNF-α処理で沈殿したGEF-H1の増加量に注意してください。 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; 図4： &quot;悪い結果&quot;。ここに示されているGEFのプルダウンアッセイはビーズによってキャプチャされたいくつかのGEF-H1の結果が、制御およびTNF-αで処理した細胞から析出量​​は同じです。したがって、TNF-α、このケースでは、GEF-H1のノウハウ活性剤は、活性化を誘導しなかった。この特定の実験、その後のトラブルシューティングに使用されるTNF-αが十分に新鮮な、おそらく分解されなかったことを示唆している。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで紹介する方法は、細胞内でGEFのアクティブなプールに従うことができますGEFをのためにのみ利用可能な非放射性活性化アッセイである。アッセイは、以下の低分子量GTPaseの活性化などのRacおよびCdc42に対するGEFを使用される降水量アッセイに似ています。これらのアッセイは異なるGSTタグ融合タンパク質を使用して、ここで説明したものから若干の違いがある、しかし、基本的な手順は同じです。したがって、このプロトコルは、簡単に他の低分子量GTPaseとGEF活性化アッセイのために適合させることができます。 提示GEFアッセイは最近、核分画9,10用のアプリケーションのために変更されました。さらに変更を加えるだけで、他の細胞内コンパートメントでのGEF活性化のテストも可能かもしれません。 我々は、上皮細胞株の5,6,7のGEFの活性化を研究するための提示方法を使用します。いくつかの最適化では、このアッセイは、任意のセルラインからGEFを検出するのに十分でなければなりません。時adapti特定の細胞型にNG（ウェスタンブロッティングに適した抗体が重要である）テストされるGEFに最適な細胞数を、溶解バッファー量、検出方法を見つける。アッセイの初期セットアップのためには、関心のあるGEFを活性化することが知られて刺激を使用することをお勧めします。未知の刺激を使用する場合は、常にあなたのアッセイが動作していることを確認するために陽性対照を使用しています。このアッセイは、ウェスタンブロッティングによって知られているGEFの活性化を検出するために使用することができます。しかし、それは未知のGEFをを識別するためにも十分です。このため、制御と刺激サンプルからキャプチャされたGEFを、クマシー染色ゲル上で分析する必要があります。唯一の刺激のサンプルに表示されるバンドは、活性化されたGEFをが含まれている可能性があり、質量分析法（例えば、5）で識別するために送信することができます。 最後に、注意事項に注意してください。アッセイは、アクティブなGEFをレンダリングを翻訳後修飾は、細胞溶解後に保存されているという前提に基づいています。確かに、これは明らかにCAですGEFの数のSEと、その施設から、このアッセイは、GEF-H1、p115RhoGEFとXPLN（例えば5,11,12,13）を含むさまざまなGEFを、の活性化を検出するために様々なグループによって使用されています。アクティブ状態の保存は、しかし、すべてのGEFの場合には起こらないかもしれません、したがって、それは、このアッセイは、すべてのGEFをのために動作しないことが考えられる。また、多くのGEFを、複数の低分子量GTPaseに向かって活性を発揮することに留意する必要があります。したがって、特定のGEFが検討されている場合、それは他の低分子量GTPaseと同様に、あるRhoA、Rac1とCdc42の機能を調べる研究のためのGEF沈殿アッセイと、このアッセイを補完することをお勧めします。 プロトコルの重要なステップ： 形質転換細菌のコロニーは、アンプ、優れた伸長と収量によって適切な選択を確保するため、新鮮な、適切に準備、プレートから選択する必要があります。他のソースから得られたコンピテントセルの形質転換条件は変わる場合がありますと相談する必要があります。 </p&gt; タンパク質調製プロトコル（手順2.3から）とアッセイ（ステップ3.2から）のすべてのステップは、°C冷却ソリューションや遠心分離機で4で実行する必要があります。 細菌の溶解（ステップ2.5）均質な懸濁液を得るために徹底的かつ完全でなければなりません。細菌、渦を溶解し、4°Cでそれを維持しながら、交互にライセートをピペットと超音波処理はタンパク質を変性防止するために氷の上で行われていることを確認します。超音波の異なるモデルを使用している場合、条件を調整する必要があります。ビーズと超音波処理のインキュベーションは、常に十分な結合を確保するために回転子に4°Cで行われるべきであり、ケアはタイミングの一貫性を保つために注意するべきです。 GST-Rhoの変異体は、細菌で発現されたときやや不安定なので、すぐにまたは数日以内に準備されたビーズを使用することをお勧めします。 降水量の測定法（その3）時間と温度に敏感であり、のアクティブ·GEFをを容易に細胞ライセートから失われる可能性がありますので、手順は、可能な限り迅速に実行する必要があります。 次のセクションでは、いくつかのトラブルシューティングのヒントが含まれています。 最後のビーズ準備中変異体Rhoタンパク質のない、または非常に低い金額ません：これは非効率的な誘導は、細菌の溶解が不十分、または準備プロセスまたは貯蔵中のタンパク質の損失によって引き起こされることがあります。これらの可能性のいくつかのトラブルシューティングに役立つように、バクテリアのサンプルは、誘導前と後に分析することができます。タンパク質の貧しい人々の誘導がある場合は、新たに画線播種したプレートから、または再形質転換コンピテント細胞からコロニーを使用してプロセスを繰り返します。別のIPTG濃度と誘導時間もテストする必要があります。溶解が不十分な場合（すなわち、タンパク質ではなく、上清中のペレットのままで）溶解緩衝液中で塩と洗剤の濃度を変化させることを試みることができます。代替の超音波処理時間と設定が考慮されるべきであり、超音波処理前後のサンプルは溶解の効率を決定するために顕微鏡で確認することができます。 いいえGST-タンパク質がビーズ上に存在するにもかかわらず、GEFを沈殿させない：これは、降水量アッセイ中に技術的な問題に起因する、または適用された刺激を用いて検討GEFの活性化の本当の有無によって可能性があります。常にあなたのアッセイが動作していることを確認するために、ポジティブコントロールとして知られている刺激を使用しています。数日以内に準備されたビーズを使用しています。沈殿アッセイはすべての条件で検討GEFの検出不可能な量をキャプチャした場合は、あなたのGEFが存在し、分析（ステップ3.3）に使用される遠心分離後の上清中にも検出可能であることを確認します。すべてのバッファおよびプロテアーゼ阻害剤は新鮮であり、できるだけ早く氷の上のすべての手順を実行していることを確認してください。入力蛋白質（2プレート/サンプルからライセートを使用してなど）の量を増やします。沈殿アッセイは基底析出が表示されている場合あなたのGEFのtationが、有意差は、制御と刺激のサンプル（ 図4）の間に見られない、適用された刺激は、他の既知の影響を（他のシグナル伝達経路の活性化を検出することにより、例えば）を使用して、働いていることを確認することによってトラブルシューティングを開始します。処理条件および/または濃度を変えることを検討してください。あなたの刺激はおそらく時間と濃度を予測するRhoまたは他のシグナル伝達を活性化する方法、文献報告からのデータに依存しています。 GEFの活性化はよく検出可能なRhoの活性化に先立っての時点で最高の検出可能かもしれないとして、処理時間を最適化する場合、両方の短期および長期の時間ポイントを使用します。最後に、同じ刺激​​が継代数による細胞応答の変化による活性化の可変度、細胞密度などの原因となり

