血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

この手順の全体的な目的は、血管内皮細胞でコーティングされたマイクロ流体デバイスを作製することです。まずマイクロ流体モールドを製作し、次にPDMSチャネルを作製することでこれを達成します。

次に、内皮細胞をデバイスに播種します。最後のステップは、デバイス内で細胞を培養することです。最終的に、内皮細胞でコーティングされたマイクロ流体デバイスを用いて、in vitro での細胞間相互作用を実証します。

この手法の既存の手法に対する主な利点は、研究者が生物学的および生物物理学的条件を厳密に制御でき、かつ蛍光顕微鏡法と互換性があることです。この方法は、血液疾患における生物物理学的な細胞間相互作用に関する知見を提供できるだけでなく、白血球生物学、がん転移、造血幹細胞生物学などの現象にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、細胞を適切に定着させるために条件を厳密に制御する必要があるため、習得に苦労することがあります。

作製の準備として、マイクロ流体デバイスのCAD（コンピュータ支援設計）画像を外部のマスク業者に提供し、フォトマスクを作成します。届いたマスクは、ソーダライムガラス上のクロム層で構成されています。ここでのマイクロ流路の幅は30 micronsです。

マイクロ流体デバイスの作製を開始するために、まずシリコンウェハをピラニア溶液で15分間洗浄し、その後、脱イオン水で10秒間すすぎます。次に、シリコンウェハをフッ化水素酸に30秒間浸し、約10秒間脱イオン水ですすぎます。続いて、スピンコーターを用いて、MicroChem社のSU-8 2025フォトレジストを回転数3000 rpmでウェハ上にスピンコートし、厚さ30 µmに仕上げます。

SU 8 20 25をコートしたウェハを95 °Cに設定したホットプレートの上に5分間置き、過剰な溶媒を揮発させます。この工程でオーブンの使用は推奨されません。次に、ウェハの上にフォトマスクを配置し、マスクアライナーでUV光を照射してSU 8 20 25フォトレジストを架橋させます。

架橋後、ウェハーを再び95 °Cのホットプレートに置き、さらに5分間加熱します。これにより、SU-8 2025フォトレジストの重合をさらに促進させます。その後、主成分がPGMEAであるSU-8現像液にウェハーを4分間浸漬させます。

これにより、架橋されていないSU 8 20 25フォトレジストが除去されます。現像したばかりのウェハを100% isopropyl alcoholで10秒間すすぎ、その後、加圧窒素を用いて乾燥させるか、クリーンなドラフトチャンバー内で数分間溶媒を蒸発させて乾燥させます。次に、乾燥させたウェハをペトリ皿の中央にテープで固定します。この際、テープをウェハの端に留めるように注意してください。

最後に、500 µLのsigma coatをウェハーにピペットで滴下します。ペトリ皿に蓋をし、皿を回してウェハー全体に均一にコーティングします。蓋を取り外し、溶媒が完全に蒸発するまで数分間ウェハーを乾燥させます。

PDMSポリマーと硬化剤を重量比10:1で混合した後、利用可能な真空システムの強度に応じて、真空デシケーターを用いて数分から1時間、気泡を除去します。すべての気泡が除去されたら、ウェハーと皿の表面が覆われるように、混合液を皿に流し込みます。これにより、厚さ約5 mmのPDMSシートを作成します。

また、厚さ1 mmの構造のない薄いPDMS片を作成します。その後、混合物を60 °Cのオーブンで一晩硬化させます。翌日、ナイフまたはメスを使用してウェハーの周囲を切り出し、複数のPDMSマイクロ流体デバイスを取り出します。

次に、シートを切り分けて個々のデバイスを分離します。PDMSシートは、マイクロ流体デバイスよりもわずかに大きく切り出してください。続いて、ピンバイス（Harris unicornまたは同様の器具）を使用して、マイクロ流体デバイスに導入口と流出口の穴を開けます。

次に、マイクロ流体デバイスとシートの表面をスコッチテープで洗浄します。その後、プラズマクリーナーを用いて、マイクロ流体デバイスとPDMSシートの表面に30秒間酸素プラズマを照射します。酸素プラズマによってPDMSの露出面に反応性種が生成され、物理的に接触させた際に結合が形成されます。

次に、20ゲージの鈍端針を装着した1 mLシリンジに、PBSで調製した50 µg/mLのヒト血漿由来フィブロネクチンを満たし、針の上にチューブを装着します。さらに、1本目のチューブの中に細いチューブを挿入し、2本のチューブの間を摩擦で密着させて固定します。

