Name: ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 学ぶナノFEM法で、写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を組み合わせ、C. elegansの組織タンパク質を核内に高精度で局在化する手法。この相関イメージング技術は、従来の免疫電子顕微鏡の限界を克服し、タンパク質の細胞内分布を詳細に解析できる。

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我々は固定プロトコル、試薬や励ましを共有するための証明の原理実験、リチャード·フェッター用のPalm顕微鏡へのアクセスのためにハラルドヘスとBetzigエリックに感謝します。我々は、マイケルソン、ジェラルディンSeydoux、ステファンアイマー、ルドルフロイベ、キースNehrke、クリスチャンFrøkjr·ジェンセン、DNA構築のためのオードADA-ヌグエマとMarc Hammarlundに感謝します。我々はまた、ツァイスPAL-M、ツァイスELYRA P.1やし顕微鏡のベータ版へのアクセスを提供するためにカールツァイス社に感謝します。

<ol><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li>
<li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24(2010).</li>
<li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li>
<li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images%3A+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li>
<li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
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<li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li>
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<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li>
<li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+background-free%2C+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+%28SOFI%29%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li>
<li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleaching%2Fblinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
</ol>

この記事への生産とフリーアクセスはカールツァイス社が主催している

ここでは、プラスチック製で、電子顕微鏡を用いた超微細構造をセクションで蛍光タンパク質をローカライズし、画像の蛍光タンパク質を保持する方法について説明します。タンパク質は、ナノメートル分解能にPALM顕微鏡を用いた回折限界以下局在していた。特定の標本にこのプロトコルを適応させるために、次のパラメータを考慮する必要があります。フルオロフォア、定量化、および配置。 蛍光タンパク質や有機蛍光色素の選択は、アプリケーションとモデルシステムによって異なります。我々は、EGFP、YFP、シトリン、mEosFP、mEos2、tdEos、mOrange、PA-mCherry、とdendronの複数形12を含む蛍光タンパク質の様々なテストをしている。各蛍光色素からの蛍光の保全は、すべての蛍光タンパク質が記載された方法を用いて保存することができることを示唆して、類似していた。それはCでうまく表現ので、我々はtdEosを選んだelegansは 、タンパク質はtdEosに融合したときに機能的に推移し、そのため光活性化特性は、ヤシの顕微鏡検査に最も適していた。しかし、tdEosの凝集したか失敗した式が、時折12観察されている。 アプリケーションに応じて、異なる蛍光団はより適しているかもしれません。多くの場合、それは光活性化蛍光性タンパク質を使用する必要はありません。単純な相関蛍光電子顕微鏡では、光活性化蛍光タンパク質を必要としません。 GFPまたは有機色素は、回折限界上記のセクションでタグ付けされたタンパク質からの蛍光画像に使用することができます。例えば、人はイメージ、蛍光顕微鏡を用いて神経網の軸索とイメージングによる電子顕微鏡写真で特定の軸索蛍光顕微鏡で蛍光を蛍光シグナルを関連付けることができます。このような誘導放出の枯渇顕微鏡（STED）12、個々の分子リターン（GSDIM）13続いて基底状態の枯渇顕微鏡のような他の超解像技術や、構造化照明顕微鏡（SIM）14は 、光活性化蛍光タンパク質を必要としません。また、有機色素9,15,16または蛍光プローブ17の固有の特性を使用した超解像イメージング技術は、容易に適用可能である。 各分子の蛍光が空間的にも時間的に分離されているので、手のひらに、分子数を定量化することができる。酸化、過少、過大、および過剰発現：しかし、定量化は、4つの理由のために誤解を招く可能性があります。まず、蛍光タンパク質の画分を変性またはサンプル処理5,12間に酸化することができる。蛍光シグナルの約90％が我々のプロトコルでの固定と包埋を通して維持されたが、試料が切削されており、表面が酸素にさらされた後に、蛍光タンパク質の酸化が発生することがあります。第二に、光活性タンパク質の活性化は、確率的であるため、複数の分子ができる所定の回折限界のスポット8で活性化。複数の分子からの蛍光は1スポットとして現れるでしょう、そして、その結果、タンパク質の総数はundercountedされます。第三に、同様の問題は過大につながることができます。手のひらに漂白することにより、それぞれの蛍光タンパク質は、ローカライズされた後、 &quot;消去&quot;。しかし、蛍光タンパク質は18永久に漂白されることなく、暗い状態から戻ることができます。このような分子は、複数回カウントされます。第四に、タグ付けされたタンパク質は、トランスジーンとして表現さ​​れ、しばしば過剰発現につながることができます複数のコピーに存在しています。したがって、Palmから定量化は、与えられた場所での分子の数を推定するが、正確には判断できないために使用することができます。 電子顕微鏡写真とヤシの画像の位置合わせもあるため、電子ビームによる光と電子顕微鏡と歪みで解像度の違いから挑戦することができます。金粒子は、しっかりとlocのサーブ電子顕微鏡写真で基準マーカーを未実現。しかし、金粒子からfluoresecenceは、光活性化ではなく、大規模な回折限界スポットとして表示されます。このように、電子顕微鏡写真上の蛍光画像の配置は推定値です。歪みもプラスチックセクションと電子の相互作用から生じる可能性があります。そのようなGMA等のアクリル系樹脂は、電子ビームの下にあまり安定しており、プラスチック製の寸法を変更することができます。このような状況下では、超微細構造と蛍光を整列する基準マーカーの非線形変換が必要な場合があります。