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>をpGEX-RhoAの（G17A） </td><td> Addgene </td><td>すぐに利用できるようになります</td><td>博士キースBurridge（ノースカロライナ大学）（参照3）の研究室で生成された</td></tr><tr><td> DH5α </td><td>インビトロジェン</td><td> 18258-012 </td><td>店舗-80°C </td></tr><tr><td> SOC培地</td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td>無菌に保つ</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> -20℃で保存する株式</td></tr><tr><td>寒天</td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG（ISOプロピルBD-thiogalacto-ピラノシド） </td><td> Calbio-CHEM </td><td> 420322 </td><td> -20℃で保存するストック溶液</td></tr><tr><td>グルタチオンセファロースビーズ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10倍PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2を </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td> TX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤50倍</td><td> BDバキュロ·ゴールド</td><td> 51-21426Z </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr&gt; <td> 10倍の完全なミニ、EDTA-フリー</td><td>ロシュ社</td><td> 11 836 170 001 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td>レムリサンプルバッファー×2 </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td>クマシーブリリアントブルー</td><td>バイオ·ラッド</td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>カレドン</td><td> 1000から1 </td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>カレドン</td><td> 6701から7 </td><td></td></tr><tr><td>バイオ·ラッドプロテインアッセイ</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeyeラダー</td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1使用する試薬。 <table border="1"><tbody><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td&gt; <td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> RC-5B遠心分離</td><td>ソーバル</td><td> SS-34ローター</td><td> 4℃で使用°C </td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>ソーバル、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> ST-16R </td><td> 4℃で使用°C </td></tr><tr><td>マイクロ遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5417R </td><td> 4℃で使用°C </td></tr><tr><td>細菌のシェーカー</td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> 37℃または22℃使用°C </td></tr><tr><td>超音波</td><td>ブランソン</td><td>超音波処理-450 </td><td> RTで使用</td></tr><tr><td>回転子</td><td> GLAS-COL </td><td> 099A CR4012 </td><td> 4℃で使用°C </td></tr></tbody></table> 表2。使用される特定の装置。

