Name: 人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学ぶ マウスiPSC由来の成体マウス作製法。テトラプロイド胚補完法による完全多能性の検証と、再生医療・発生生物学研究への応用可能性を探索する。

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KKB、MJB、ジーザスライフハウスとKLNへのサポートは、カリフォルニア再生医療研究所、ピュー慈善トラストメディカル奨学金プログラム、エスター·B·オキーフファミリー財団とシャピロファミリー財団によって提供されました。 KKBはドナルドE.とデリアB.バクスター財団学部学者である。

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<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Generation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cell-derived+embryos+and+mice+by+tetraploid-embryo+complementation%22">Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation</a>. , Springer. (2006).</li>
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<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li>
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<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li>
<li>Li, X. -y, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

TECのアッセイを用いて、IPSCラインからマウスを生成すると、IPSCラインの多能性のための厳しい機能テストを提供しています。このテストでは、異なるプログラミング方法の相対的な有効性を評価したり、 試験管内で特定の種類の細胞を生成するための最も有用であろうIPSC行を識別するために、役に立つかもしれません。性IPSCから生成されたマウスは厳しくIPSC由来の組織の長期安定性と発癌性をテストするために使用されるかもしれません。このプロトコルは、完全に多能性IPSC IPSC線やマウスを作製したり、別のプログラミング方法の相対的な効用を比較するために希望する研究者に有用であろう。 完全に多能性IPSCの発生と同定は十分に理解のまま、それがこの方法を用いて製造ラインが一部IPSC TEC試験に合格しない可能性があります制御メカニズム。多くの要因が遺伝的背景、レンチウイルス力価は、レンチウイルスのパターンiを含む実験の間で異なるかもしれませんnsertion、ドナー集団の細胞周期パラメータは、TECの手順の様々なステップと性IPSCの変数性癖で研究室間の違いは遺伝的またはエピジェネティックな異常を抱いています。最高の成功を確実にするために、我々はそれぞれのウイルスが十分に検出可能な遺伝子発現を少なくとも80％との理想的には100％を生産するために集中していることを保証するためにコントロールのMEFのウイルス希釈液をテストすることにより、IPSC導出実験におけるレンチウイルス遺伝子発現の適切な水準を確立するために世話をするMEFに。これは過密井戸なしでのMEFと生産コロニーへの毒性を制限しながら、私たちは異なるレンチウイルスの複数のコピーを持つ行を識別することができます。これは、複数の他のプロトコルが完全多能性への複数のパスが1,8-13,15が存在するかもしれないことを示唆する複数の方法やドナー細胞の光源を使用し、完全発達可能性を秘めた性IPSCを生成することが示されている点に留意する必要がある。しかし現在は、完全に多能性IPSCのない決定的なバイオマーカー識別され、それゆえのTECアッセイはIPSCラインは生物のすべての細胞系譜を生成できるかどうかのゴールドスタンダードテスト残っています。

<table><tbody><tr><td>DMEM (高グルコース)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ES細胞認定FBS</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>胎児牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>シグマ</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>0.1% ゼラチン</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO（マウスLIF）</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>バルプロ酸</td><td>シグマ</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャー</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca（カルシウム添加PBS）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>カルシウム含有PBS&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 無料</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>妊娠馬血清ゴナドトロピン、超排卵用、凍結乾燥、2,000 IU</td><td>ハーバーUCLA研究所</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン</td><td>シグマ</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ含有FHM培地</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>KSOM-1/2 AA培地</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>胚移植用および胚検査用精製水</td><td>シグマ</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>ミネラルオイル（胚試験済み）</td><td>シグマ</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>シグマ</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>シグマ</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>シグマ</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)、胚試験済み</td><td>シグマ</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞、非照射</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;（翻訳対象のソーステキストが提供されていません。翻訳するテキストを入力してください。）&quot;&gt;&lt;強力な&gt;本プロトコールで使用する培地および緩衝液&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;HEK293T増殖培地。DMEM 90%、FBS 10%、ペニシリン 100 U/mlおよびストレプトマイシン 10 mg/ml。トランスフェクション当日に使用するHEK培地からは、ペニシリンとストレプトマイシンを除いてください。HEK培地は4℃で保存可能です。 &amp;deg;最大1ヶ月間、℃で保存する。&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;（ソーステキストが提供されていません。翻訳対象のコンテンツを入力してください。）&quot;&gt;2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ハイパーパラメータ最適化&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 12 mM デキストロース。pHを7.1 ± 0.1に調整する。pHの管理は極めて重要である。滅菌フィルターでろ過し、4℃で保存する。 &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;（ここに翻訳すべきソーステキストを入力してください。ソーステキストが提供されていないため、現在は翻訳可能な状態でお待ちしております。テキストをご提示いただければ、指示に従い、研究者や学生向けに適切で自然な学術的日本語へ翻訳いたします。）&quot;&gt;マウス胚性線維芽細胞（MEF）増殖培地（フィーダー細胞用としても使用可能）。70% DMEM、20% Medium 199、10% FBS、100 U/ml ペニシリンおよび 10 mg/ml ストレプトマイシン。4℃で保存すること。 &amp;deg;最大1か月間、Cで保存する。&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;提供されたソーステキストがありません。翻訳対象となる英語のコンテンツを入力してください。専門的な学術的トーンを用い、研究者や学生向けに正確な日本語に翻訳いたします。&quot;&gt;ESC増殖培地。85% DMEM、15% ES細胞適合FBS、1x Glutamax、0.1 mM 非必須アミノ酸、0.1 mM &amp;#946;-メルカプト&amp;#8211;エタノール、1,000 U/ml ESGRO、100 U/ml ペニシリン、および 10 mg/ml ストレプトマイシン。ESC培地は4℃で保存可能である。 &amp;deg;最大3週間、℃で保存する。&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳対象となるテキストをご提示ください。&quot;&gt;電気融合培地。0.3 M マンニトール、0.1 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 50 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、および胚テスト水に溶解した3% BSA。4℃で保存する。 &amp;deg;最大3か月間、Cで保存する。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

