Name: 糖尿病マウスの腎臓のカプセルに膵島の移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T23:37:26.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶ、糖尿病マウスの腎臓カプセル下への膵島移植法。精製した膵島をピペットで正確に移植し、細胞とマウスのストレスを最小化する技術です。移植耐性や糖尿病治療研究に応用可能です。

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UCSFの糖尿病センター。 NIH UCSF DERC膵島コア。 JDRF。 LIfeScan株式会社ジョンソン＆ジョンソン社。

移植用膵島の準備（送信） <ol><li>倒立顕微鏡下で、P200 pipetmanと100ミリメートルプレートで培養膵島からストレートピペットチップを使用して手ピック島。 </li><li>各マイクロチューブに時間と転送（〜500膵島/チューブ/マウス）で膵島100を数える。 </li><li>膵島が遠心管の底に沈降することができます。 </li><li>ストレート薄肉ピペットチップを使用してP200 pipetman（130ulで設定）に1つの膵島ペレットを描く。 </li><li>シリンジチップにシリコンチューブアダプターを置きます。シリコンアダプタにPE50チューブの長さを挿入します。 </li><li>先端の島よりもフードの壁にPE50チューブより高いフードとテープの側面にpipetmanをハング。これは、島がピペットの先端でのみ解決できるようになります。 </li><li>ゆっくりpipetmanをダイヤルし、最後から島を追放することに注意しながら、PE50チューブに島を移動することで、PE50チューブに島を転送します。 </li><li> PE50チューブの斜めの端にキンクを行います。キンクを維持しながら、pipetmanからシリコンのアダプターチューブを切断し、シリコーンアダプタを使用してキンクを確保する。 </li><li>カット5mLのピペットとテープ付き円錐15mLを遠心分離しながらPE50チューブのカールを防止するために5 mLのピペットの側面上にPE50チューブに、、PE50チューブで、よじれシリコンアダプターチューブ側の小島を下に置きます。 </li><li> 1000 rpmでにPE50/15mL conicalsを遠心し、遠心分離をオフにしてください。 （一度に10以上の膵島の準備を準備しないでください）​​。 </li><li>チューブを氷上に置きます。 </li></ol>移植のためのマウスの準備<ol><li>イソフルランでまたはケタミン/ Xylexene（準備のプロトコルを参照）を有するマウスを麻酔。 </li><li>麻酔薬が影響を取られた後、マウスの左脇腹を削る。 </li><li>綿棒のポビドンヨード綿棒でマウスの皮膚に、中心アウトし、ETOH綿棒で拭き取ってください。 </li><li>左腎を（単に脾臓の右側）を探します。腹膜を露出させる、皮膚に小さな切開を加えます。 </li><li>腎臓を露出腹膜に小さな切開を加えます。切開が小さく保つことは腎臓が発生し、露出維持するのに役立ちます。 </li><li>切開の両側にわずかな圧力を適用し、上げたり、マウスの腎臓を飛び出す。 </li><li>綿棒をチップソーで生理食塩水を適用することにより、腎臓の潤いを保つ。 </li><li>注射器23または25ゲージの針を使用して、腎臓のカプセルにニックネームを作成し、腎臓の右脇腹に小さな傷を作る;深すぎるまたは大きすぎるではない。 </li></ol>膵島の移植注：マウスが送信のために準備されている間、二人目はハミルトンスクリュードライブ膵島移植の注射器を準備する必要があります。 <ol><li>チューブのねじれを抑えながらゆっくりとPE50チューブからシリコンのアダプターチューブを取り外します。 </li><li>シリコンのアダプターチューブにPE50チューブの反対側の端を置き、&quot;スクリュードライブ&quot;ガラスハミルトンシリンジに接続されているピペットの先端にシリコンのアダプターチューブを置きます。徐々に島々が漏れていないことを確認して、PE50チューブのキンクを離します。 </li><li> &quot;ねじ&quot;のメカニズムを使用してPE50チューブの先端にゆっくりと島を進めるが、PE50チューブの島の前に小さな気泡を維持する。 </li><li>ニックに慎重に小さなポケットを作り、カプセルの下にPE50チューブをスライドさせ、腎臓で作ら。カプセルを介して腎臓またはパンクチャリングをガウジしないように細心の注意を払ってください。 </li><li>それは通常の生理食塩水、ゲンタマイシン浸した綿棒をチップソーでエリアとカプセルの潤いを保つのに役立ちます。ドライカプセルは破れやすいでしょう。 </li><li>ゆっくりと休息に移植膵島のための&quot;ポケット&quot;を作成し、あらゆる方向にチューブを移動します。地域の潤いを保つために追加の生理食塩水を再適用することを忘れないでください。 </li><li>マウスを開いていると誰が腎臓被膜下にPE50チューブを配置した人の指導の下で、マウスとハミルトンの移植の注射器を準備二人称は、、ゆっくりと&quot;ポケット&quot;の内部に、カプセルの下に膵島を進めてまいります、すべての膵島を移植されるまで、PE50チューブで配信小気泡の背後にある。 </li><li>徐々に、PE50チューブを取り外し、乾いた綿棒を使用して領域を乾かし、慎重に、低熱でニックネームを焼灼する。 </li><li>乾いた綿棒をチップソーを使用して、すべての出血が停止していることを確認してください。出血が停止したら、滅菌生理食塩水で腎臓を再度湿らせ、ゆっくりと縫合し、皮膚ステープルでマウスを閉じる前に腹膜に腎臓を交換してください。 </li></ol>閉会/マウスのリバイバル<ol><li> 5から0絹縫合糸のW / C - 6 19ミリメートル針を用いてランニングステッチで腹膜を閉じます。 </li><li>使用して鉗子は、一緒に皮膚切開の両側面を描く。 </li><li> 2つまたは3つのステープルと一緒に皮膚ステープル。 </li><li>綿棒とサリンをチップソーを使用して、任意の血液のマウスの皮膚をきれいにE. </li><li>すぐにフルニキシンとブプレノルフィンの皮下注射でマウスを扱う。 </li><li>マウスが完全にアクティブになるまで、加熱パッドまたは下に加熱ランプに配置されているケージにマウスを置きます。 </li><li> 2週間で皮膚のステープルを削除します。 </li></ol>

