Name: 血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぶマイクロフルイディクスを用いた内皮細胞単層培養法。血液疾患における血球と内皮細胞の相互作用をin vitroで研究し、病態メカニズム解明と治療開発への応用を支援します。

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我々は、T.ハント、M.ローゼンブルース、そして彼らのアドバイスや有用な議論のためのラムラボに感謝します。私たちは、ジョージア工科大学の電子工学とナノテクノロジーのためのG.スピナーと研究所からの支援を認める。この仕事のための財政支援は、NIHの助成金K08-HL093360、UCSF REAC賞、NIHのナノメディシン開発センター賞PN2EY018244、アトランタの子供の医療の内皮細胞生物学のためのセンターからの資金によって提供されました。

1。内皮マイクロデバイスの作製<ol><li>外側のマスクベンダにマイクロ流体デバイスのコンピュータ支援設計（CAD）図面を提出することによりフォトマスクを作成します。使用されるマスクは、ソーダライムガラス上にクロム層から構成されていた。このケースでは、微小流体チャネル幅は30μmであった。 </li><li> 15分間ピラニア（硫酸と過酸化水素の10:1比）ベアシリコンウェーハを洗浄し、30秒間フッ化水素酸に浸漬。約10秒間脱イオン（DI）水で洗い流してください。 </li><li> 30μmの高さにウエハ上にスピンコーターを用いて、スピンマイクロケムSU-8 2025レジスト。 SU-8 2025、3000 rpmの回転速度が推奨されます。 SU-8の他の粘度は、この高さを実現しますどのご利用いただけます。 SU-8を使用するための完全な手順は、ご利用いただけます<a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a> </li><li> 95℃のホットプレート上でSU-8でウェハを置きます過剰な溶媒を駆動するために5分。 注意：オーブンはホットプレートとは異なるウェハを乾燥し、推奨されていません。 </li><li>ウエハ上に所望の機能の形状でマスクを配置し、紫外光（160 MJ / cm 2に公開 マスクアライナ（カールカールサス、MA-6））365 nmで測定した。このクロスは、フォトレジストをリンクします。 </li><li>さらにSU-8の重合を促進するためにさらに5分間95℃でホットプレート上でバックウェハを置きます。 </li><li>非架橋SU-8を削除するには、4分間PGMEA（プロピレングリコールメチルエーテルアセテート）から主に構成されるSU-8 Developerでウェハを浸します。 </li><li> 10秒に100％イソプロピルアルコール（IPA）と新しく開発されたウェーハを洗浄します。ウェハは、次いで溶媒が数分間、クリーンドラフト内でウェハから蒸発させることにより加圧された窒素を使用するか、または乾燥させることができる。 </li><li>テープのペトリ皿にパターニングSU-8のドライウェハーのエッジは、事前に運動を発散。 </li><li>ウェーハの完全なコーティングを確保するためにピペット、ペトリ皿の上部カバー、およびスワールウエハを用いてウェーハにSigmacote 1 mLを適用し、カバーし、すべての溶媒が蒸発するまでウェハを数分間乾燥させて削除します。 </li></ol> 2。 PDMS（ポリジメチルシロキサン）の準備<ol><li> 10:1の比（W / W）でPDMSポリマーと硬化剤を混合し、真空デシケーターを用いた気泡を除去します。脱PDMSに必要な時間の長さは、使用可能な真空システムの強さによって異なりますが、通常は数分から1時間の範囲である。なし以前に注ぎPDMSと6インチのペトリ皿には、ポリマーの60 mLの全量をお勧めします。 </li><li> 、ウエハ上に厚さ約5mmの混合物を注ぐ。また、厚さ約1mmのPDMSの薄いシートを作成するためにフラットボトム皿に注ぐ。 60一晩オーブンで℃で硬化します。 </li><li>ナイフやメスを用いて、Cの周りに切り取るPDMSデバイスをuredとウェハからそれを削除します。さらに、デバイスよりも若干大きくPDMSの薄いシートを切った。 </li><li> 1.0ミリメートルの穴パンチを使用してPDMSデバイスの入口と出口の穴を作成します。これは、どちらかのピンの副、ハリスユニコア、または同様の装置を用いて達成することができる。 </li><li>デバイスの表面とスコッチテープを使用してシートをクリーニングします。 </li><li>プラズマクリーナーを使用して、30秒間酸素プラズマにPDMSデバイスの表面とPDMSシートを公開します。酸素プラズマは、物理的に接触結合PDMSの露出面に反応種を作成します。 </li><li>順番に、PBS中のヒト血漿から50μg/ mlのフィブロネクチンで埋め平滑末端ポイント針と注射器に接続されている大規模なチューブの小さな長さ（数センチ）に小さいチューブを接続します。チューブと針が摩擦フィットがチューブの間に作成されるようにサイズ調整されています。小さなPDMSマイクロデバイスの入口にチューブを挿入pplyシリンジに圧力がフィブロネクチン溶液を完全にチャネルを埋めるために、出口ポートに小型の100μLのドロップを作成するには、チャネルがぬれたままいることを確認する。 40から60分間37℃でデバイスをインキュベートします。 </li><li>鈍ポイント針にPBSを充填した新鮮なシリンジを接続します。 PBSでデバイスをリンスするために注射器に圧力を適用します。 </li></ol> 3。