体細胞から誘導多能性幹細胞（性IPSC）の生産は、基礎研究のための貴重なツールを作成する手段を提供し、また、再生治療のために患者をマッチさせた細胞の供給源を生成することがあります。性IPSCは、複数のプロトコルを使用して生成され、複数の細胞供給源に由来してもよい。一度生成された、性IPSCは、多能性マーカーの免疫染色、胚様体や奇形腫、胚性幹細胞（ESC）と生殖細胞系列への寄与2の有無にかかわらず、キメラマウスの作製と遺伝子発現の比較で三胚葉の生成を含む種々のアッセイを用いて試験する。重要なのは、これらのテストに合格IPSC線は依然として異なる分化細胞型2を製造する能力が異なります。これは難しいIPSC導出プロトコル、ドナー細胞ソースや選択方法が異なるアプリケーションのために最も有用である確立してきました。 最も厳しいテスト幹細胞株は、生物の生存に必要なすべての組織を生成するための十分な発生能を有するかどうかの（と呼ばれる完全な多能性）四倍体胚補完（TEC）3-5です。技術的には、TECは胚盤胞期6〜in vitroで培養することができる四倍体（4N）1細胞期胚を生成するには2つの細胞期胚の電気融合を伴います。二倍体（2n）の多能性幹細胞（ 例えば ESCはまたは性IPSC）を四倍胚盤胞の胞胚腔に注入します（ 図1を参照）妊娠のためのレシピエント雌に転送されます。二倍体細胞が注入された幹細胞株から完全に由来する胎児で、その結果、胚は適切な構成に対し、補完胚の四倍体成分は、胚体外組織（胎盤、卵黄嚢）にほぼ独占的に貢献しています。 最近、我々は再現性成体マウスを生成IPSC線の導出を報告テック1を介して。これらIPSC行はESCは3,4,7に匹敵すると、他のほとんどのIPSCライン8月12日のために報告されたものよりも高くなって、5から13パーセントの効率で実行可能な子犬を生じさせる。これらのレポートは、直接リプログラミングはTECテストで子犬を生成するの彼らの発達の可能性と効率性にESCを完全に一致させる多能性IPSCを作り出すことができることを示している。現時点では、それは完全に多能性IPSCの少ない強力なライン13から15の間で区別するものは明確ではありません。また、それは方法が最も効率的にこれらの行が生成されるリプログラミングは明らかである。ここでは、IPSC線の多能性を比較したり、別のプログラミング方法の同等性を確立しようとする研究者のために役立っているかもしれません完全に人工多能性IPSCと &quot;all-IPSC&quot;マウスを生成し、一つの方法を説明します。