<ol><li>Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inability+to+induce+tolerance+through+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Inability to induce tolerance through direct antigen presentation.</a> Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+transplant+rejection+following+treatment+with+anti-B7-2+and+anti-B7-1+antibodies.+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation.</a> Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+xenogeneic+pancreatic+islet+grafts+induced+by+CTLA4lg%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg.</a> Science. 257, 789-792 (1992).</li>
</ol>

このプロトコルは、きれいにし、容易に糖尿病や正常マウスの腎臓被膜下に膵島または細胞を提供するための実用的かつ効率的なオプションが用意されています。腎被膜下に細胞を移植するために使用される最終的な配信のチューブ（PE50）に膵島または細胞を集中し、ペレット化の技術は、細胞、またはマウスへの過度のストレスを軽減しながら細胞を移植するのは簡単で効果的な方法を提供しています。

<table><tbody><tr><td>手術用手袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-95(sz)</td><td></td></tr><tr><td>手術用手洗いスポンジ</td><td>Moore Medical</td><td>42940AK</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Miltex Inc.</td><td>6-114および6-26</td><td>歯付き2本、直線2本</td></tr><tr><td>解剖用はさみ 2本</td><td>Miltex Inc.</td><td>5-290</td><td></td></tr><tr><td>Osterバリカン（40番ブレード）</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-305-10B</td><td></td></tr><tr><td>4x4滅菌ガーゼパッド</td><td>ムーア・メディカル</td><td>08252AK</td><td></td></tr><tr><td>ポビドンヨード綿パッド</td><td>ムーア・メディカル</td><td>08486AK</td><td></td></tr><tr><td>アルコール綿</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-819-2</td><td></td></tr><tr><td>ヒートパッド</td><td>Moore Medical</td><td>42508AK</td><td></td></tr><tr><td>23Gまたは25Gの針</td><td></td><td></td><td>1&quot; 長い</td></tr><tr><td>Cidex溶液</td><td>Moore Medical</td><td>07535AK</td><td>器具の洗浄・消毒用</td></tr><tr><td>PE50ポリエチレンチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td>PE50、外径0.965mm x 内径0.58mm</td></tr><tr><td>Cidex 28日間浸漬溶液</td><td>ムーア・メディカル</td><td>35625AK</td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>Spectrum Chromat.</td><td>123732</td><td>5/32&amp;#8221;OD x 1/32&amp;#8221; ID</td></tr><tr><td>器具滅菌コンテナ</td><td>ムーア・メディカル</td><td>39074AK</td><td></td></tr><tr><td>ストレートピペットチップ</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0810</td><td>滅菌済みの</td></tr><tr><td>スクリュー駆動式ガラスシリンジ</td><td>Hamilton Co</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>焼灼器具</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS230</td><td></td></tr><tr><td>針持</td><td>ムーア・メディカル</td><td>41-067</td><td></td></tr><tr><td>5-0 シルク縫合糸</td><td>LOOK Surgical</td><td>754B</td><td>縫合用（6-C） </td></tr><tr><td>綿棒</td><td>ムーア・メディカル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9mmオートクリップステープラー</td><td>BD Biosciences</td><td>7630</td><td></td></tr><tr><td>9mmステープル</td><td>BD Biosciences</td><td>7631</td><td></td></tr><tr><td>9mmステープルリムーバー</td><td>BD Biosciences</td><td>7637</td><td></td></tr></tbody></table>