上皮細胞ライセートからのgstタグ付き突然変異体のrhoタンパク質（gst-rhoaは（g17a））を使用してアクティブロー-gefの親和性降水

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

低分子量GTPaseのRhoファミリーのタンパク質は細胞骨格の中心的調節因子であり、細胞遊走、遺伝子発現、細胞周期進行と細胞接着1を含む細胞プロセスの多種多様を制御します。のRhoタンパク質はGDP結合状態のGTP結合型と非アクティブで活躍している分子スイッチである。それらの活性化は、グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）タンパク質のファミリーによって媒介される。 ρ-GEFが特異性2をオーバーラップして、大家族を構成します。進歩の多くは特定のシグナルによって活性化さGEFをを識別するのに行われているが、これらのタンパク質の経路固有の規制に関する残りの多くの質問がまだあります。ロー-GEFの数は70を超えており、各セルは、複数のGEFタンパク質を発現する。さらに、これらのタンパク質の多くは、制御ネットワークの複雑さに一層貢献し、ローが、家族の他のメンバーだけでなく、アクティブにします。重要なのは、探索どのようにGEFをが規制されていると、様々な刺激によって活性化され、細胞内の個々のGEFのアクティブなプールに従う方法を必要とします。ここでは、親和性の沈殿アッセイを使用して、使用可能なアクティブロー固有のGEFをを評価し、定量化するために使用される方法のためのステップバイステップのプロトコルを提供しています。このアッセイは、Burridge研究室3,4で数年前に開発され、我々は、腎尿細管細胞ライン5,6,7にそれを使用しています。アッセイは、GEFをアクティブに高い親和性を持つ、 &quot;ヌクレオチドフリー&quot;変異型RhoAのを利用しています。変異（G17A）はGDPまたはGTPを結合することができない蛋白質をレンダリングし、この状態は、GEFにバインドされている中間状態を模倣しています。この変異体タンパク質のGSTタグ付きバージョンは、Eから発現させ、精製された大腸菌 、グルタチオンセファロースビーズに結合し、未処理と刺激した細胞の溶解物から沈殿アクティブGEFをするために使用。ほとんどのGEFを、阻害バインディングから翻訳後修飾やリリース、彼らのアクティブ状態を介して活性化される細胞ライセートに保存され、それらはこのアッセイ8で検出することができます。捕捉されたタンパク質は、ウェスタンブロッティング、または特定の刺激により活性化未知のGEFをを識別するために質量分析を使用して、特定の抗体で検出することで知られているGEFををプローブすることができます。

ここで紹介する方法が有効にGEFをするための高い親和性を有する変異体RhoAのGST融合タンパク質を利用することにより、培養細胞におけるRhoAの特定のGDP / GTP交換因子（GEF）の活性化に従うアッセイを説明しています。 GEFを、ウエスタンブロット法とデンシトメトリーにより定量によって検出された細胞溶解液から沈殿させる。

