Name: 乳腺炎のモデルマウスとしてのLPS管内注入：シグナリングは、NF-κBレポータートランスジェニックを介して可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶLPS管内注入法によるマウス乳腺炎モデルの構築とNF-κBシグナリングの可視化手法。バイオルミネセンスイメージングを用いて炎症応答を定量化し、乳腺組織の炎症メカニズムを正確に解析する技術を習得できます。

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この作品は、F共に葬り去ると退役軍人局（TSブラックウェル）に授与NIHの助成金CA113734によって賄われていた。

全ての動物実験は、バンダービルト大学機関動物実験委員会によって承認された。 1。トランスジェニックマウスを準備<ol><li> NGL（N F-κBG FP-L uciferase）レポーター遺伝子（以前に1に記載）陽性雌マウスは、この手順のために使用されます。女性は年齢の少なくとも6週間である場合、FVB野生型の雄でそれらを交配。繁殖は（1男性とケージ内の最大4匹）に使用されるかもしれませんハーレム。 （ご注意：FVB株マウスは現在の研究のために使用されたようなC57BL6と暗く系統マウスを用いてもよいが、これらのマウスは、前イメージングに剃らなければなりません。） </li><li> 15日後に交配から始まり、妊娠の兆候（大突出胴回り）を定期的にメスを確認してください。それぞれの女性は一度妊娠区切らなければなりませんし、最後の女性が妊娠したらオスは繁殖ケージから取り外す。 </li><li>分離された女性を見守るDごみが表示される誕生日をメモしておきます。少なくとも6仔のごみは、適切な授乳のために必要です。ごみの誕生8日後には、プロトコル（タイムラインの概略図は図1を参照）に進みます。 </li></ol> 2。注射用製剤<ol><li> 大腸菌を溶解0.1μg/μLのの最終濃度にPBS中大腸菌 LPS。この溶液に、または5μgの合計50μlを、乳腺に注入される。制御インジェクションに使用するPBS単独の第二の管を準備します。 </li><li>解剖の範囲及びイソフルラン麻酔機器をセットアップします。ノーズコーン装置は、マウスが置かれる解剖スコープのステージに固定する必要があります。良い光源は、スコープ自体から、または余分なスポットライトからかどうかも準備する必要があります。 </li><li>セットアップが完了すると、イソフルランマシンと空気の流れを開始する。 </li></ol> 3。 LPSの管内注射<ol><li> LPS溶液50μlと短い針の注射器をロードします。さておき、これを設定してください。 </li><li>呼吸が遅くれた後に、マウスが最初にイソフルラン埋めボックスに女性を配置することによって、注入する麻酔と、ステージ上に彼女を移動させ、ノーズコーン内に彼女の鼻を配置します。マウスは完全に麻酔であることを確認するつま先のピンチを使用しています。手順全体を通してマウスの呼吸を監視し、それに応じてイソフルランレベルを調整します。ダムは手続き後に返されるようになるまで女性をから取られていることを子犬のくずを含むケージは慎重に取っておくべきである。 </li><li>コー​​トは平らにすると、マウスの下腹部の上で右第4鼠径乳腺に添付ニップルを視覚化するために70％エタノールの小滴を使用しています。 </li><li>ニップルの最適なビューのための解剖スコープを当てる。慎重にさらに皮膚から離れて乳首を引き出すために細かい鉗子のセットを使用しますが、どのような方法でニップルを穴をあけたり、けがをしないでください。ザ鉗子はしっかり組織を操作するときに一緒にクランプされていませんが、乳首へのストレスを最小量を必要とする光ホールドと一緒に使用すべきではない。 </li><li>穏やかな場所に乳首を保持するために左手に鉗子を使用しています。徐々に右手を使用して、ビューのフィールドにプリロード注射器を持って来る。シリンジがないポジショニングが内容を注入するために発生することがありませんように保持されるべきである。 </li><li>シリンジがビューに追加されると、乳首の中心内小腺管開口部を慎重に目指し、注射器を挿入します。 </li><li>手の位置を変えずに、注射器の内容物を注入し、乳首から針を外します。 </li><li>対照注射用をPBS50μlの2番目の注射器をロードします。ステージ上で、マウスの下腹部の反対側の左第4鼠径部乳腺乳頭の最高の眺めのためのマウスの位置を変更します。 PBS-充填した注射器を使って手順3.4から3.7を繰り返します。 </li><li>両方の注射はCOMPLになったら、ETE麻酔を中止し、回復ケージにマウスを移動します。彼女は5分以内に携帯になることを保証するために女性を監視します。マウスは1時間回復ケージのままにします。回復の1時間後、仔の彼女のごみとケージに雌の背面に配置します。マウスは、定期的に画像に進む前に、6時間後に注射を監視する必要があります。我々の経験では、有害な結果は、注射とイメージングの間の期間に女性または子犬のいずれかで認められなかった。苦痛の兆候が（かむや注射部位、一般的な無気力の警護、 例えば猫背の姿勢）または仔（動かない、皮膚の青みがかった色）の雌で認められた場合しかし、実験は中止すべきである。 </li></ol> 4。 NF-κBの活性を可視化するための生物発光イメージング<ol><li>一度マウスを画像化施設に輸送されており、ソフトウェアを起動し、マシンを初期化することにより、撮影手順を開始します。でオンにしますofluraneマシンと空気の流れ、麻酔ボックスとイメージング室の両方に流れていることを確実にする。 </li><li>明確な麻酔ボックスにイソフルラン麻酔下でマウスを置きます。