ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

本実験の総合的な目的は、相関蛍光・電子顕微鏡法を用いて、タンパク質の局在化および電子顕微鏡写真の同定を行うことです。ここでは、nano FEMとして知られる手法を用いて、C. elegansにおけるタンパク質の局在化を行います。まず、ヒストンTD-eosを発現する形質転換虫をプラスチックに包埋し、切片を作成します。

各切片を、光活性化局在顕微鏡（PALM）と走査電子顕微鏡の両方で撮影します。各切片の2枚の顕微鏡写真を、Photoshopを用いてフィデューシャルマーカーにより位置合わせします。相関画像により、核内におけるヒストン分子の局在が示されます。

本日説明する手法の主な利点は、免疫電顕（immuno EM）を使用する代わりに、遺伝子コード化された蛍光タンパク質を用いることで、すべてのタンパク質を蛍光タンパク質と結合させている点にあります。免疫電顕では、多くの抗体がプラスチックと反応できないか、あるいは適合しなかったとしても、抗原が存在する切片の深部まで抗体が浸透できないという問題があります。

蛍光タンパク質を用いることで、あらゆるタンパク質に蛍光標識を付加できます。本日は、shige wbiがこの手法を実演します。以下の手順では、蛍光タンパク質TDE osで標識されたヒストンを発現する遺伝子組換え線虫を用いて実演します。

このデモンストレーションでは、凍結保護剤として細菌を使用しますが、海辺の優美な生物（sea elegance）を凍結させる場合には、20% BSAを使用することも可能です。凍結置換の1時間前に、自動凍結置換装置またはFSデバイスに液体窒素を満たしてください。また、事前に付属文書の指示に従って必要な固定液を調製し、1 mLずつクライオバイアルに分注して、使用時まで液体窒素中に保存してください。

ペイントブラシを使用して、細菌のローンから動物をすくい取り、100 µmの試料キャリアに移して満たします。気泡が入らないように、カップをわずかに溢れるまで満たしてください。準備ができたら、試料カップを高圧凍結機のアーマチュアに設置して凍結させます。その後、すぐに試料を凍結室の隣にある液体窒素バスに移してください。

次に、ピンセットと鉗子を用いて、検体を固定液の入ったクライオバイアルに移します。検体が常に液体窒素に浸かっているようにしてください。この操作を各検体について繰り返し、その後、すべてのクライオバイアルをFSユニットに移します。

すべてのクライオバイアルをFSユニットに設置したら、プログラムを開始します。凍結および処理プロトコルはこの図に示されています。最初の-90°Cでのインキュベーション中に、ガラス状の氷がアセトン中の固定液に置き換えられます。

その後、試料の温度が上昇するにつれて、液体アセトン中の固定液が試料を架橋し、構造を維持します。FSユニットの温度が-60°Cに達したら、20mLの95%アセトンを含むシンチレーションバイアルをFSに入れ、冷却します。次に、温度が-50°Cに達したとき、P 200チップを装着したパスツールピペットを使用して固定液を除去し、各試料に予冷した95%アセトンを約1mL加えます。胆汁。

この工程を20分ごとに2時間にわたって繰り返します。また、-50 °Cでのインキュベーション中に、0.1% ウラニル酢酸を 95% アセトンに溶解した溶液を 20 mL 入れたシンチレーションバイアルをフリーズドライ（FS）チャンバーに入れ、-50 °Cまで予冷しておきます。その後、最終のアセトン洗浄が終わったら、各バイアルにウラニル酢酸溶液を約 1 mL 加えてサンプルを染色し、膜のコントラストを向上させます。

プログラムを一時停止していた場合は、再開させてください。温度が-40°Cに達したら、95% ethanolを入れたシンチレーションバイアルをFSチャンバー内に設置します。温度が-30°Cに達したら、パステュールピペットを使用して、2時間にわたり20分ごとに尿中酢酸を95% ethanolに置換してください。

アセトンが存在すると樹脂が重合しないため、このステップではエタノールを使用することが重要です。プロトコルの次のパートでは、試料を−30 °Cに保った状態でプラスチックに包埋します。FSにおいて、95% ethanolを、あらかじめ冷却した30% glycol methacrylate resin（またはGMA in 95% ethanol）に交換します。3〜5時間後、30% GMAを70% GMAに交換し、4〜6時間後、70% GMAを取り除いて、試料を97% GMAで一晩インキュベートします。

GMA濃度を段階的に上昇させることで、培地を組織内部まで浸透させます。GMA樹脂に3%の水を添加しているため、97%GMAは希釈されないことに注意してください。翌日、エタノールを用いて、パスツールピペットでサンプルをAFS内の包埋モールドに移します。サンプルを包埋モールドに配置した後、97%GMAを、-30 °Cで6時間かけて、新しく調製したGMAと3回交換します。

3回目の交換後、細菌マトリックスをタップして、検体を凍結保護剤から分離させます。換気バイアル内で、97%GMAに開始剤のnn dimethyl udineを加えます。開始剤の添加量は、GMA 1 mLあたり1.5 µLとします。直ちにGMA溶液を各包埋型に注入し、動物の間隔が均等になるように型の中に配置します。

温度が-20°Cまで上昇するようにプログラムを再開します。樹脂は1時間以内に急速に重合しますが、完全に重合させるため、プラスチックを-20°Cで一晩硬化させてください。

プラスチックが硬化した後、試料を窒素ガスを満たした真空袋に入れ、-20 °Cで保存します。GMA包埋試料の薄切は、光活性化局在化顕微鏡（PALM）イメージングに関する付随文書に従って行ってください。顕微鏡システムは、EMCCDカメラを-70 °C以下に設定して準備してください。

