上皮細胞ライセートからのGSTタグ付き突然変異体のRhoタンパク質（GST-RhoAは（G17A））を使用してアクティブロー-GEFの親和性降水

この手順の全体的な目的は、活性化されたGsに対して高い親和性を持つ変異型RhoA GST融合タンパク質を利用し、培養細胞における特定のG-D-P-G-T-P交換因子（gaf）によるRhoの活性化を追跡することです。これは、まず細菌内でGSTタグ付き変異型RhoAタンパク質を産生し、次にビーズ結合GST RhoAを精製することで達成されます。

次に、SDS-PAGEを用いてGST RO Aタンパク質の純度と濃度を評価します。最後に、細胞溶解液を調製し、GST RO Aタンパク質を用いてGEF沈殿アッセイを行います。最終的に、特異的な抗GF抗体を用いた沈殿タンパク質のウェスタンブロット解析およびデンシトメトリーによる定量により、処理した細胞において活性化GSの沈殿が増加していることを示す結果を得ることができます。

この手法は、多くのraw GTPS分野における刺激的な疑問、例えば多くのrow G-D-P-G-T-P交換因子がどのようにシグナル特異的に調節され、その活性がどのように協調しているか、といった問いに答えるのに役立ちます。一般的に、この手法を初めて行う人は、GST RO G 17 Aタンパク質が比較的不安定であり、調製中に分解することがあるため、最初は苦労するでしょう。また、GF沈殿アッセイを迅速かつ一貫して行うことが重要であることも忘れてはいけません。本手順の実演は、私の研究室の修士課程学生であるPfizer Vahidが行い、e coliを形質転換させます。

氷浴中でDH5αコンピテントセル 50 µLを速やかに融解させ、25〜50 ng/µLのpX-row AG17A DNAを1 µL添加します。チューブを軽く弾いて混ぜ、氷上で30分間インキュベートします。42 °Cで45秒間ヒートショックを与え、再び氷上に2分間置きます。

SOC培地 900 µLを加え、37 °Cで1時間振盪培養します。滅菌済みの曲げたパステールピペットを用いて、形質転換した細菌 50 ～ 100 µLを、あらかじめ準備したLB寒天培地およびペルシンプレートに塗布します。プレートを正立させた状態で37 °Cのインキュベーターに5分間静置した後、倒置して一晩培養します。

形質転換した細菌の単離コロニーを1つ選び、アンピシリンを含むLB培地50 millilitersに接種します。37 degrees SIUsで振盪しながら一晩培養します。培養液が十分な密度に達したら、アンピシリン含有LB培地450 millilitersで希釈し、さらに30分間培養します。37 degrees Celsiusにおいて、500 millilitersの培養液に100 millimolar IPTGを500 microliters添加し、row proteinの産生を誘導します。

温度を22〜24°Cに下げ、約16時間培養します。培養液を4°Cで3,600 ×gにて10分間遠心分離します。ペレットを-80°Cで少なくとも1時間、あるいはできれば一晩冷凍保存します。

記載のプロトコルに従って溶解バッファーを200 milliliters調製した後、氷上で1 millimolar DTT、1 millimolar PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤タブレット1錠を10 millilitersに添加し、溶解バッファープラスを作成します。Thorペレットに溶解バッファープラスを10 milliliters加え、ピペッティングとボルテックスで十分に懸濁させます。この懸濁液を氷上で、設定4、50%パルスで1分間ソニケーションします。

超音波処理した溶解物を 4°C で 15,000 ～ 20,000 ×g、15 分間遠心分離し、上清を滅菌済みのキャップ付き 15 mL チューブに移します。グルタチオン球状ビーズを準備するため、75%スラリーを穏やかに混合し、ワイドボアチップを用いて 335 µL を 15 mL チューブに移します。冷えた PBS を 10 mL 加え、4°C で 500 ×g、5 分間遠心分離します。