内皮細胞とマイクロ流体デバイスを播種<ol><li> 8パーセントデキストランと内皮細胞増殖培地中でヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の1,000,000細胞/ mLを準備します。 50万〜2,000,000細胞/ mLの範囲が正常に使用されています。セルローディング培地にデキストランの添加は、フィブロネクチンでコーティングされたマイクロ流体システムを入力すると、内皮細胞の移動速度を減少させ、流体の粘度を増加させます。これは、順番に、細胞がマイクロデバイス内に正常に付着し、文化れる可能性が増加します。 </li><li> ℃ステップ2.7のように新しいシリンジとチューブをONNECT。しかし、長いチューブ（長さ約1メートル）である。 </li><li>このシステムのパフォーマンスを最適化するために、それは全体の灌流システム内の任意のリークや気泡を防ぐために、この時点で非常に重要です。ソリューションやメディアの中の気泡の有無のいずれかのリーク電流は流れを変更し、内皮細胞の正常な播種を防ぐことができます。したがって、チューブのタイトフィッティングは、任意の接続間の漏れをなくすことが不可欠である。細胞は、マイクロデバイスに導入されており、全体の灌流システムは、気泡の導入を避けるために、流体にチューブを接続する前に細胞溶液でプライミングする必要があります前に、注射器、および/またはチューブ内の気泡を除去する必要があります。 </li><li>シリンジポンプを用いて、Cおよび5％CO 2、37℃で2時間1.23μL/ minの体積流量でPDMSデバイスに細胞懸濁液を注入する。シリンジポンプにいたとき、最適な結果を達成しました<html> PDMSデバイスと同じ高さ。入口には、インキュベーター内で巻いすることができます長いチューブは、細胞やメディアが適切にデバイスに接触する前に温めていることを保証します。本システムでは、1.23μL/ minの体積流量は、全血を使用してこれらのチャネルで〜1ダイン/ cm 2の壁面せん断応力に対応する最小のマイクロ、で〜1 mm / sの途中速度を概算します。 </li><li>同じシリンジポンプ、長いチューブを使用して、1.23μL/ minの割合で2から8日間新鮮な増殖培地を灌流。成功したデバイスは、内皮細胞の単層は24-48時間以内のデバイスの内側に成長しているでしょう。以前の実験では、コンフルエントな単層が適切にデバイス14を通して細胞間接合部のVE-カドヘリンを発現していることが示されている。 </li><li>実験のためのシステムへの血液や細胞懸濁液を注入します。 </li></ol> 4。代表的な結果その後_content &quot;&gt;このプロトコルを使用して、標準的なリソグラフィの微細加工技術は生理学的に微小血管（ 図1A）のsizescaleを模倣するマイクロ流体チャネルを生成するために必要な金型を作成するために使用されています。最適化された灌流法を用いて、内皮細胞種とconfluently文化細胞播種の24〜48時間以内マイクロ流体システムの全体の内面（ 図1B）は、マイクロ流体システムは、透明であるため、全体のマイクロデバイスは、イメージングとデータ収集のために明視野/蛍光顕微鏡ステージ上に配置することができます。 我々のシステムは、その後sickled赤血球と異常な白血球と血管内皮接着の増加剛性が微小血管の閉塞に寄与するような鎌状赤血球症などの生物物理学的特性を、変更を伴う血液疾患を研究するために適用することができます。臨床的に承認された薬、ヒドロキシウレアは、症状が、そのdを改善する微小血管の流れのirect効果は不明である。我々のアッセイは、アカウントセルの剛性と密着性の両方にかかり、ヒドロキシウレアが大幅に鎌状赤血球症（ 図2）の流れを改善することを示しています。 このシステムは理想的な血液細胞は、微小血管系でお互いと内皮細胞と相互作用する任意の血液学的プロセスを研究するために適しているとして、鎌状赤血球症は、微小血管·オン·チップ用のアプリケーションの一例にすぎません。より基本的なアプリケーションは、白血球生物学と他の多くの間造血幹細胞生物学を含めながら、他の臨床的に関連するアプリケーションでは、炎症性疾患、敗血症/肺傷害、血栓microangiopathies、マラリア、がんの転移が含まれています。 <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。）初期PDMSマイクロ流体デバイスを内皮前。ここでは、マイクロデバイスは、ウィットを注入されH食品は、システムのsizescaleと全体のデザインを説明するために着色。 B）明視野顕微鏡は、マイクロ流体システムが完全にここで説明したプロトコルを使用して、細胞播種の48時間以内にendothelializedであることを示している。 <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="図2"/> 図2）。マイクロと微小血管·オン·チップは、ほとんどの鎌状赤血球血管閉塞イベントのサイト、後毛細血管細静脈（30μm）のサイズを概算します。ヒドロキシウレアを受けて鎌状赤血球症患者から、ヒドロキシを受けていない患者から全血は、2つの異なる微小血管系オンチップデバイスを介して流される。 endothelializedマイクロ内の相対的な容易にヒドロキシウレアの流れを受けて鎌状赤血球症患者からのB）全血。 C）同じ血行動態の条件下では、ヒドロキシウレアを受けていない鎌状赤血球症患者から全血は、しかし、microchと​​はるかに遅い流れを示すannel閉塞。一番下のチャンネルが完全に流れがないと妨害や他のendothelializedマイクロチャネル内の流速は、ヒドロキシウレアの条件よりも有意に低くなっています。すべての3つの画像中のスケールバーは30μmである。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