上皮細胞ライセートからのGSTタグ付き突然変異体のRhoタンパク質（GST-RhoAは（G17A））を使用してアクティブロー-GEFの親和性降水

Rhoファミリーの低分子量GTPaseタンパク質は、細胞骨格の中心的な調節因子であり、細胞の...を含む多種多様な細胞プロセスを制御している。

この手順の全体的な目的は、活性化されたGsに対して高い親和性を持つ変異型RhoA GST融合タンパク質を利用し、培養細胞における特定のG-D-P-G-T-P交換因子（gaf）によるRhoの活性化を追跡することです。これは、まず細菌内でGSTタグ付き変異型RhoAタンパク質を産生し、次にビーズ結合GST RhoAを精製することで達成されます。次に、SDS-PAGEを用いてGST RO Aタンパク質の純度と濃度を評価します。最後に、細胞溶解液を調製し、GST RO Aタンパク質を用いてGEF沈殿アッセイを行います。最終的に、特異的な抗GF抗体を用いた沈殿タンパク質のウェスタンブロット解析およびデンシトメトリーによる定量により、処理した細胞において活性化GSの沈殿が増加していることを示す結果を得ることができます。この手法は、多くのraw GTPS分野における刺激的な疑問、例えば多くのrow G-D-P-G-T-P交換因子がどのようにシグナル特異的に調節され、その活性がどのように協調しているか、といった問いに答えるのに役立ちます。一般的に、この手法を初めて行う人は、GST RO G 17 Aタンパク質が比較的不安定であり、調製中に分解することがあるため、最初は苦労するでしょう。また、GF沈殿アッセイを迅速かつ一貫して行うことが重要であることも忘れてはいけません。本手順の実演は、私の研究室の修士課程学生であるPfizer Vahidが行い、e coliを形質転換させます。氷浴中でDH5αコンピテントセル 50 µLを速やかに融解させ、25〜50 ng/µLのpX-row AG17A DNAを1 µL添加します。チューブを軽く弾いて混ぜ、氷上で30分間インキュベートします。42 °Cで45秒間ヒートショックを与え、再び氷上に2分間置きます。SOC培地 900 µLを加え、37 °Cで1時間振盪培養します。滅菌済みの曲げたパステールピペットを用いて、形質転換した細菌 50 ～ 100 µLを、あらかじめ準備したLB寒天培地およびペルシンプレートに塗布します。プレートを正立させた状態で37 °Cのインキュベーターに5分間静置した後、倒置して一晩培養します。形質転換した細菌の単離コロニーを1つ選び、アンピシリンを含むLB培地50 millilitersに接種します。37 degrees SIUsで振盪しながら一晩培養します。培養液が十分な密度に達したら、アンピシリン含有LB培地450 millilitersで希釈し、さらに30分間培養します。37 degrees Celsiusにおいて、500 millilitersの培養液に100 millimolar IPTGを500 microliters添加し、row proteinの産生を誘導します。温度を22〜24°Cに下げ、約16時間培養します。培養液を4°Cで3,600 ×gにて10分間遠心分離します。ペレットを-80°Cで少なくとも1時間、あるいはできれば一晩冷凍保存します。記載のプロトコルに従って溶解バッファーを200 milliliters調製した後、氷上で1 millimolar DTT、1 millimolar PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤タブレット1錠を10 millilitersに添加し、溶解バッファープラスを作成します。Thorペレットに溶解バッファープラスを10 milliliters加え、ピペッティングとボルテックスで十分に懸濁させます。この懸濁液を氷上で、設定4、50%パルスで1分間ソニケーションします。超音波処理した溶解物を 4°C で 15,000 ～ 20,000 ×g、15 分間遠心分離し、上清を滅菌済みのキャップ付き 15 mL チューブに移します。グルタチオン球状ビーズを準備するため、75%スラリーを穏やかに混合し、ワイドボアチップを用いて 335 µL を 15 mL チューブに移します。冷えた PBS を 10 mL 加え、4°C で 500 ×g、5 分間遠心分離します。上清を廃棄します。ビーズに1 mLのlysis buffer plusを加え、再度遠心分離を行います。再び上清を廃棄し、lysis bufferを加えます。