糖尿病マウスの腎臓のカプセルに膵島の移植

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

我々のプロトコルは、きれいにし、容易に糖尿病や正常マウスの腎臓被膜下に膵島または細胞を提供するために開発されました。我々は、腎被膜下に細胞を移植するために使用される最終的な配信のチューブ（PE50）のペレット状に島や細胞を集中しやすいことがわかった。細胞にまたはマウスへの過度のストレスを軽減しながらこの手法は、速度と使いやすさの両方を提供します。 ローディング：定住、手で選んだもので、島やペレット化した細胞を注意深くP200 pipettemanとストレート、薄肉ピペットチップを用いて1.5 mlのマイクロチューブの底部を吸引している。 PE50チューブの長さは、小さなシリコンのアダプタチューブを使用して、ピペットの先端に取り付けられています。細胞は先端に、静置され、その後、徐々にpipettemanをダイヤルしてPE50チューブに転送されます。細胞はPE50チューブの終わり近くになったら、キンクが行われ、シリコンのアダプターチューブはキンク上に配置される。 PE50チューブを15 mLの入ったコニカルカット5 mLのピペットに転送され、PE50チューブを遠心中にカーリングを防止するために5 mLのピペットの側面にテープで留めています。細胞を1,000 rpmに到達させ、停止されています。 移植：レシピエントマウスは、麻酔剃毛、そしてクリーンアップされます。小切開は、マウスの左脇腹に行われ、腎臓を露出している。腎臓、脂肪、および組織の生理食塩水綿棒と湿った保たれます。 PE50の遠位端は、シリコンのアダプタチューブを使用して、ピペットの先端を含む、ハミルトンねじ駆動の注射器に接続されています。小さな刻み目が大きすぎたり深すぎない、腎臓の右側腹部側で行われます。細胞最寄りのPE50チューブの斜めに終わりが、、慎重にカプセルの下に配置され、チューブは通常の生理食塩水を拭き取りながら、スペースを作るために静かに周りに移動され、乾燥したカプセルが破れやすいこともできます。小さな気泡はゆっくりとシリンジのねじ駆動をダイヤルすることにより、カプセルの下に配信されます。小島は、その後徐々に空気の泡の後ろに配信されます。かつての島が配信されて腎臓の恒常性が維持され、小物を低熱で焼灼されています。腎臓は、空洞に戻されますし、腹膜と皮膚を縫合してステープルされる。マウスはすぐにフルニキシンとブプレノルフィン平方で処理し、加熱パッド上にケージに入れています。

我々のプロトコルは、きれいに、簡単にマウスの腎被膜下膵島または細胞を提供するために開発されました。細胞は、腎臓の被膜下に細胞を移植に使用される最終的なチューブのペレットに集中している。このテクニックの使いやすさは、細胞とマウスへのストレスを軽減。

本プロトコルは、糖尿病マウスまたは正常マウスの腎被膜下に、膵島または細胞を簡便かつ確実に移植するために開発されました。その結果、……の方が容易であることがわかりました。