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬や機器の名称</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>注釈</td></tr><tr><td>高圧冷凍庫</td><td>アブラ州</td><td> HPM 010 </td><td> WohlwendからライカやHPF-01からEMPactとHPM 100を使用することもできます。 </td></tr><tr><td>自動凍結置換ユニット</td><td>ライカ</td><td> AFSの2 </td><td> AFSの1を使用することもできます。 </td></tr><tr><td>ツァイスPALM </td><td>ツァイス</td><td> ELYRA P.1 </td><td>ニコンとVutaraはまた、商業やし顕微鏡を販売しています。 </td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td> FEI </td><td>ノバナノ</td><td>他の高分解能SEM顕微鏡を使用することができます。 </td></tr><tr><td>アセトン</td><td> EMSの</td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td>オスミウムトンetroxide </td><td> EMSの</td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td>過マンガン酸カリウム</td><td> EMSの</td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミンから</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>ポリサイエンス</td><td> 21447から25 </td><td>この会社の酢酸ウラニルのpHがわずかに高くなっています。 </td></tr><tr><td>グリコールメタクリレート（GMA） </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td>低酸、TEM用グレード。 </td></tr><tr><td> N、N-ジメチル-p-トルイジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>ナルゲン</td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td> EMSの</td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> ACLARフィルム</td><td> EMSの</td><td> 50425から10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEMカプセル</td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td>ポリプロピレン</td></tr><tr><td> 3月8日 &quot;DISCパンチ</td><td>テッドペラ</td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td>金ナノ粒子</td><td>ミクロス-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> 2倍濃縮液を要求</td></tr></tbody></table>

ナノfem：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

タンパク質の分布をマッピングすると、細胞内のタンパク質の機能を理解するために不可欠です。蛍光顕微鏡は、広範囲のタンパク質局在するために使われますが、細胞内の文脈はしばしば蛍光画像では欠如しているされています。免疫電子顕微鏡法は、他の一方で、タンパク質をローカライズすることができますが、その方法は互換性のある抗体の不足によって制限され、形態学の貧しい保全とほとんどの抗原は、試料表面に露出されていないため。相関アプローチはどちら免疫蛍光または遺伝的にタグ付けされたタンパク質から、最初の全細胞からの蛍光画像を取得することができます。次に、試料を固定し、埋め込 ​​まれた電子顕微鏡観察のため、画像は1から3まで相関しているされています。しかし、低解像度の蛍光画像と基準マーカの欠如は、タンパク質の正確な局在を排除。 あるいは、蛍光イメージングは​​、プラスチック中の検体を保存した後に行うことができます。でこのアプローチは、ブロックが区分され、蛍光画像と同じ断面の電子顕微鏡写真を4-7相関している。しかし、相関画像の光の回折限界は個々の分子の位置を曖昧にし、蛍光はしばしばセルの境界を越えて延びている。 ナノ分解能蛍光電子顕微鏡（ナノFEM）を撮像することにより、ナノスケールでの光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）と電子顕微鏡を使用して同じ部分をタンパク質をローカライズするために設計されています。 Palmはイメージング個々の蛍光タンパク質による回折限界を克服し、その後、各蛍光スポット8-10の重心をマッピングする。 我々は5つのステップでナノFEM手法を概説しています。まず、試料を固定し、タグ付けされたタンパク質の蛍光を維持する条件を使用して、埋め込まれています。第二に、樹脂ブロックが搭載されている極薄のセグメント（70-80 nm）とに区画されているカバーガラス上に。第三に、蛍光はツァイスPALM顕微鏡を用いて、これらのセクションに結像される。第四に、電子密度の高い構造は、走査型電子顕微鏡を用いて、これらの同じセクションに結像される。第五に、蛍光および電子顕微鏡写真は、基準マーカーとしての金粒子を用いて整列されます。要約すると、蛍光標識タンパク質の細胞内局在は、約1週間でナノメートルの分解能で決定することができる。