呼吸が鈍化していると、マウスが完全に麻酔であることを確認するつま先のピンチを使用しています。その後、無菌の注射器を用いて眼窩注射5でマウスにルシフェリン基質100μlを注入します。 </li><li>直ちにイメージング室にマウスを移すと、そこにあるイソフルランノーズコーンの下で彼女の鼻を配置します。マウスは仰臥位でなければならない。テープでステージにそれぞれの足を固定します。 </li><li> IVISソフトウェアへの入力が適切な設定を白色光写真画像と生物活動のイメージの両方を取る。露光時間は10秒である必要があります。画像を取得する。 </li><li>一度画像が取得された、マウスが回復することを可能にしてから、彼女の子犬とケージに彼女の背中を配置し、定期的に監視します。 </li><li>写真および発光画像を自動的に重ね合わせて図2のように、画面に表示されます。マウスの下腹部の両側（PBS注入腺上の1とLPS注入腺上の1）の上に関心領域または等しいサイズの &quot;ROI&quot;の円を配置することによって取得された画像を分析します。光子に読み出し設定します。数（ 図2Bを参照）、各ROI内で検出された発光を示すメッセージが表示されるべきである。統計分析で、この番号を使用します。 </li><li>最適な画像を表示するには、さらに表示された信号のしきい値を調整します。これは、総発光を読み取るアウト改変することはありませんが、あなたがバックグラウンド信号を除去し、制御およびLPS処理腺の違いを視覚化することができます。 PBSを注入腺がバックグラウンド信号から外れるまでに示す発光量を減らします。これは、 図2に示すように画像でまだ見かけLPS処理腺における増加した信号を残す必要があります。 </li><li> Additionaタンパク質およびRNAアッセイを含むリットル分析は、6事後女性から採取した乳腺組織で完了することができる。 </li></ol> 5。代表的な結果これらのメソッドから解釈可能な結果を​​得るために、LPSは（またはPBS）隣接組織はそのままにしておいて、唯一の乳管に注入しなけ​​ればなりません。乳首を囲む皮下組織に注射ではなくシミュレー感染より傷害に起因する炎症になります。技術を学習するときにPBSで希釈し、トリパンブルー色素の注入に便利です。 図3Aは、PBS中でトリパンブルー液100μlを注入に成功注入腺を示しています。示されているように、唯一の管木が注入された溶液で満たされるべきであり、注射部位全くボーラスがあってはならない。この文脈での &quot;ボーラス&quot;は乳首で乳管またはツリーに注入することなく、乳首の周りの組織で注入された液体の蓄積である。これはshです図3Bの独自の。 図3に示すように練習注射は授乳21日目に女性に完成しましたのでご了承ください。授乳の高さ（一日8月10日、LPSは現在のプロトコルを使用して注入された段階）の間に、牛乳は豊富であり、それはダクトを視覚化し、注射が正しく完了したかどうかを判断することは困難である。そのため、授乳の後の時間のポイント、練習注入に優れています。 内乳管の結果へのLPSの成功注入は腺内のNF-κBの活性を増加させた。これは、IVISイメージング時のレポーターマウスで明らかにする必要があり、LPSを注入腺は（平均して、 図2に示すように、PBSを注射した腺よりも実質的に高いルシフェラーゼ活性を（光子計数により測定）を有するべきであると、LPS腺を読み取りPBSの制御信号の200％）。 compとしてLPS処理腺内の発光の統計的に有意な増加反対側の制御にaredは4匹の4群の完成にもかかわらず達成された。つの追加の研究は 、Eのいずれかの管内乳腺注射を利用しているNF-κBレポーター遺伝子組み換えに大腸菌またはLPS。私たち自身の仕事と同様に、これらの著者は、6時間後に、E.レポーター活性の有意な増加が見られました大腸菌注入2。 撮像されたときに脳や他の腹部臓器内での恒常的NF-κB活性のために、注意してください、私たちのレポーターマウスの頭部と腹部は一貫して前の任意の操作にさえ、ベースライン時、信号を示しています。したがって、この信号は、この実験に関して無視されるべきである。明らかな信号は、画像の読み出しをPBS腺でバックグラウンド発光を最小限に抑えるように調整された後、LPS注入乳腺内にとどまるべきである。 図2は、バックグラウンドが低減した画像を示しています。 腺の失敗の注入は意志乳首への損傷が起こる可能性が最も高い。これは、撮像時は明らかであろう指摘し、皮膚レベルの炎症の原因となります。負傷信号のこのタイプは、ダクトに成功したLPS注射後に見られるように、腺を通して発散しない、非常に強く、被害が発生した乳頭部に限定されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> 図1。手順の概略。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> 図2。 IVIS生物発光イメージングからの代表的な結果。（）バックグラウンドで画像を取得したがLPSを注射した腺の増加ルシフェラーゼ活性を明らかに減少させた。 （B）からのイメージ関心数量化の領域が追加された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alトン= &quot;図3は&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; 図3練習注入：。乳腺は乳管内注射を介して色素を注入したニップルを介した配信の精度をテストするには、授乳21日目のマウスは、PBSで希釈したトリパンブルー色素の100μlを注入した。犠牲に続いて、腺は可視化のために露出した。 （A）が成功した噴射と乳首の色素（B）のボーラス。