私たちのendothelializedマイクロデバイス·システムは、in vivoの実験ではと組み合わせて使用するときに最も適していると、その還元のアプローチは、人間と動物モデルで観察された血液学的プロセスの生物物理学的メカニズムの解明に役立つことがあります。さらに、我々のシステムには限界がないわけではない。例えば、我々の流体チャネルは、クロスセクションの正方形です。技術的に円形のマイクロチャンネル10,11を作製することができますが、我々は他の研究者が容易に自分の仕事にこのシステムを適用できるようにより簡素化と標準的な製造手順を使用することにしました。さらに、効果的なルーメン &quot;アウトラウンド&quot;培養内皮細胞当然の存在は、システムは、より生理的であることができるようになります。さらに、我々の流体力学モデリングは、我々のシステムの流れ条件は生体内微小血管系でのそれに匹敵することを明らかにした。最後に、最近の研究では、広場で血流を特徴づけるD長方形のマイクロは、それらのジオメトリは、血液レオロジーの実験15...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>鈍ポイント針</td><td> OKインターナショナル</td><td> 920050-TE </td><td>精度TE針20ゲージ×1/2 &quot;、ピンク</td></tr><tr><td>デキストラン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 31392 </td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> F0895 </td><td></td></tr><tr><td>穴パンチャー（ピン万力） </td><td>技術革新</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト臍帯内皮細胞（HUVEC） </td><td>ロンザ</td><td> CC-2519 </td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>プラズマ</td><td> PDC-326 </td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン（PDMS） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> NC9285739 </td><td> Sylgard 184シリコーンエラストマーKIT </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> SL2 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 2025 </td><td>マイクロケム</td><td> Y111069 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8開発</td><td>マイクロケム</td><td> Y020100 </td><td></td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td> 70から3008 </td><td> PHD-ULTRA </td></tr><tr><td>チューブ（大きい） </td><td>コー​​ル·パーマーインストゥルメント·カンパニー</td><td> 06418から02 </td><td> Tygonregマイクロボアチューブ、0.020 &quot;内径x 0.060&quot; OD </td></tr><tr><td>チューブ（小さい） </td><td>コー​​ル·パーマーインストゥルメント·カンパニー</td><td> 06417から11 </td><td> PTFEマイクロボアチューブ、0.012 &quot;内径x 0.030&quot; OD </td></tr></tbody></table>

