ラットの精巣挙筋の虚血再灌流障害における白血球 - 内皮相互作用のリアルタイムデジタルイメージング（IRI）

CRE（脛骨格筋）の微小循環の生体内顕微鏡観察は、横紋筋組織の虚血および再灌流傷害に関する知見を得るための簡便な手法です。本ステップバイステップのプロトコルでは、動脈カニューレーションによる十分なモニタリングを行いながら、動物を長時間にわたり深く麻酔状態に維持するための、呼吸制御下麻酔の開始方法について説明します。また、頸静脈のカニューレーション方法を示し、その後、優れた光学分解能を得るためにCRE matricを薄い平坦なシート状に準備する方法について記述します。

当研究室で確立された、虚血再灌流障害における白血球イメージングのプロトコルを紹介します。このモデルは、虚血再灌流障害における酸化ストレス作用の解析に使用できます。

虚血再灌流傷害は、心筋梗塞や腸管虚血、ならびに移植手術や心血管手術後の経過など、広範な病理学的状態で関与しています。以前に虚血状態にあった組織への再灌流は、不可逆的な組織損傷を防ぐために不可欠である一方、活性酸素種の生成、補体系の活性化、および微小血管透過性の亢進に伴い、罹患組織に過剰な炎症を誘発します。白血球の活性化は、再灌流時における炎症性組織損傷の病理学的カスケードにおける主要な要因の一つです。

本稿では、虚血再灌流障害における白血球の活性化を解析するための簡便な手法として、後毛細血管静脈の生体内顕微鏡観察を推奨します。さらに、一般的な落とし穴を例示し、読者が本手法を正しく理解し、安全に実施できるようにするための有用なヒントを提供します。倫理委員会の承認を得た後、体重120〜180 gの雄のラットを麻酔し、プレキシグラス製のボックス内に配置して、イソフルラン気化器を介して2〜3 vol%のイソフルランを投与しました。

適切な麻酔レベルに達した直後に、ラットの体重を測定し、頸部腹側を除毛します。体温を37 °Cに維持するため、ラットを加熱パッドの上に背臥位で配置し、シリコンマスクを用いて2 volume %のisofluraneを投与します。以下の準備は、手術用顕微鏡を使用して行うのが最適です。

SRAの胸切痕付近で、2 cmの水平方向の皮膚切開を行います。唾液腺を外側に寄せます。これで頸部の腹側筋群が露出します。

正中線に沿って慎重に分離し、気管を確認します。気管を1〜2 cm露出させ、マイクロ鉗子を下から挿入して挙上させます。次に、気管腹側のほぼ中央に14ゲージのチューブを気管チューブとして気管下部に挿入します。このチューブは、あらかじめ動物用人工呼吸器に接続しておいてください。

その後、呼吸は1分間に35～45回の頻度で容量制御します。頸動脈カニュレーションには、1回換気量を4.5～5 mL、イソフルラン濃度を1.5～2 volume %に設定します。右胸骨舌骨筋を鈍的剥離により分離します。

頸動脈を特定するため、迷走神経を頸動脈から慎重に分離し、心臓からの血流を止めるために頸動脈をAnkiマイクロ鉗子で固定します。心臓からの位置関係に基づき、頸動脈の下に2本の結紮糸を配置し、遠位側の結紮糸はきつく結び、近位側の結紮糸は緩く結びます。2本目の近位側結紮糸を配置することで、マイクロ鋏を用いて2つの結紮部位の間で頸動脈に小さな切開を加えた後、マイクロ鉗子を外した際の出血を防ぐことができます。圧トランスデューサーに接続され、生理食塩水で満たされたポリエチレンカテーテルを挿入します。

マイクロ鉗子を取り除き、カテーテルをさらに動脈内へ挿入します。血液ガス分析装置を用いて断続的な動脈血ガス分析を行い、蛍光色素やその他の目的薬を静脈内投与する際は、血液のpHを生理学的範囲内に維持します。手術用顕微鏡で左頸静脈の領域に焦点を合わせ、両手に鉗子を持って薄い筋膜を裂き、頸静脈を露出させます。