ステップ3「MEFからのiPSC誘導」では、ドキシサイクリン/VPA添加から4〜5日後に形態的な不均一性と未熟なiPSCコロニーの形成が観察され、7〜10日後には成熟したコロニーが観察されるはずです（図2）。ステップ5における1細胞四倍体胚の作製は非常に効率的です（図3）。通常、処理した2細胞胚の最大95%が正常に融合し、四倍体1細胞胚が作製されることが観察されます。四倍体胚盤胞へのiPSC注入（ステップ6、図4）の手順は、キメラマウスを作製するための二倍体胚盤胞へのESC注入プロトコルと同様であり、経験豊富なマイクロインジェクション技術者によって実施可能です。誕生する生存仔マウスの数は、細胞株によって異なります（表1）。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">MEFのプレプログラミング効率 0.01-0.03%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">TECによるiPSCマウス作製効率</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>名前</td>
			<td>概要</td>
			<td>注入された胚盤胞</td>
			<td>生後間もない新生児</td>
			<td>成体生体</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>人工多能性幹細胞</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6.1%)</td>
			<td>19 (2.2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC（人工多能性幹細胞）</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3.6%)</td>
			<td>4 (2.1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>人工多能性幹細胞</td>
			<td>338</td>
			<td>1(0.3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1. 代表的な結果
<img alt="4倍体胚盤胞相補性の模式図；2倍体E13胚からのiPSCマウスの作製" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図1"> 
図1. 実験デザインの概略図。左上：4倍体胚盤胞の作製。アルビノマウス由来の受精2細胞胚を電気融合させて4倍体1細胞胚を作製し、これをin vitroで胚盤胞まで培養する。左下：リプログラミング。マウス胚性線維芽細胞に、Oct4、Sox2、Klf4、c-Mycおよび逆テトラサイクリン制御活性化タンパク質（rtTAM2.2）をコードするレンチウイルス粒子を導入する。ドキシサイクリンを添加することで導入遺伝子が発現し、iPSCへのリプログラミングが開始される。右：iPSCマウスの作製。有色マウス由来のiPSCを4倍体胚盤胞の胚盤腔内に注入し、擬妊娠状態のレシピエントマウスの子宮内に外科的に移植する。出生したiPSCマウスは帝王切開により取り出され、代育に付される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> ここをクリックして拡大図を表示</a>。
<img alt="細胞リプログラミング過程；顕微鏡画像；MEFからiPSCへの転換（10倍、20倍の倍率）。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2"> 
図 2. リプログラミングに伴う形態的変化。左から右へ：リプログラミング実験の過程における、線維芽細胞からiPSCコロニーへの形態的進展の例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> ここをクリックして拡大図を表示</a>。
<img alt="胚発生段階：2細胞期（2n）、割球融合、1細胞期（4n）；顕微鏡画像。" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図3"> 
図3. 四倍体胚の作製。二倍体の2細胞期胚に電気パルスを印加し、割球を融合させることで1細胞の四倍体胚を生成させる。
<img alt="胚盤胞へのiPSC注入、およびその結果として誕生したiPSC新生マウスおよび生後3週齢マウス、細胞研究の結果。" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図4"> 
図4. iPSCマウスの作製。左：4倍体胚盤胞の胚盤胞腔にiPSCを注入する。中央：新生iPSCマウスは、色素沈着した眼によって区別される。右：出生後3週目のiPSCマウス。

彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞（IPSC）ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する<sup&gt; 1</sup&gt;。