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<li>Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetically+altered+mice+to+investigate+the+role+of+nuclear+factor-kappa+B+activation+and+cytokine+gene+expression+in+sepsis-induced+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS.</a> Chest. 116, 73S-74S (1999).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここでは、トランスジェニック、NF-κBレポーターマウスとモデル乳腺炎に最適化された注入技術を利用し、乳房組織の炎症は、最も一般的に細菌感染によって引き起こされる。この手順の中で最も重要なステップは、管内注射そのものです。 実際には、膵管内注入が成功したかどうか通常は明らかである。薬剤の注入（LPSまたはPBS）は、流体に感じるはずと注射器が空になると抵抗なしにはほとんどあるはずです。最も一般的な落とし穴は腺に閉塞通路につながる乳頭へのダメージです。これは解剖スコープを通して乳首を見ることで、可視化することができる。ダメージは十分な練習、珍味乳首を操作し、針（31G以上）の唯一の最小の手順を実行するのに使用されていることを確認することですることで回避できます。さらに、それは半ば注射、ビルド·スリップした場合、針の位置が正しくない場合、またはLPSまたはPBSのアップは、注射部位に形成することができ、液体は、ダクトに浸透しません。この問題が発生した場合は、どちらか視覚的に乳首の周りの皮膚内の液体の蓄積を見たり、注射は、流体を感じることはありません。この落とし穴は完全に排除することはで...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 大腸菌由来のリポ多糖 （LPS） </td><td>シグマ</td><td> L 2880 </td><td> 055血清型：B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>メディアテック株式会社</td><td> 46から013-CM </td><td></td></tr><tr><td> 31ゲージインスリン注射器</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 328438 </td><td>短い針</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ワールド·精密機器</td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td>解剖スコープ</td><td>ライカ</td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td>テレルイソフルラン、USP </td><td> RxのエリートのためにMINRAD INC。 </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200イメージングシステム&lt;/ TD&gt; <td>キャリパー（旧Xenogen） </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td>ルシフェリン注射用シリンジ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-ルシフェリンホタル、ナトリウム塩一水和物 （ルシフェリン基質） </td><td> Biosynth化学と生物学</td><td> L-8240 </td><td> 10 mg / mlに希釈し</td></tr></tbody></table>