血流を止めるため、血管を角度付きマイクロ鉗子で固定します。鉗子を用いて、頸動脈のカニュレーションと同様の手順で、等長に切った2本の結紮糸を頸静脈の下に通します。頸静脈に小さな切開を加え、セルライン溶液でフラッシュ済みのポリエチレンカテーテルを挿入します。カテーテルを心臓方向へ進め、心臓に近い側の結紮糸を締め付けます。

静脈およびカテーテルの周囲に、加熱パッドの目的温度に速やかに到達するアルミ製のステージ4精索イメージングを使用します。まず、陰嚢の最遠端上の皮膚および外精索筋膜を切開し、続いて細い鋏を用いて皮下組織を慎重に剥離します。組織が露出次第、あらかじめ加温した生理食塩水で湿らせます。

外精膜と陰嚢挙筋の間の結合組織を慎重に除去し、周囲の組織から挙筋を遊離させます。解剖中の持続的な灌流により組織が水和され、視認性と除去が容易になります。例えば、陰嚢の腹側遠位端にある陰嚢挙筋の末端を固定してわずかに伸展させ、切開線を近位方向に延長します。マイクロシザーを用いて、切開線に沿った出血血管を慎重に結紮します。

サーマルコーリを使用し、開いた精索挙筋をアルミニウム製の台座上に平らに置きます。このとき、精巣の下にある精上皮（EPIs）には、細い靭帯、小さな動脈および静脈がまだ接続しています。電気凝固器を用いて血管を封鎖し、円盤状組織と挙筋組織の間の結合靭帯を切断します。単離した精巣を鼠径管へそっと押し戻します。

組織を4か所で縫合して固定する最初の固定に加えて、糸を慎重に広げながら、精索筋組織をアルミステージ上に放射状に広げます。灌流セットアップのため、ポリエチレンカテーテルの両端を精索筋組織の近くに配置します。シリンジを使用して精索筋の周囲に petroleum gili のラインを引き、流体チャンバーを作成します。

正方形のカバーガラスを組織の上に置き、縁をワセリンのラインにしっかりと密着させます。これで精索組織の顕微鏡イメージングの準備が完了しました。基本的な生体内（イントラバイタル）セットアップは異なる場合があります。

EPラミネーションには、470 nanometerのLED光源を備えた生体内エピ蛍光顕微鏡を使用します。水浸対物レンズを用い、高解像度デジタルカメラによって約800 xの倍率で観察記録を行います。エピ蛍光イメージングを行う際は、実験を暗室で実施してください。

白血球の標識を行うため、ルミネックス（rhumine six J）を頸静脈カテーテルから体重1kgあたり0.4mgの濃度で静脈内注射します。観察には毛細血管後静脈を選択してください。血管径は20〜60µmの範囲で、血流が十分である必要があります。

虚血が起こる前に、組織を30分間安定させます。その後、白血球のローリングおよび接着の基線値を設定するために、30秒間の記録を行います。アプリケーション鉗子を用いて、露出した精索組織の極めて近位端にBemer血管クリップをそっと装着します。

虚血から30分後に血管クランプを取り除きます。その後、再灌流期間を通じて記録を行うことができます。白血球ローリングを定量化するために、すべての記録で一貫した、血管を垂直に横切る仮想線を定義します。

30秒間にラインを通過するローリング白血球の数を手動でカウントします。接着白血球を定量する場合、すべての記録において一貫した200 µmの血管セクションを定義してください。

30秒間静止した状態で明確に視認できる白血球の数を数えます。代表的な結果は、記述プロトコルの中に記載されています。虚血再灌流傷害はさまざまな器官系で関与していることが知られていますが、ここでは骨格筋組織の再灌流傷害における白血球と内皮細胞の相互作用を分析する方法について説明します。

したがって、他の臓器の虚血後組織損傷においても同様の炎症メカニズムが関与していると考えられるため、特に遊離組織移植術において重要です。本手法を用いることで、虚血再灌流障害における病理学的メカニズムに関する原理的な知見を得ることができます。精管挙筋への虚血負荷は容易に実施でき、遊離皮弁移植術などの臨床的に重要な条件を完全に反映させることが可能です。

さらに、冷虚血や温虚血などの処置、あるいは炎症に影響を与える物質による染色的な灌流などの修飾を容易に適用できます。記録の数時間前または数日前に治療が必要な場合は、口腔内注入が最適な方法となります。