上清を廃棄します。ビーズに1 mLのlysis buffer plusを加え、再度遠心分離を行います。再び上清を廃棄し、lysis bufferを加えます。

さらに、50%のスラリーを作成するには、平衡化したビーズスラリー 50 µL を2量、調製した上清に加えます。4 °C で45分間回転混和します。100 mL の HBS バッファーに 5 mM の塩化マグネシウムと 1 mM の DTT を添加して HBS plus を調製し、上清とビーズを 4 °C で 500 ×g、5分間遠心分離します。

上清を捨て、ビーズを10 millilitersのlysis buffer plusで2回、次いで10 millilitersのHBS plusで2回洗浄します。最後の洗浄後、プロテアーゼ阻害剤を添加したHBS plusにビーズを再懸濁し、50%のスラリーを作成します。最終的なビーズ調製液10 microlitersを、beamr cap two ethanolを含む2倍濃度のlam ly sample bufferで希釈します。

次に、2 mg/mLのBSAストック溶液をそれぞれ10 µL、5 µL、2.5 µL量り取り、それぞれに10 µLのLaemmliバッファーを混ぜ合わせて、3つのBSA標準サンプルを作成します。

サンプルを5分間煮沸し、軽くスピンダウンさせた後、10% SDS-ポリアクリルアミドゲルで分子量マーカーと共に電気泳動を行い、染色後、BSA標準試料をリファレンスとしてGST row A G 17 Aのゲル上の推定を行います。約10～15 µgのタンパク質を含む同量のビーズを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。GFプルダウンアッセイの準備として、使用する細胞を10 cmディッシュでコンフルエントまで培養し、アッセイの少なくとも3時間前に血清飢餓状態にします。

アッセイ開始直前に、プロテアーゼ阻害剤を添加したライシスバッファーを氷上で調製します。ディッシュから培地を除去し、氷冷したHBSで洗浄します。

すべてのHBSを除去し、各ディッシュに700 µLのlysis Buffer plusを加えます。プレートを傾けて、すべての領域を覆うように広げます。

次に、スクレーパーを用いてライセートを回収し、番号を付けた1.5 mLチューブに移します。4 °Cで15,000 ×g、1分間遠心分離します。各プレートの細胞数が同等であった場合は、アッセイ用に上清を保存します。各上清から30 µLを分取し、2倍濃縮還元サンプリングバッファー30 µLと混合します。

その後、沸騰させ、氷上に置いて静置します。残りの上清をGST row a G 17 Aビーズのアリコートに加え、4°Cで45分間回転混和します。ビーズを4°Cで6,800 ×g、10秒間遠心分離します。

上清を捨て、ビーズをライシスバッファーで3回洗浄します。30ゲージの針を装着した1 CCシリンジを用いて、最後の洗浄液を完全に除いた後、2倍濃縮還元ライシスサンプルバッファーを20 µL加えます。サンプルを5分間沸騰させ、遠心分離してビーズをペレット化し、全細胞ライセートおよび沈殿タンパク質サンプルを、解析対象のGFのサイズに適した濃度のSDS-PAGEゲルで電気泳動します。

最後に、ウェスタンブロッティングを行い、GFアッセイの成功を確認するための関連するGFを検出します。ここでは、交換因子GFH1の活性化の検出を示しています。行AのG 17 Aタンパク質がコントロール細胞ライセートから一部のGFH1を捕捉しており、GFH1が基底活性を持つことが示唆されます。

しかしながら、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（TNF alpha）で処理した細胞では、沈殿量が増加しており、これはTNF alphaがG FH oneを活性化するという概念と一致しています。重要な点として、全細胞溶解液におけるgfh oneの量はコントロール群と処理群で同等であり、この処理がG FH oneのレベルを変化させなかったこと、およびアッセイに使用したインプット量が等しかったことが示唆されます。本手順を適応させる際は、GSE RO G 17 Aタンパク質と細胞溶解液を氷上で保持することが重要です。

GFアッセイを迅速かつ一貫して行い、無効判定およびトラブルシューティングを可能にする適切なポジティブコントロールを使用してください。