我々は、電子顕微鏡写真で蛍光標識タンパク質をローカライズする方法について説明します。蛍光は、第一超薄切片に光活性化ローカライゼーション顕微鏡を使ってローカライズされます。これらの画像は、同じ断面の電子顕微鏡写真に整列されます。

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

タンパク質の分布をマッピングすることは、細胞内におけるタンパク質の機能を理解する上で不可欠です。蛍光顕微鏡法は、...に広く用いられています。

本実験の総合的な目的は、相関蛍光・電子顕微鏡法を用いて、タンパク質の局在化および電子顕微鏡写真の同定を行うことです。ここでは、nano FEMとして知られる手法を用いて、C. elegansにおけるタンパク質の局在化を行います。まず、ヒストンTD-eosを発現する形質転換虫をプラスチックに包埋し、切片を作成します。各切片を、光活性化局在顕微鏡（PALM）と走査電子顕微鏡の両方で撮影します。各切片の2枚の顕微鏡写真を、Photoshopを用いてフィデューシャルマーカーにより位置合わせします。相関画像により、核内におけるヒストン分子の局在が示されます。本日説明する手法の主な利点は、免疫電顕（immuno EM）を使用する代わりに、遺伝子コード化された蛍光タンパク質を用いることで、すべてのタンパク質を蛍光タンパク質と結合させている点にあります。免疫電顕では、多くの抗体がプラスチックと反応できないか、あるいは適合しなかったとしても、抗原が存在する切片の深部まで抗体が浸透できないという問題があります。蛍光タンパク質を用いることで、あらゆるタンパク質に蛍光標識を付加できます。本日は、shige wbiがこの手法を実演します。以下の手順では、蛍光タンパク質TDE osで標識されたヒストンを発現する遺伝子組換え線虫を用いて実演します。このデモンストレーションでは、凍結保護剤として細菌を使用しますが、海辺の優美な生物（sea elegance）を凍結させる場合には、20% BSAを使用することも可能です。凍結置換の1時間前に、自動凍結置換装置またはFSデバイスに液体窒素を満たしてください。また、事前に付属文書の指示に従って必要な固定液を調製し、1 mLずつクライオバイアルに分注して、使用時まで液体窒素中に保存してください。ペイントブラシを使用して、細菌のローンから動物をすくい取り、100 µmの試料キャリアに移して満たします。気泡が入らないように、カップをわずかに溢れるまで満たしてください。準備ができたら、試料カップを高圧凍結機のアーマチュアに設置して凍結させます。その後、すぐに試料を凍結室の隣にある液体窒素バスに移してください。次に、ピンセットと鉗子を用いて、検体を固定液の入ったクライオバイアルに移します。検体が常に液体窒素に浸かっているようにしてください。この操作を各検体について繰り返し、その後、すべてのクライオバイアルをFSユニットに移します。すべてのクライオバイアルをFSユニットに設置したら、プログラムを開始します。凍結および処理プロトコルはこの図に示されています。最初の-90°Cでのインキュベーション中に、ガラス状の氷がアセトン中の固定液に置き換えられます。その後、試料の温度が上昇するにつれて、液体アセトン中の固定液が試料を架橋し、構造を維持します。FSユニットの温度が-60°Cに達したら、20mLの95%アセトンを含むシンチレーションバイアルをFSに入れ、冷却します。次に、温度が-50°Cに達したとき、P 200チップを装着したパスツールピペットを使用して固定液を除去し、各試料に予冷した95%アセトンを約1mL加えます。胆汁。この工程を20分ごとに2時間にわたって繰り返します。また、-50 °Cでのインキュベーション中に、0.1% ウラニル酢酸を 95% アセトンに溶解した溶液を 20 mL 入れたシンチレーションバイアルをフリーズドライ（FS）チャンバーに入れ、-50 °Cまで予冷しておきます。その後、最終のアセトン洗浄が終わったら、各バイアルにウラニル酢酸溶液を約 1 mL 加えてサンプルを染色し、膜のコントラストを向上させます。プログラムを一時停止していた場合は、再開させてください。温度が-40°Cに達したら、95% ethanolを入れたシンチレーションバイアルをFSチャンバー内に設置します。温度が-30°Cに達したら、パステュールピペットを使用して、2時間にわたり20分ごとに尿中酢酸を95% ethanolに置換してください。アセトンが存在すると樹脂が重合しないため、このステップではエタノールを使用することが重要です。プロトコルの次のパートでは、試料を−30 °Cに保った状態でプラスチックに包埋します。FSにおいて、95% ethanolを、あらかじめ冷却した30% glycol methacrylate resin（またはGMA in 95% ethanol）に交換します。3〜5時間後、30% GMAを70% GMAに交換し、4〜6時間後、70% GMAを取り除いて、試料を97% GMAで一晩インキュベートします。GMA濃度を段階的に上昇させることで、培地を組織内部まで浸透させます。GMA樹脂に3%の水を添加しているため、97%GMAは希釈されないことに注意してください。翌日、エタノールを用いて、パスツールピペットでサンプルをAFS内の包埋モールドに移します。サンプルを包埋モールドに配置した後、97%GMAを、-30 °Cで6時間かけて、新しく調製したGMAと3回交換します。3回目の交換後、細菌マトリックスをタップして、検体を凍結保護剤から分離させます。換気バイアル内で、97%GMAに開始剤のnn dimethyl udineを加えます。開始剤の添加量は、GMA 1 mLあたり1.5 µLとします。直ちにGMA溶液を各包埋型に注入し、動物の間隔が均等になるように型の中に配置します。温度が-20°Cまで上昇するようにプログラムを再開します。樹脂は1時間以内に急速に重合しますが、完全に重合させるため、プラスチックを-20°Cで一晩硬化させてください。プラスチックが硬化した後、試料を窒素ガスを満たした真空袋に入れ、-20 °Cで保存します。