次に、より細いチューブのもう一方の端をマイクロ流体デバイスの入口に取り付けます。シリンジに圧力をかけてチャネル内をフィブロネクチン溶液で完全に満たし、チャネルが乾燥しないように出口ポートに100 microliterの小さな液滴を形成させます。その後、マイクロ流体デバイスを37 degrees Celsiusに設定した加湿インキュベーター内で40〜60分間インキュベートします。

インキュベーション後、PBSを満たした新しいシリンジを鈍針に接続します。圧力をかけて、マイクロ流体デバイス内をPBSでフラッシュします。8%デキストランを含む内皮細胞増殖培地を用いて、1 mLあたり50万から200万個のヒト臍帯静脈内皮細胞（hUVEC）を調製します。

デキストランを添加することで、細胞がマイクロ流体デバイス内で適切に接着し、正常に培養される可能性が高まります。鈍端針と幅広のチューブを装着した清潔なシリンジに細胞懸濁液を満たし、約1mの長いチューブを接続します。接続部からの漏れを防ぐため、チューブをしっかりと密着させることが極めて重要です。

システム性能を最適化するため、シリンジおよびすべてのチューブ内に気泡がないことを確認しながら、細胞溶液でチューブ内をプライミングします。この時点で、システムへの液漏れや気泡の混入を防ぐことが極めて重要です。溶液の漏出や培地中の気泡の存在は、血管内皮細胞の定着を妨げる原因となります。

すべての気泡を取り除き、チューブの全長に細胞懸濁液を満たしたら、シリンジをポンプにセットし、もう一方の端をマイクロ流体デバイスの入口に取り付けます。シリンジポンプは、マイクロ流体デバイスと同じ高さに設置してください。チューブの長い部分は、細胞と培地がデバイスに接触する前に十分に加温されるよう、インキュベーター内で慎重にコイル状に巻いて配置します。

次に、細胞懸濁液を、本システムにおいて37 °C、5% carbon dioxideの条件下で、1.23 microliters per minuteの体積流量で2時間、マイクロ流体デバイスに注入します。1.23 microliters per minuteの体積流量は、最小のチャネルにおける流速（中心流速）1 millimeter per secondに相当します。これは、全血を用いた場合、それらのチャネルにおいて約1 dime per centimeter squareの壁せん断応力に近似します。

細胞懸濁液の注入が完了したら、同じシリンジポンプと長いチューブを使用し、より大きなシリンジを用いて、新鮮な増殖培地を1.23 microliters per minuteの速度で2〜8日間注入します。細胞単層が目的のコンフルエンスに達したら、実験のために血液または細胞懸濁液をシステム内に注入します。ここでは、内皮化前のマイクロ流体デバイスを示しています。

血管系の生理学的構造を模倣した本デバイスのサイズ、スケール、および全体的な設計を視覚化するため、マイクロ流体デバイスに食紅を注入しました。明視野顕微鏡により、マイクロ流体デバイスの内皮化が確認できます。この画像は、上述のプロトコルに従って細胞を播種してから48時間以内に撮影されたものであり、最適化された灌流技術によって、内皮細胞がマイクロ流体システムの内部表面全体にコンフルエントに培養されることが可能になります。

細胞播種から24〜48時間以内に実施します。この共焦点画像に示されているように、マイクロチャネルを備えたチップ上の微小血管腫瘍は、鎌状赤血球症による微小血管閉塞イベントの多くが発生する部位である後毛細血管静脈のサイズ（30 micron）に近似しています。本実験では、脱酸素条件下で、健康な被験者から採取した全血をチップ上の微小血管デバイスに注入します。

この動画では、当社の内皮細胞マイクロ流体システムにおける全血の流れが、マイクロチャネルの閉塞箇所がなく、規則的でスムーズかつ連続的であることを示しています。ここでは、鎌状赤血球症患者の全血をチップ上の微小血管デバイスに注入しています。脱酸素条件下では、血流に著しい変化が見られ、複数のチャネルで完全な閉塞が生じています。

この手順を行う際は、チューブを交換する際に気泡を混入させないことが重要です。完成したデバイスは蛍光顕微鏡に対応しており、従来の蛍光アッセイに適応させることが可能です。この技術により、実験血液学者は、制御された生物物理学的および血行動態的環境下で、単一細胞を用いた実験を行うことが可能になります。

気泡が入らないようにしてください。