ピペットを使用して、100 nmの金粒子（濃度 1×10¹⁰ particles/mL）溶液を約50 µL、イメージングするサンプルに滴下します。サンプルの上に黒色のカバーケースを置き、カバーガラスの上で溶液を30秒間静置させます。金粒子溶液を除去するために、溶液をカバーガラスの端まで吹き飛ばし、キムワイプで吸収させます。

次に、円形カバーガラスホルダーに真空グリースを塗布し、カバーガラスを挿入します。カバーの裏面に浸油を塗布します。サンプル直下にスライドさせます。

サンプルホルダーを顕微鏡ステージのスロットに挿入し、しっかりと固定して、切片が対物レンズの真上に来るように中心を調整します。この際、対物レンズに触れないよう十分に注意してください。次に、明視野照明を用い、10倍の対物レンズで切片の位置を確認します。

次に、100倍の対物レンズに切り替え、標的に焦点を合わせます。必要に応じて、強度を10%に設定した488 nanometerレーザーを用いて蛍光照明に切り替えます。サンプルの温度が安定するまで5分間待ちます。その後、最も強い蛍光を発している領域を特定し、そこに焦点を合わせます。

レーザーを561 nanometersに切り替え、強度を100%まで上げます。背景の自家蛍光を消光させるため、サンプルを約2分間漂白します。漂白中にフォーカスがずれた場合は、5分間経過させてからフォーカスの調整と画像のキャプチャを行ってください。漂白が完了したら、405 nanometerレーザーを起動し、強度を最低に設定します。

1秒間に20フレームの速度で画像の収集を開始します。本実験の目的を達成するために十分な数のフレームを収集してください。核内における584個のヒストンタンパク質の局在を決定するために、5,000から6,000フレームを撮影します。

5,000フレームの収集が完了すると、イメージングソフトウェアによってすべての分子が識別され、マッピングされます。最終的な蛍光画像、いわゆる「sum turf image」は、カメラで検出されたすべての蛍光を合成したものです。対照的に、「palm image」は各蛍光スポットのOIDをマッピングしたものであり、各タンパク質がどこに位置しているかのみを示します。

SEM観察の前に、2.5%酢酸ウラニル水溶液を用いて切片を4分間染色します。ろ過した超純水（milli QE water）で酢酸ウラニルを十分に洗い流します。切片を乾燥させた後、スパッタコーターを用いて、カバーガラスが十分に暗くなるまでカーボンコートを行います。

カバーガラスの片端の端と、もう一方の端のメタルスタブにカーボン導電テープを貼り、カバーガラス表面に蓄積する電子を接地させます。カバーガラスをSEMチャンバーにセットし、顕微鏡で試料の位置を確認します。試料の低倍率像を撮影した後、関心領域までズームし、高倍率像を取得します。

すべてのセクションの撮影が完了するまで、新しいセクションでこの操作を繰り返します。次に、palm画像とEM画像を位置合わせする必要があります。まず、取得したSEM画像をPhotoshopで開いてください。

5,000×5,000ピクセルのサイズで、解像度300pixels per inchの新しいウィンドウを作成します。読み込んだSEM画像を新しいウィンドウにコピーします。「編集」メニューにある「自由変形」コマンドを使用して、画像がウィンドウ全体に収まるように拡大縮小します。

次に、高倍率のSEM画像をコピーし、必要に応じてスケール調整と変換を行います。画像のドロップダウンメニューバーから画像の回転を選択し、合算ターフ画像を水平方向に反転させます。合算ターフ画像をコピーして、新しいレイヤーに貼り付けます。

編集メニューにある自由変形コマンドを使用して、画像が低倍率の電子顕微鏡写真とほぼ同じサイズになるように拡大・縮小します。次に、金粒子の蛍光がSEMで可視化された対応する構造と一致するように、必要に応じて画像を回転させます。続いて、パーム画像を新しいレイヤーにコピーし、同じ変形を適用して高倍率の画像を抽出します。

関心領域をズームし、その領域からパーム画像（palm image）をコピーします。プレゼンテーション用に、この画像をより高解像度のSEM画像に貼り付けます。パーム画像にはグラデーション透過処理を適用し、パームのシグナルではなく、黒い背景のみが透過するようにしてください。

変換後のパーム画像を新しいレイヤーにコピーします。「選択」ドロップダウンメニューから「色域」を使用し、背景ではなくパームのシグナルを選択します。次に、参照として背景のピクセルを選択し、「反転」オプションをオンにします。

目的の手掌信号を切り取り、新しいレイヤーに貼り付けます。背景レイヤーに透明度を適用し、10%に設定します。これにより、信号の強度を損なうことなく背景を透明にし、手掌信号を可視化することができます。ヒストンタンパク質。

His11タグ付きTD eosを線虫C. elegansに安定発現させ、このビデオで説明しているプロトコルに従って形質転換体を処理およびイメージングしました。PALM像と電子顕微鏡像を同一切片から取得しました。蛍光像と電子顕微鏡像の両方に現れる金ナノ粒子を用いて、これら2つの画像を位置合わせしました。

ここでは、顕微鏡写真の上端付近の領域を拡大します。ここで見られるように、核などの細胞内詳細が確認できます。

核、核孔、および小胞体が観察できます。しかし、タグ付けされたヒストン分子は核にのみ局在しており、核以外には存在しません。期待通り、相関PALM顕微鏡および電子顕微鏡を用いることで、最高解像度でのタンパク質の局在確認が可能になります。この手順の後、タンパク質分布を含むこれらの切片を採取し、アレイ・トモグラフィーを用いてスタックすることで、細胞内のタンパク質分布を示す三次元構造を構築できます。

また、四酸化オスミウムは非常に危険な化学物質であるため、使用時は常に手袋を着用してください。