乳腺炎のモデルマウスとしてのlps管内注入：シグナリングは、nf-κbレポータートランスジェニックを介して可視化

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

前臨床モデルでは介入をテストするようなヒト疾患の動物モデルは、究極的には厳密に病気の進行と関連機構のステージを勉強するために必要である、と。これらの方法では、リポ多糖が（LPS）は腺の乳頭、効果的にモデリング乳腺炎、または炎症を介して授乳マウス乳腺に注入する手法を説明します。増加核因子κB（NF-κB）シグナル伝達において、このシミュレートされた感染症の結果は、NF-κBルシフェラーゼレポーターマウス1の生物発光イメージングを通して可視化した。 これらの方法を開発する上で私たちの究極の目標は、しばしば赤みを含む乳腺における乳腺炎、腫れ、免疫細胞浸潤2,3に関連する炎症を勉強することでした。そこで我々は、LPSを切開または皮膚損傷の任意のタイプ、ニップル、またはグランドを導入するために、と痛感でしたでしたアプローチは、おそらく炎症の読み出しを混同するから我々の方法で利用することはありません。我々はまた、特別に作られた手描きのピペットまたは代わりにこれらの特殊なツールを保持するために、マイクロマニピュレーターを使用する必要はありませんでしたストレートフォワード方式を希望する。従って、我々は市販のインスリン注射器を使用するとそのまま乳首の乳管に薬剤を注入することを決定した。この方法は成功したと私たちは注射のプロセスによってオーバーレイの追加効果なしLPS注射に関連する炎症を勉強することができました。さらに、この方法はまた、視覚的かつ定量的NF-κB活性は、LPSを注射した腺4内シグナル伝達の増加表示し、NF-κBルシフェラーゼレポータートランスジェニックマウスおよび生物発光イメージング技術を利用した。 これらの方法は、最終的に、授乳中の乳腺内の疾患をモデル化したい多くの分野の研究者が関心を持つ技術であるここで説明する多くの物質を注入するために利用することができ、LPSのみに限定されない。

ここで説明する乳腺炎をシミュレートするために、ニップルを介して、授乳中のマウス乳腺に注入されるリポ多糖体で技術は、一般的に細菌感染によって引き起こされる症状である。増加した核因子κB（NF-κB）シグナル伝達におけるリポ多糖注射の結果は、NF-κBルシフェラーゼレポーターマウスの生物発光イメージングを通して可視化した。