さらに、50%のスラリーを作成するには、平衡化したビーズスラリー 50 µL を2量、調製した上清に加えます。4 °C で45分間回転混和します。100 mL の HBS バッファーに 5 mM の塩化マグネシウムと 1 mM の DTT を添加して HBS plus を調製し、上清とビーズを 4 °C で 500 ×g、5分間遠心分離します。上清を捨て、ビーズを10 millilitersのlysis buffer plusで2回、次いで10 millilitersのHBS plusで2回洗浄します。最後の洗浄後、プロテアーゼ阻害剤を添加したHBS plusにビーズを再懸濁し、50%のスラリーを作成します。最終的なビーズ調製液10 microlitersを、beamr cap two ethanolを含む2倍濃度のlam ly sample bufferで希釈します。次に、2 mg/mLのBSAストック溶液をそれぞれ10 µL、5 µL、2.5 µL量り取り、それぞれに10 µLのLaemmliバッファーを混ぜ合わせて、3つのBSA標準サンプルを作成します。サンプルを5分間煮沸し、軽くスピンダウンさせた後、10% SDS-ポリアクリルアミドゲルで分子量マーカーと共に電気泳動を行い、染色後、BSA標準試料をリファレンスとしてGST row A G 17 Aのゲル上の推定を行います。約10～15 µgのタンパク質を含む同量のビーズを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。GFプルダウンアッセイの準備として、使用する細胞を10 cmディッシュでコンフルエントまで培養し、アッセイの少なくとも3時間前に血清飢餓状態にします。アッセイ開始直前に、プロテアーゼ阻害剤を添加したライシスバッファーを氷上で調製します。ディッシュから培地を除去し、氷冷したHBSで洗浄します。すべてのHBSを除去し、各ディッシュに700 µLのlysis Buffer plusを加えます。プレートを傾けて、すべての領域を覆うように広げます。次に、スクレーパーを用いてライセートを回収し、番号を付けた1.5 mLチューブに移します。4 °Cで15,000 ×g、1分間遠心分離します。各プレートの細胞数が同等であった場合は、アッセイ用に上清を保存します。各上清から30 µLを分取し、2倍濃縮還元サンプリングバッファー30 µLと混合します。その後、沸騰させ、氷上に置いて静置します。残りの上清をGST row a G 17 Aビーズのアリコートに加え、4°Cで45分間回転混和します。ビーズを4°Cで6,800 ×g、10秒間遠心分離します。上清を捨て、ビーズをライシスバッファーで3回洗浄します。30ゲージの針を装着した1 CCシリンジを用いて、最後の洗浄液を完全に除いた後、2倍濃縮還元ライシスサンプルバッファーを20 µL加えます。サンプルを5分間沸騰させ、遠心分離してビーズをペレット化し、全細胞ライセートおよび沈殿タンパク質サンプルを、解析対象のGFのサイズに適した濃度のSDS-PAGEゲルで電気泳動します。最後に、ウェスタンブロッティングを行い、GFアッセイの成功を確認するための関連するGFを検出します。ここでは、交換因子GFH1の活性化の検出を示しています。行AのG 17 Aタンパク質がコントロール細胞ライセートから一部のGFH1を捕捉しており、GFH1が基底活性を持つことが示唆されます。しかしながら、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（TNF alpha）で処理した細胞では、沈殿量が増加しており、これはTNF alphaがG FH oneを活性化するという概念と一致しています。重要な点として、全細胞溶解液におけるgfh oneの量はコントロール群と処理群で同等であり、この処理がG FH oneのレベルを変化させなかったこと、およびアッセイに使用したインプット量が等しかったことが示唆されます。本手順を適応させる際は、GSE RO G 17 Aタンパク質と細胞溶解液を氷上で保持することが重要です。GFアッセイを迅速かつ一貫して行い、無効判定およびトラブルシューティングを可能にする適切なポジティブコントロールを使用してください。

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

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