GMA包埋試料の薄切は、光活性化局在化顕微鏡（PALM）イメージングに関する付随文書に従って行ってください。顕微鏡システムは、EMCCDカメラを-70 °C以下に設定して準備してください。ピペットを使用して、100 nmの金粒子（濃度 1×10¹⁰ particles/mL）溶液を約50 µL、イメージングするサンプルに滴下します。サンプルの上に黒色のカバーケースを置き、カバーガラスの上で溶液を30秒間静置させます。金粒子溶液を除去するために、溶液をカバーガラスの端まで吹き飛ばし、キムワイプで吸収させます。次に、円形カバーガラスホルダーに真空グリースを塗布し、カバーガラスを挿入します。カバーの裏面に浸油を塗布します。サンプル直下にスライドさせます。サンプルホルダーを顕微鏡ステージのスロットに挿入し、しっかりと固定して、切片が対物レンズの真上に来るように中心を調整します。この際、対物レンズに触れないよう十分に注意してください。次に、明視野照明を用い、10倍の対物レンズで切片の位置を確認します。次に、100倍の対物レンズに切り替え、標的に焦点を合わせます。必要に応じて、強度を10%に設定した488 nanometerレーザーを用いて蛍光照明に切り替えます。サンプルの温度が安定するまで5分間待ちます。その後、最も強い蛍光を発している領域を特定し、そこに焦点を合わせます。レーザーを561 nanometersに切り替え、強度を100%まで上げます。背景の自家蛍光を消光させるため、サンプルを約2分間漂白します。漂白中にフォーカスがずれた場合は、5分間経過させてからフォーカスの調整と画像のキャプチャを行ってください。漂白が完了したら、405 nanometerレーザーを起動し、強度を最低に設定します。1秒間に20フレームの速度で画像の収集を開始します。本実験の目的を達成するために十分な数のフレームを収集してください。核内における584個のヒストンタンパク質の局在を決定するために、5,000から6,000フレームを撮影します。5,000フレームの収集が完了すると、イメージングソフトウェアによってすべての分子が識別され、マッピングされます。最終的な蛍光画像、いわゆる「sum turf image」は、カメラで検出されたすべての蛍光を合成したものです。対照的に、「palm image」は各蛍光スポットのOIDをマッピングしたものであり、各タンパク質がどこに位置しているかのみを示します。SEM観察の前に、2.5%酢酸ウラニル水溶液を用いて切片を4分間染色します。ろ過した超純水（milli QE water）で酢酸ウラニルを十分に洗い流します。切片を乾燥させた後、スパッタコーターを用いて、カバーガラスが十分に暗くなるまでカーボンコートを行います。カバーガラスの片端の端と、もう一方の端のメタルスタブにカーボン導電テープを貼り、カバーガラス表面に蓄積する電子を接地させます。カバーガラスをSEMチャンバーにセットし、顕微鏡で試料の位置を確認します。試料の低倍率像を撮影した後、関心領域までズームし、高倍率像を取得します。すべてのセクションの撮影が完了するまで、新しいセクションでこの操作を繰り返します。次に、palm画像とEM画像を位置合わせする必要があります。まず、取得したSEM画像をPhotoshopで開いてください。5,000×5,000ピクセルのサイズで、解像度300pixels per inchの新しいウィンドウを作成します。読み込んだSEM画像を新しいウィンドウにコピーします。「編集」メニューにある「自由変形」コマンドを使用して、画像がウィンドウ全体に収まるように拡大縮小します。次に、高倍率のSEM画像をコピーし、必要に応じてスケール調整と変換を行います。画像のドロップダウンメニューバーから画像の回転を選択し、合算ターフ画像を水平方向に反転させます。合算ターフ画像をコピーして、新しいレイヤーに貼り付けます。編集メニューにある自由変形コマンドを使用して、画像が低倍率の電子顕微鏡写真とほぼ同じサイズになるように拡大・縮小します。次に、金粒子の蛍光がSEMで可視化された対応する構造と一致するように、必要に応じて画像を回転させます。続いて、パーム画像を新しいレイヤーにコピーし、同じ変形を適用して高倍率の画像を抽出します。関心領域をズームし、その領域からパーム画像（palm image）をコピーします。プレゼンテーション用に、この画像をより高解像度のSEM画像に貼り付けます。パーム画像にはグラデーション透過処理を適用し、パームのシグナルではなく、黒い背景のみが透過するようにしてください。変換後のパーム画像を新しいレイヤーにコピーします。「選択」ドロップダウンメニューから「色域」を使用し、背景ではなくパームのシグナルを選択します。次に、参照として背景のピクセルを選択し、「反転」オプションをオンにします。目的の手掌信号を切り取り、新しいレイヤーに貼り付けます。背景レイヤーに透明度を適用し、10%に設定します。これにより、信号の強度を損なうことなく背景を透明にし、手掌信号を可視化することができます。ヒストンタンパク質。His11タグ付きTD eosを線虫C. elegansに安定発現させ、このビデオで説明しているプロトコルに従って形質転換体を処理およびイメージングしました。PALM像と電子顕微鏡像を同一切片から取得しました。蛍光像と電子顕微鏡像の両方に現れる金ナノ粒子を用いて、これら2つの画像を位置合わせしました。ここでは、顕微鏡写真の上端付近の領域を拡大します。ここで見られるように、核などの細胞内詳細が確認できます。核、核孔、および小胞体が観察できます。しかし、タグ付けされたヒストン分子は核にのみ局在しており、核以外には存在しません。期待通り、相関PALM顕微鏡および電子顕微鏡を用いることで、最高解像度でのタンパク質の局在確認が可能になります。この手順の後、タンパク質分布を含むこれらの切片を採取し、アレイ・トモグラフィーを用いてスタックすることで、細胞内のタンパク質分布を示す三次元構造を構築できます。また、四酸化オスミウムは非常に危険な化学物質であるため、使用時は常に手袋を着用してください。