血液疾患における血管相互作用を研究するためのendothelializedマイクロフルイディクス

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

微細加工技術の進歩により、マイクロ·nanoscales 1,2で生物学的および生化学的な実験を実施するための安価で再現性のあるマイクロ流体システムの生産を有効にしている。さらに、マイクロフルイディクスは、具体的にするため、簡単に動的な流体の環境及び生物学的条件3-6を制御する能力を、定量的に血液と血管のプロセスを分析するために使用されています。このように、研究者は最近では血液細胞の変形能、血液細胞の凝集、微小血管の血流、血液細胞血管内皮細胞の相互作用6-13勉強するマイクロ流体システムを使用しています。しかし、これらのマイクロ流体システムのいずれかの培養内皮細胞を含めたり、大きかったしませんでした微小血管の病理学的プロセスに関連するsizescaleより。培養内皮細胞を用いたマイクロ流体プラットフォームを正確に反復する携帯電話、物理的、およびhemodynその微小循環のアミック環境は微小血管を伴う血液疾患の根本的な生物物理学的病態の理解を促進するために必要です。 ここでは、血液疾患で発生する病理学的生物物理学の微小血管の相互作用を研究するために、標準的な内皮細胞培養技術と組み合わせて、シンプルな単一のマスクの微細加工プロセスを用いて、微小血管の in vitroモデルで &quot;endothelialized&quot;を作成する方法を報告します。この &quot;微小血管·オン·チップ&quot;はしっかりと生物学的ならびに生物物理学的条件を制御し、標準的なシリンジポンプと明視野/蛍光顕微鏡を用いて操作された堅牢なアッセイを用いて研究を提供しています。このような微小循環血行状態、内皮細胞の種類、血液細胞の種類（s）と濃度（S）、薬物/阻害濃度等、などのパラメータはすべて容易に制御することができます。このように、私たちのマイクロシステムを提供します定量的に微小血管の流れが原因で、細胞接着、凝集し、変形能は、既存のアッセイでは使用できない機能に変化が損なわれている病気のプロセスを調査する方法。

微小サイズのチャネル（&lt;30μm）を持つマイクロ流体デバイスの全体の内部の三次元表面全体に文化内皮細胞単層をに方法が記載されています。この<em&gt; in vitroで</em&gt;微小血管モデルは、血液細胞、内皮細胞、血液疾患における可溶性因子との間の生物物理学的相互作用の研究を可能にします。

