乳腺炎のモデルマウスとしてのLPS管内注入：シグナリングは、NF-κBレポータートランスジェニックを介して可視化

この手順の全体的な目標は、乳腺の乳房炎または炎症を研究すること、より具体的には、炎症を起こした授乳腺内の NF Kary 活性を視覚化および定量化することです。これは、最初にメスのNF Kappa bレポータートランスジェニックと野生型のオスを交配することによって達成されます。子犬の誕生から8日後、リポ多糖類は導入注射技術を介して女性の授乳腺に導入され、注射の6時間後に注射部位のすべての創傷を損傷することはありません。

マウスは、乳腺内のルシフェラーゼ活性を検出するために生物発光イメージングを受けます。最終的に、結果は、管内注射法とそれに続く生物発光イメージングの使用により、LPS処理腺で有意なNF KB活性を示すことができます。他の管内注射方法に対する私たちのアプローチの主な利点は、注射部位がまったく損傷を受けないことです。

これは、LPS注射に関連する炎症を研究する予定の場合、部位や乳首への損傷がこれらの分析に重なり、混乱するため、絶対に重要です。この手順には、NGL Reporter導入遺伝子陽性の雌マウスを使用します。1。女性は生後6週間以上です。

Mは、交配後15日でハーと繁殖によってFVB野生型のオスと交配します。妊娠の兆候、すなわち大きく突き出た胴回りがないか、定期的に女性をチェックし始めます。妊娠中の雌を自分のケージに分け、最後の雌が妊娠したら、雄を繁殖ケージから取り出します。

十分な授乳には、少なくとも6匹の子犬が必要です。そのような同腹児の誕生から8日後。プロトコルを続行します。

手順の最も難しい部分は、導入注射自体です。手を安定させ、多くの練習を積むことは助けになりますが、落とし穴は常に発生する可能性があります。成功を確実にするために、注射の日に複数のマウスを準備してください。

まず、大腸菌由来のリポ多糖類をPBSで最終濃度0.1マイクログラム/マイクロリットルに希釈します。このLPS溶液の50マイクロリットルを乳腺に注入します。コントロール注射に使用するPBSのみの2本目のチューブを準備します。

解剖範囲のステージの次に。麻酔を届けるためにノーズコーン装置を固定します。必要に応じて追加のスポットライトを使用して、ステージの明るい照明を準備します。

解剖のセットアップの準備ができたら、isofフッ素マシンとエアフローを始動します。次に、31ゲージのインスリン注射器に50マイクロリットルのLPS溶液をセットし、注射器を練習用注射のために取っておきます。PBSで希釈したトライアムブルー色素を使用して、結果を視覚化します。

次に、マウスの呼吸が遅くなったら、注射するマウスに麻酔をかけます。ステージに置き、ノーズコーンを介してイソフッ素を供給します。を使用してピンチし、手順全体で完全に麻酔がかかったことを確認します。

マウスの呼吸パターンを監視します。イソフッ素を安定させるために、継続的に調整してください。70%エタノールの小さな滴を使用して、動物の腹側腹部の毛を平らにし、乳首を見つけます。

右の4番の鼠径乳腺の乳首を下腹部に配置し、利き手ではない手に細かい鉗子があります。乳首を皮膚から慎重に引き出します。鉗子は決してしっかりと固定しないでください。

利き手の乳首には軽いホールドのみを適用する必要があります。プリロードされたシリンジを視野に入れ、内容物を注入するために再配置する必要がないように保持します。乳首の中央にある小さな延性開口部に針を慎重に向けます。

針の約4分の1を位置を変えずにダクトに挿入します。シリンジの内容物を3〜5秒かけて注入します。次に、乳首から針を慎重に取り外します。

2 本目のシリンジに PBS の 50 マイクロリリースをセットし、左側の手順を繰り返します。4つ目は、PBSコントロールを使用した鼠径乳腺乳首。両方の注射が完了したら、麻酔を中止し、マウスを回復ケージに移動します。

女性は5分以内に動くはずです。1時間後、彼女をパフで自宅のケージに戻します。マウスは6時間の注射で画像化する必要があります。

その間、苦痛の兆候が観察された場合はマウスを監視します。実験を中止し、イメージング施設でマウスを安楽死させます。イソフッ素を使用して女性に麻酔をかける準備をします。

麻酔がボックスとイメージングチャンバーの両方に流れていることを確認します。マウスを透明な麻酔ボックス内のisofフッ素麻酔の下に置きます。呼吸が遅くなったら、マウスが完全に麻酔をかけられていることを確認するために、aを使用してつまみます。

次に、軌道後軌道に、100ゲージの針を通して26マイクロリットルのルシファー基質を注入します。注入後すぐにマウスをイメージングチャンバーに移し、Isof Lorraineを送達するノーズコーンを取り付けます。マウスを仰臥位に置き、黒の不透明なテープで各足をステージに固定します。

IVISソフトウェアに適切な設定を入力して、白色光の写真画像と生物発光活性の画像の両方を撮影します。画像が取得されたら、露光時間は10秒にする必要があります。注射後で説明されているのと同じ回復プロトコルに従ってください。

写真画像と発光画像は自動的にオーバーレイされ、画面に表示されます。マウスの下腹部の両側に同じサイズの関心領域またはROI円を配置して、取得した画像を解析します。1つはPBS注入腺の上に、もう1つはLPS注入腺の上に。

読み出しをフォトンに設定します。各ROI内で検出された発光を示す数値を表示する必要があります。この数値を統計分析で使用して、最適な画像を表示します。表示される信号のしきい値をさらに調整します。

これにより、総発光の読み出しは変更されませんが、PBS注入グランドにバックグラウンド信号がない場合、バックグラウンド信号の除去が可能になります。LPS処理腺の信号の増加は、乳量が少ない授乳の21日目に注射が行われ、注射の成功はトライアンブルーによって容易に視覚化できます 成功した注射で注入された記憶腺の染色は、失敗した注射で乳管樹のみが溶液で満たされました。乳首や周囲の組織に液体が溜まっていました。

8日目に乳管へのLPSの注射が成功した結果、脳や他の腹部臓器の構成的NF KB活性により、腺内のNF KB活性が増加しました。操作の前に一貫したベースライン信号がありました。ルシフェラーゼ活性は、4匹のマウスのグループから注入されたPBS腺よりも、LPS注入腺で大幅に高かった。

LPS処理された腺内の発光の統計的に有意な増加が測定されました。この方法は、乳腺の炎症に関する洞察を提供することができます。また、がん研究など、他の研究分野にも応用できます。

がん細胞や発がん性物質を乳管に直接注入することができます。