体細胞からの人工多能性幹細胞（iPSC）の作製は、基礎研究のための有用なツールを創出する手段となり、また……

この手順の全体的な目的は、四倍体胚補完法により、誘導多能性幹細胞（iPSC）から成体マウスを作製することです。これはまず、OCT4、SOX2、KLF4およびc-Mycを搭載したレンチウイルスを用い、さらに培地にバルプロ酸（VPA）を添加することで、マウス胚性線維芽細胞からiPSCを誘導することによって達成されます。iPSCが樹立された後、免疫染色、染色体数計測、および胚体形成によってその特性評価を行います。次のステップでは、融合および体外培養を通じて、レシピエントとなる4倍体胚盤胞を調製します。その後、iPSCを4倍体胚盤胞に注入し、補完された胚盤胞をレシピエント雌に移植して妊娠させます。最終ステップとして、正期産の動物を帝王切開で取り出し、代理母に移植します。これにより、生後発達をモニターすることが可能になります。最終的に、生存可能な正期産の動物が産生されるかを確認します。このアッセイで用いたiPS細胞株は、完全な多能性を有していると考えられます。iPS細胞を作製する他の手法と比較した本手法の主な利点は、完全な多能性を持つiPS細胞株を再現性高く作製できることです。本手法により作製されたiPS細胞株は、自らのiPS細胞の多能性を比較したい、あるいは他のリプログラミング手法との同等性を確立したいと考えている他の研究者にとって有用である可能性があります。また、これらの手法は、in vitro分化アッセイなどの特定のダウンストリームアプリケーションのために、完全な多能性を持つiPS細胞株を作製したい研究者にとって有用です。さらに、すべてのiPSCマウスを作製します。テロメア相補（telo complementation）を用いることは、さまざまな細胞株の遺伝的およびエピジェネティックな安定性を決定するための有用な手段となり得ます。四倍体胚相補に伴うマイクロマニピュレーションは、技術的に困難です。iPS細胞の作製技術に習熟するまでには、数ヶ月かかる場合があります。この手法では、従来のES細胞の遺伝子ターゲティング実験で使用されるものと同様の培養条件が必要です。HEK 293T細胞にレンチウイルスを導入して24時間後、増殖培地を除去し、25 mLの温めた新鮮な培地と交換します。形質導入した細胞をインキュベーターに戻し、24時間培養します。HEK 293T細胞にレンチウイルスを形質導入してから48時間後、形質導入細胞からレンチウイルス粒子を含む増殖培地を回収します。4°Cで3000 Gsにて5分間遠心分離し、ウイルス含有培地から粒子状のデブリを除去します。次に、4°Cで112,000 Gsにて2時間、20% sucroseクッションを用いて超遠心分離し、ウイルスを濃縮します。ウイルスペレットを乱さないように注意して、上清を滅菌処理用の廃棄容器にデカンテーションします。ウイルスペレットを0.4 millilitersのマウス胚性線維芽細胞培地で再懸濁し、チューブを封印します。次に、4 °Cで15〜30分間、緩やかにロッキングします。ウイルス粒子と使い切り用分注検体を-80°Cで保存します。iPSCラインは、マウス胚性線維芽細胞またはMeth細胞から誘導されます。iPSCコロニーが明るい屈折率を持つ明確な境界を備え、30〜50個の細胞を含んでいる状態になれば、手動でピックアップし、独立したiPSCラインとして拡大培養する準備が整ったことになります。ゲルローディングピペットチップを用いてシングルコロニーをピックアップし、0.25% trypsin EDTAを20 µL含むU底96ウェルプレートの各ウェルに直接移します。ピックアップしたコロニーとtrypsinを37 °Cで約8分間、あるいはコロニーが単一細胞に解離するまでインキュベートします。解離の進行状況を光学顕微鏡で観察してください。必要に応じて、穏やかな振盪を行ってください。解離させた細胞懸濁液を、フィーダー層およびドキシサイクリンとVPAを添加した150 microlitersのESC培地を含む96ウェルプレートに移します。各ウェルにiPSCコロニーが再出現したら、標準的なESC誘導および細胞培養手順を用いて、より大きなウェルに分割して解析および細胞バンク化を行い、4倍体胚盤胞補助細胞（tetraploid blast assist）の作製手順を開始します。雌マウスから採取した1細胞期胚を、37 °C、5% carbon dioxideの条件下でKSOMを用いて一晩培養し、2細胞期胚まで成長させます。翌日、10 centimeterペトリ皿にBTXマイクロスライドを配置します。スライドが溶液に浸かる十分な量の室温の電気融合培地を注ぎますが、電極の極が完全に浸からないようにしてください。BTX electro cell manipulator ECM 2001とBTX enhancer 400の電源を入れます。ECMのケーブルをマイクロスライドの電極に接続し、スライドが不意に動かないよう、ケーブルをペトリ皿の側面に固定します。BTXエンハンサーで1回の手動パルスを実行して数値を読み取り、印加されているDC電流の電圧を記録します。AC電流は電極間での胚の整列速度を制御します。DC電流は胚を融合させ、パルス時間はDCパルスの長さを設定します。推奨される開始条件は、AC 3 V、DC 100 V、時間は 0.05 ms です。最適な DC は 90 から 150 V の範囲で変動します。マウスピペットを使用してください。KSOM培地で培養した細胞胚を30〜42個取り出し、電極融合用培地のドロップに転移させます。電極融合用培地のドロップを数回用いて洗浄します。次に、マイクロスライドディッシュから新鮮な電極融合用培地をマウスピペットで吸い取ります。