臨床試験および筋萎縮性側索硬化症（ALS）のマウスモデルにおける脊髄の除去

こんにちは、ラー・ターナーです。ドイツのインガム大学神経科でポストドクターをしています。こんにちは、リン・グンダです。

私は医学生で、この研究室で卒業論文に取り組んでいます。本日は、筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルであるSOD1 G93Aの臨床試験についてご紹介します。さらに、いわゆるローターテストによる運動機能試験と、免疫学的解析を行うためのもう一つの運動機能試験である吊り下げワイヤーグリップ試験について実演します。

a sマウスの機能試験後、必要な手順として脊髄、STIC神経、および腓腹筋の摘出を行います。ここではこれらの外科的手順を詳細に示し、最後に代表的な免疫組織学的所見を提示します。それでは、まず臨床試験から始めましょう。

これは、当社の臨床分類システムにおいて、筋震顫や麻痺などの臨床症状を示さない、自由に動き回る野生型MOEです。これはスコア4に該当します。こちらは、トランスジェニックALS MOEです。

疾患の早期段階において、右後肢に激しい震えが見られ、これはSCORE 3Eに分類されます。重度の歩行異常がある個体は、スコア2に分類されます。少なくとも片方の後肢を引きずる場合は、臨床スコア1に分類されます。吊り下げワイヤー試験では、粗い筋力強度が評価されます。各マウスを特注のワイヤーに配置し、藁で覆われたボタンの上で慎重に逆さまにします。

少なくとも180秒間のトレーニングを3回連続で行った後、落下までの潜伏期間を測定しました。各マウスは倒立させた蓋に最大180秒間しがみつく試行を最大3回まで行い、その最長時間を記録します。右側の野生型マウスと比較して、左側のプラーク導入トランスジェニックマウスは非常に虚弱であり、最大時間に達する前に蓋から落下します。

ローターロッド装置は、運動協調性、バランス、および運動学習能力を測定するために使用されます。良好なパフォーマンスには、高度な感覚運動協調性が必要です。この装置は、コンピュータ制御のモーター駆動回転スピンドルと、5匹のマウス用の5つのレーンで構成されています。

マウスの落下は、底面のプラスチックプレートへの圧力によって自動的に検出されます。1分間に15回転の一定速度で、180秒以上の走行を3回連続でトレーニングした後、動物が回転するロータ上に留まれる時間を測定します。各動物に対して3回の試行を行い、落下せずに留まった最長時間を記録します。

左側の健康な野生型マウスは、ロタロッド上で難なく走行しています。対照的に、右側のトランスジェニックa s moマウスは、ロタロッド上に留まることさえ困難であり、背面から観察するとしばらくして滑り落ちます。この左側のretreマウスの深刻な走行困難が確認できます。

健康な野生型マウスと比較して、ロータロッドの速度に追従できず、HIN肢で上方に押し出すことができません。脊髄の免疫化学的解析を行うため、動物を安楽死させる必要があります。動物実験の適切な実施に関する地域のガイドラインを常に厳格に遵守することが非常に重要です。

ここでは、脊柱およびその周囲組織に関する非常に簡略化された概要を用いて、主要な解剖学的構造を示します。動物を腹側にして置き、背側から筋肉の準備を開始します。筋肉組織を除去した後、脊髄を包む脊柱に到達します。

動物を犠牲にし、パラホルムアルデヒド含有溶液で灌流させた後、脊髄を取り出すことができます。動物を手術台の上に置き、マウスの背面を露出させるために四肢を側面に固定します。動物の体を濡らして被毛を寝かせ、その後の皮膚切開を容易にします。

この操作には、鋭利なメスを使用します。皮膚を両側にしっかりと引っ張り、伸展させてください。切開しやすくするため、脚の筋肉を準備します。

皮膚も切開する必要があります。皮膚の切開が完了したら、それを慎重に脇へ除けます。ピンセットを用いて脚の筋肉と坐骨神経を除去した後、脊髄へのアプローチを続け、動物を新しい手術台に移動させました。

これで、頭蓋骨、頸部、筋肉、および脊柱を容易に識別できるようになりました。これらの構造をすべて識別したことで、次のステップへ容易に進むことができます。頸部の筋肉と項靭帯を除去する必要があります。

切開しすぎて脊柱を傷つけないよう注意してください。次のステップでは、脊柱を露出させるために傍脊柱筋を完全に除去します。脊柱に到達させるには、いくつかの切除を行う必要があります。

環椎後頭関節を含む頸椎から開始します。椎弓切除術を行うには、椎体からすべての椎突起を除去できるように、椎弓を切断する必要があります。前述の通り、椎弓切除術は椎弓の切断から始まります。

その後、ラミナを剥離させます。さらに多くの椎弓を 제거する必要があるため、ここでも脊髄を損傷させないように十分注意してください。角度付きの剪刀（角度付きハサミ）を使用し、両側の複数の椎弓を一度に切開すると非常に効率的です。

次に、背突起を引っ張り、椎弓を完全に除去してクローズアップします。ハサミを脊髄管の最も外側に慎重に挿入する必要があることがわかります。後に脊髄を完全に摘出することを容易にするため、脊柱の残りの外側部分を除去しなければなりません。

脊髄の解剖学的指標となるのは、いわゆる頸膨大および腰膨大です。脊髄全体の摘出が完了したら、脊髄のすべての腹根を切断し、髄膜の硬膜から切り離してください。次に、頸髄を切断します。

頭側へと進め、再び摘出を開始します。この組織を傷つけると、後の免疫化学的分析に深刻な制限が生じる可能性があるため、脊髄には細心の注意を払って触れてください。脊髄の摘出を胸髄レベルでさらに継続し、腰髄まで進めます。

最後に、今度は馬尾の側方で切断します。これで完全に遊離させることができます。ここでは、脊髄がRALカラム内の元の位置のすぐ隣に配置されているのがわかります。

最終的に、パラホルムハイデ後固定液に浸します。脊髄の免疫組織化学的解析の代表的な例として、コリンアセチルトランスフェラーゼを認識する抗体を用いて、脊髄前角の運動ニューロンを同定できます。ここでは、健康な野生型動物における多数の運動ニューロンが確認できます。

対照的に、末期のALS導入トランスジェニック動物では、前角における運動ニューロン数が大幅に減少しています。このビデオ記事を視聴することで、筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルであるSOD1-G93Aの基本的な臨床検査について習得できたはずです。

ローターテストと吊りワイヤーテストという2つの運動行動試験が実証されています。これらは基礎的な運動機能を評価する優れた手段となります。これらの試験は実施が容易で、運動機能低下の検出感度が高く、時間効率に優れています。

このビデオのメインパートでは、脊髄の作製技術について実演します。この手法は、もちろん他のあらゆるマウス疾患モデルに適用可能であり、その後の脊髄における疾患病理の免疫化学的解析において不可欠なステップとなります。ご視聴ありがとうございました。

このビデオ記事が、皆様の今後の実験に役立つことを願っております。