乳腺炎のモデルマウスとしてのLPS管内注入：シグナリングは、NF-κBレポータートランスジェニックを介して可視化

疾患の進行段階および関連するメカニズムを厳密に研究し、最終的には……するために、ヒト疾患の動物モデルが必要となります。

この手順の全体的な目的は、乳腺炎（乳腺の炎症）について研究することであり、より具体的には、炎症を起こした授乳中の乳腺内におけるNF-κB活性を可視化および定量化することです。これは、まずNF-κBレポーター導入トランスジェニック雌マウスと野生型雄マウスを交配させることで達成されます。産仔の誕生から8日後、導入注射法を用いて、授乳中の雌マウスの乳腺にリポポリサッカライドを導入します。この手法により、注射部位にすべての損傷や創傷を与えることなく、注射の6時間後に評価を行うことが可能です。乳腺内のルシフェラーゼ活性を検出するために、マウスの生物発光イメージングを行います。最終的に、管内注入法を用いてLPS処理を行い、続いて生物発光イメージングを行うことで、LPS処理した乳腺における顕著なNF KB活性を示すことができます。他の管内注入法と比較した本手法の主な利点は、注入部位に一切の損傷を与えないことです。LPS注入に伴う炎症を研究する場合、部位や乳頭へのいかなる損傷も解析に重複し、結果を混乱させる可能性があるため、ここは極めて重要です。この手順では、NGLリポーター導入遺伝子陽性の雌マウスを使用します。1. 雌マウスの週齢は6週齢以上であること。交配後15日目に、FVB野生型オスと交配させ、繁殖させます。メスに妊娠の兆候（具体的には腹部の著しい膨隆）が見られないか定期的に確認し始めてください。妊娠したメスは個別のケージに分け、最後のメスが妊娠した時点で、繁殖ケージからオスを取り出します。適切な乳管分泌を維持するためには、少なくとも6匹以上の仔マウスを含む1腹の子孫が必要です。そのような腹の出生から8日後に、プロトコルを進めてください。この手順で最も困難なのは、導入注射そのものです。手の震えを抑え、十分な練習を積むことが役立ちますが、常に予期せぬ問題が発生する可能性があります。確実に成功させるために、注射当日は複数のマウスを準備しておくようにしてください。まず、E. coli由来のリポ多糖（LPS）をPBSで希釈し、最終濃度を0.1 µg/µLにします。このLPS溶液50 µLを乳腺に注入します。対照群への注入に使用するため、PBSのみを入れた2本目のチューブを用意します。解剖顕微鏡のステージの隣に、麻酔を投与するためのノーズコーン装置を固定します。必要に応じて追加のスポットライトを使用し、ステージを十分に照らします。解剖の準備が整ったら、isof fluorine装置とエアフローを作動させます。次に、31ゲージのインスリン用注射器にLPS溶液を50 µL充填し、練習用として脇に置いておきます。結果を可視化するために、PBSで希釈したtriam blue染料を使用してください。次に、呼吸が緩やかになったら、注入するマウスを麻酔します。マウスをステージ上に置き、ノーズコーンを介してイソフルランを投与します。処置全体を通じて完全に麻酔されていることを確認するため、つまみ法（ピンチテスト）を用いて確認してください。マウスの呼吸パターンをモニターします。安定した状態を維持するように、イソフルランを絶えず調整してください。70% ethanolを少量滴下して動物の腹面の被毛を寝かせ、乳頭の位置を確認します。非利き手の精密ピンセットを用いて、下腹部にある右第4鼠径乳腺の乳頭を確認します。乳頭を皮膚から慎重に引き出します。この際、ピンセットを強く締め付けないようにしてください。利き手で乳頭を軽く固定します。あらかじめ充填したシリンジを視野に入れ、中身を注入する際に位置調整が不要な状態で保持します。乳頭中央にある小さな乳管開口部に向けて、慎重に針を向けます。針の約4分の1を、位置を変えずに乳管に挿入します。シリンジの内容物を3〜5秒かけて注入してください。その後、乳頭から慎重に針を抜きます。2本目のシリンジにPBSを50 µL充填し、左側の鼠径乳腺乳頭（4番）にPBSコントロールを用いて同様の手順を繰り返します。両方の注射が完了したら、麻酔を中止し、マウスを回復ケージに移動させます。雌マウスは5分以内に動き出すはずです。1時間後、パフ（巣材）を入れたホームケージに戻します。マウスのイメージングは、注射の6時間後に行います。その間、マウスに苦痛の兆候が見られないか監視してください。兆候が観察された場合は、実験を中止し、イメージング施設にてマウスを安楽死させてください。イソフルランを用いてメスを麻酔する準備をしてください。麻酔ガスがボックスとイメージングチャンバーの両方に流れていることを確認します。マウスをイソフルラン麻酔下で透明な麻酔ボックスに入れます。呼吸が緩やかになったら、つまみ試験を行い、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認します。次に、26ゲージの針を用いて、ルシフェラーゼ基質100 µLを後眼窩的に注入します。注入後、直ちにマウスをイメージングチャンバーへ移動させ、イソフルランを供給するノーズコーンを取り付けます。マウスを仰臥位に置き、各足を黒色の不透明テープでステージに固定します。IVISソフトウェアに適切な設定を入力し、ホワイトライト写真画像と生物発光活性画像の両方を撮影します。画像の取得後、露光時間は10秒間に設定してください。注射後について説明したときと同様の回復プロトコルに従ってください。写真画像と発光画像が自動的に重ね合わせられ、画面に表示されます。マウスの下腹部の両側に、同サイズの関心領域（ROI）サークルを配置して、取得した画像を解析します。一方をPBS注入腺に、もう一方をLPS注入腺に配置してください。読み出し設定をフォトンに設定します。各ROI内で検出されたルミネッセンスを示す数値が表示されるので、この数値を統計解析に使用して最適な画像を表示します。さらに、表示される信号のしきい値を調整します。これにより、総発光読み取り値は変化しませんが、PBSを注入した乳腺に背景信号がない場合に、背景信号を除去することが可能になります。LPS処理した乳腺における信号の増加は、画像で明確に確認できるはずです。練習として、乳量産生が減少する授乳21日目に注入を行いました。注入の成否はトリパンブルー染色によって容易に可視化でき、注入に成功した乳腺では導管系のみが溶液で満たされていました。注入に失敗した場合は、乳頭または周囲組織に液体が蓄積していました。8日目に乳管へLPSを正常に注入した結果、脳およびその他の腹部臓器における恒常的なNF KB活性により、乳腺内のNF KB活性が上昇しました。いかなる操作の前にも、一貫したベースライン信号が認められました。4匹のマウスからなるグループにおいて、ルシフェラーゼ活性はPBSを注入した乳腺よりもLPSを注入した乳腺で大幅に高い値を示しました。LPS処理した乳腺において、統計的に有意なルミネッセンスの増加が測定されました。この手法は、乳腺の炎症に関する知見を得るのに有用です。また、がん研究など、他の研究領域にも応用することが可能です。がん細胞または発がん物質を乳管内に直接注入することができます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

出典: Radulovic, K. ほか 腸のバリア突破後に微生物由来産物の進入を模倣するためにマウスにリポポリサカリドを注射すること。 J. Vis.

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乳腺炎のモデルマウスとしてのLPS管内注入：シグナリングは、NF-κBレポータートランスジェニックを介して可視化

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