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JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、タンパク質間相互作用を評価するためのBiFC-PALM(光活性化局在顕微鏡と二分子蛍光相補の組み合わせ)について説明しています。BiFCは、2つの蛍光タンパク質フラグメントと2つの相互作用する目的のタンパク質との融合を伴います。2つのタンパク質が相互作用すると、フラグメントが近接し、2つの部分が一緒になって機能的な蛍光タンパク質を再構成できます。単一の蛍光色素の蛍光は、PALMによって細胞内の単一分子レベルで局在します。...

二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。...

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

単一分子追跡と組み合わさ光活性化局在化顕微鏡（PALM）は、生大腸菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用の直接観察及び定量化を可能にする。...

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

シングルフルオロフォアはFIONAを使用して、ナノメートルの精度で定位させることができる。ここでFIONA技術の概要が報告され、そしてどのようにFIONA実験を実施する方法について説明する。...

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。...

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

どのように FRAP など photoactivation のマイクロ ・ photomanipulation...

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる...

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

このプロトコルは、APEX2タグ付けされた膜タンパク質を、最適に保存された細胞超構造内の透過電子顕微鏡法によって局在させることができるクライオAPEX法を記述する。...

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

本プロトコルは、新規自己核生成抑制機構に基づく金ナノ粒子合成技術を用いて細胞内のメタロチオネインタグ付きタンパク質を検出するためのクローン可能な電子顕微鏡標識技術を記載する。...

細胞内EM可視金ナノ粒子の直接合成によるタンパク質局在解析(英語)

学ぶナノFEM法で、写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を組み合わせ、C. elegansの組織タンパク質を核内に高精度で局在化する手法。この相関イメージング技術は、従来の免疫電子顕微鏡の限界を克服し、タンパク質の細胞内分布を詳細に解析できる。

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

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