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

微細加工技術の進歩により、生物学的および……を実施するための、安価で再現性の高いマイクロ流体システムの製造が可能になりました。

この手順の全般的な目的は、血管内皮細胞でコーティングされたマイクロ流体デバイスを作製することです。これは、まずマイクロ流体モールドを作製し、次にPDMSチャネルを作製することで達成されます。次に、内皮細胞をデバイス内に播種します。最後のステップは、デバイス内で細胞を培養することです。最終的に、内皮細胞でコーティングされたマイクロ流体デバイスを用いて、in vitroでの細胞間相互作用を示します。既存の手法に対する本手法の主な利点は、研究者が生物学的および生物物理学的条件を厳密に制御でき、かつ蛍光顕微鏡法と互換性がある点にあります。本手法は血液疾患における細胞間生物物理学的相互作用に関する知見を提供できるだけでなく、白血球生物学、がん転移、造血幹細胞生物学などの現象にも適用可能です。一般的に、細胞を正常に定着させるためには条件を厳密に制御する必要があるため、本手法を初めて行う方は習得に苦労することがあります。作製の準備として、マイクロ流体デバイスのコンピュータ支援設計（CAD）画像を外部のマスク業者に提出し、フォトマスクを作成します。納品されたマスクは、ソーダ石灰ガラス上のクロム層で構成されています。ここでのマイクロ流路幅は30 micronsです。マイクロ流体デバイスの作製を開始するために、まずシリコンウェハーをピラニア溶液で15分間洗浄し、その後、脱イオン水で10秒間すすぎます。次に、シリコンウェハーをフッ化水素酸に30秒間浸し、約10秒間脱イオン水ですすぎます。続いて、スピンコーターを用い、回転数3000 rpmでMicroChem SU-8 2025フォトレジストをウェハー上にスピンコートし、厚さ30 µmに仕上げます。SU 8 20 25をコーティングしたウェハを95 °Cに設定したホットプレートの上に5分間置き、過剰な溶媒を飛ばします。この工程にオーブンを使用することは推奨されません。次に、ウェハの上にフォトマスクを配置し、マスクアライナーでUV光を照射して、SU 8 20 25フォトレジストを架橋させます。架橋後、ウェハーを再び95°Cのホットプレート上に置き、さらに5分間加熱します。これにより、SU-8 2025フォトレジストの重合をさらに促進させます。その後、主にPGMEAで構成されるSU-8現像液にウェハーを4分間浸漬します。これにより、架橋されていないSU 8 20 25フォトレジストが除去されます。現像したばかりのウェハを100%イソプロピルアルコールで10秒間すすぎ、その後、加圧窒素を用いて乾燥させるか、クリーンなドラフトチャンバー内で数分間溶媒を蒸発させて乾燥させます。次に、乾燥したウェハをペトリ皿の中央にテープで固定します。この際、テープをウェハの端に貼るように注意してください。最後に、500 µLのsigma coatをウェハー

endothelialized-microfluidics-for-studying-microvascular-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここで、我々は、ヒト臍帯血由来内皮コロニー形成細胞（ECFCs）と皮下免疫不全マウスへのコラーゲン/フィブロネクチンゲルに埋め込まれている骨髄由来間葉系幹細胞（MSCs）を、、実現する方法論を説明します。このセル/ゲルの組み合わせは、マウスの血管系に接続する人間の血管ネットワークを生成します。...

免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

フォトリソグラフィ法によりエッチングし、PDMSから製造されるマイクロ流体フローチャンバーは、EC機能不全や炎症に関連付けられた機能的転帰を調べるために適用されます。代表的な実験では、EC単層を活性化サイトカインの単球の細胞接着を調節する差動せん断応力の能力が実証されています。...

オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

マイクロチャネル·オン·チップ·プラットフォームは、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせによって開発されました。内皮マイクロチャネルプラットフォームは、 インビボにおける微小血管の3次元（3D）ジオメトリを模倣する制御された連続かん流の流れの下で実行され、高品質かつリアルタイムイメージングを可能にし、微小血管の研究に適用することができる。...

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

血小板輸血と止血は、血液貯蔵血小板の機能を調査するために、血液再構成とマイクロ流体フローチャンバーを使用してモデル化されました。このデータは、血小板蓄積病変がin...

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Primary Human Umbilical Vein endothelial cells...

の開発と特性評価<em&gt;インビトロ</em&gt;微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt;私</sub&gt;と一酸化窒素の生産

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。...

微細と3D微小血管の組立

患者由来の内皮との全血相互作用を調べるインビトロ血管疾患モデルを紹介する。このシステムは、様々な状況下での原発性内皮細胞の血栓形成特性の研究を可能にする。この方法は、凝固の異なる段階でのその際の血栓性および抗凝固療法において評価するのに特に適している。...

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。...

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。...

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

フロー下での血小板機能を評価し、マイクロ流体デバイスを使用してシミュレートされた止血蘇生法をモデル化でき、これは外傷および輸血医療に応用できます。...

血小板機能の評価におけるマイクロ流体工学

ここでは、内皮細胞に同期振動性高血糖およびパルサタイルせん断応力を曝露するマイクロ流体システムを製作・運用するプロトコルを提示します。このアプローチは、糖尿病の内皮機能障害を研究するための生理学的に関連性の高い in...

生理的パルサタイルせん断応力と振動性高血糖を組み合わせた内皮機能障害をモデル化するためのマイクロ流体システム

学ぶマイクロフルイディクスを用いた内皮細胞単層培養法。血液疾患における血球と内皮細胞の相互作用をin vitroで研究し、病態メカニズム解明と治療開発への応用を支援します。

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

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