洗浄した胚を取り出し、マイクロスライド上の電極間の1 mmの隙間に配置します。胚が隙間の中央に並び、互いに接触していないように注意してください。手動スタートボタンを押して、交流電流を印加します。胚は、接合面が電極と平行になるまでAC電場内で回転します。数秒経っても胚が整列しない場合は、AC設定値を上げてください。胚が整列した後、再び手動スタートボタンを押し、ピペット内に電融合用培地が入った状態でDCパルスを印加します。マイクロスライドから胚を回収し、数滴のKSOM培地で洗浄した後、37°C、5% 二酸化炭素条件下で、ミネラルオイルを用いたKSOM培地にて胚を培養します。胞胚腔融合は30分以内に完了させる必要があります。培養中、胞胚腔が正常に融合した胚をモニタリングし、選択します。融合胚は1細胞期にあるように見えます。培養30分後、溶解した胚および2細胞胚を廃棄し、融合胚をミネラルオイル下のKSOMマイクロドロップ中で37 °C、5% carbon dioxideの条件下で培養し続けます。胚盤胞への注入に向けてiPSCsを準備するため、あらかじめ保存していたiPSCsを融解し、ESC培地を用いてフィーダー層上に播種します。注入に使用する前に、フィーダー層上で少なくとも1回継代してください。70から80%までコンフルエントに達したIPCを含む6ウェルプレートの1ウェルから、注入に十分以上の細胞数を得ることができます。成長培地を吸引し、カルシウムおよびマグネシウム不含のPBS 3 mLで細胞を洗浄します。あらかじめ加温した0.05%トリプシンEDTA 0.5 mLを細胞に加え、37°Cで10分間、時々プレートを揺らしながらインキュベートします。ESC培地3.0 mLを加え、単一細胞懸濁液が得られるまでこの操作を繰り返します。光学顕微鏡で細胞を観察し、単一細胞懸濁液になっていることを確認してください。コロニーや細胞凝集体が存在すると、注入ピペットが詰まります。単一細胞懸濁液が得られたら、ウェルにESC培地1 mLを加え、プレートを37°Cのインキュベーターに戻します。約15分間、または大部分のフィーダー細胞が付着し始めるまでインキュベートし、IPCsを含む培地を静かに除去します。この際、弱く付着しているフィーダー細胞を剥がさないように注意してください。IPCsを5 mLのESC培地を含む15 mLコニカルチューブに移し、200 Gsで5分間遠心分離します。上清を吸引し、マイクロピペットを用いて残りのESC培地を除去します。チューブをタッピングしてペレットを剥がし、あらかじめ冷却した0.2から0.5 millilitersのFHM培地で細胞を穏やかに再懸濁します。細胞は、4倍数体胚盤胞への注入まで、および注入の間、氷上で保存してください。胚盤胞への注入プロトコルについては、本記事に付随する原稿および以前に公開されたJoVE記事（その抜粋をここに表示しています）をご参照ください。リプログラミング実験の過程における、線維芽細胞からiPSCコロニーへの形態学的進行の例をこれらの画像に示します。パネルBからEESCに示されているように、ドキシサイクリンおよびVPA添加後4〜5日から、形態的な不均一性と部分的にリプログラミングされたiPSCコロニーの形成が観察されるはずです。パネルFに示されているように、iPSC様のコロニーは7〜10日の間に現れます。二倍体2細胞期胚の電気融合による1細胞期のテロ胚の作製は非常に効率的です。処理した2細胞期胚の最大95%が正常に融合し、4倍体1細胞期胚が形成されるのが一般的です。本実験で4倍体胚盤胞アシストにiPS細胞を注入するために用いたプロトコルは、キメラマウスを作製するための2倍体胚盤胞アシストへのESC注入プロトコルと同様であり、これにより2倍体キメラの生成を容易に排除できます。iPS細胞および4倍体胚の作製に使用するマウス系統の毛色は、可能な限り慎重に選択されます。この例では、4倍体胚をアルビノ系統から作製し、iPS細胞を有色系統から作製しています。したがって、新生iPSCマウスは色素のある目と、成体において均一な色素を持つ被毛を示しますが、二倍体のkyrasマウスはアルビノと色素のある個体が混在した色調を示します。誕生する生存仔マウスの数は、この表に示すように細胞株によって異なります。平均的な良好なiPSC株の場合、注入した胚盤胞の1%から10%が生存仔マウスとして誕生することが期待されます。このビデオを視聴することで、完全な多能性を有するiPS細胞の誘導方法と、その分化能を検証する方法について十分に理解できるはずです。MESの誘導からiPSC由来の新生仔マウスの誕生まで、四倍体補完アッセイの手法を習得すれば、2〜3か月で完了させることができます。iPS細胞の作製と維持には、高度な細胞培養技術が必要です。ESL培養の経験が不可欠です。レンチウイルスの取り扱い、特に濃縮レンチウイルスは極めて危険であることに留意してください。常に所属機関で規定されている個人用保護具を着用し、本手順に従い、ウイルスに接触したすべての物品を10%bleachで少なくとも20分間処理してください。すべてのiPS細胞マウスおよびその組織を用いて、生理学的、病理学的、および行動学的表現型の解析を行うことができます。

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生物学

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人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

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