こんにちは、Greg Zodです。私はUCSF糖尿病センターのBluestone研究室に所属しています。本日は、糖尿病マウスの腎被膜下へのミラーリングアイレットの移植方法について説明します。この手順では、同系または同種のマウス系統から精製したアイレットを用い、それらをさらに精製して、糖尿病マウスの腎被膜下に移植します。NODマウスのような自然発症糖尿病マウス、またはストレプトゾトシンを注射して人工的に糖尿病を誘発させたマウスを使用します。これで、膵島を回収する準備が整いました。ピペットで吸い上げながら、膵島を個別に選び、数を数えていきます。組織の中に残っている眼をそのままにし、組織内で光が屈折する様子を見ることで、どれが眼であり、どれが眼ではないかを判別します。その後、眼の数を数えます。それらをマイクロ遠心チューブに入れ、移植用に回収します。眼窩（アイレット）はより密度が高く、ほぼ赤みを帯びた外見をしていますが、右側のACEはより色が薄く、ふわふわしています。また、白っぽくも見えます。そのため、眼窩を採取する際に右側のACE組織が一部混入しますが、眼窩の大部分を採取できていれば問題ありません。ここに、大きな R 組織の断片があるのがわかります。そしてここにアイレットがあり、その上にさらに別のアイレットがあります。その間にいくつかの R がありますが、位置を調整して個々のアイレットをキャプチャすることができます。また、お気づきかもしれませんが、ここでは円錐形ではないピペットチップを使用しています。このチップは壁面が非常に薄く、形状が直線的です。これにより、アイレットをチップに出し入れしやすくなります。リンパ節を採取しないように注意してください。これらは膵臓のリンパ節であり、消化され精製される特殊なものです。可能な限り、リンパ節は残し、膵島のみを採取するようにします。アイレットを手作業で選別した後、このマイクロ遠心チューブの底に500個の遊離アイレットが集まっています。次に、これらのアイレットを移植用のP150チューブに移します。移し方は、ピペットチップを用いて、チューブの底からアイレットをゆっくりと吸引します。次に、ピペットチップにアイレットを挿入したら、B 50チューブに接続したシリコンチューブを取り付けます。これらをフードの壁側にテープで固定し、チップ内でペレットが落ち着くまで待ちます。ペレットがピペットチップ内で安定したら、ピペットを取り外し、プランジャーではなくピペットのダイヤルを使用して、ペレットをゆっくりとチューブの中に送り込みます。ダイヤルを回しながら、同時にチューブを動かします。これにより、ペレットがP 50チューブ内に導入されます。ペレットがチューブの端から約1インチまで移動したところで、チューブを折り曲げてペレットを保持しました。その後、シリコンチューブを取り外し、折り曲げた箇所へ移しました。これを、先端を切断した5 mLピペットを用いて遠心チューブに入れます。次に、チューブを折り曲げ、5 mLピペットにテープで固定します。これでCentrifusionの準備が完了しました。マウスの除毛と麻酔が行われています。まず、足指へのピンチ刺激に反応しないことを確認します。次に、ポビドンヨード綿でマウスを清拭します。手術は無菌的に行いますが、使用する器具の先端はすべて滅菌済みです。マウスの左側腹部で、脾臓のすぐ右側に小さな切開を加えます。この切開を小さく保つことで、腎臓をしっかりと保持させます。腎臓を単離する際は、その腎臓の直上の腹膜壁を切開し、小さな切開口を作ります。そして一度の動作で、皮膚を左側に持ち上げながら、腎臓を押し上げ、押し下げることで、このようにして腎臓を取り出します。腎臓を湿らせた状態に保つため、少量の生理食塩水と抗生物質のゲンタマイシンを用います。25ゲージの針を使用して、チューブを挿入する位置に腎臓の小さな切開を加えます。腎臓を深く切り込みすぎないようにし、小さく切り込みを入れるだけにしてください。少量の出血が見えれば、被膜に到達したことがわかります。斜めにカットしたP 50チューブを使用し、カットした縁の下側に引っ掛けるようにして、ゆっくりとチューブをカプセルの下に配置します。この操作の間、Pavelは腎臓を湿らせた状態に保ちます。カプセルが乾燥していると容易に破裂するためです。P 50チューブがカプセルの下に入ったら、Pavoがスクリュードライブ付きのHamiltonシリンジを用いてペレットを前進させます。ここで、ペレットがゆっくりと挿入されていくのがわかります。スクリュードライブに基づいてアイレットの送達方向を制御します。アイレットの送達が完了したら、乾いたガーゼの先端で患部を拭い、電気焼灼器を用いて切開部と腎臓を封鎖します。5-0シルクを用い、腹膜を把持して縫合します。連続縫和でマウスを閉じます。その後、スキンステープラーで皮膚を閉じます。マウスを目覚めさせる前に、抗炎症剤であるbpro、amine、flu nixonおよび鎮痛剤を皮下注射します。その後、マウスをヒートパッドを敷いたケージに戻します。以上で、マウスの腎被膜下へのアイレット移植方法について説明しました。これは、移植耐性や糖尿病の治療法の検討に非常に優れたモデルです。具体的に当研究室では、このモデルを用いて、アイレット細胞移植に対するtregsの影響や、異なる共刺激遮断分子による耐性誘導について研究しています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

分離された膵島の移植は1型糖尿病の治療薬であることが提案されている。ここでは、マウスの膵臓から膵島を分離し、腎臓の被膜下のスペースにそれらを移植する方法を説明します。...

マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

このビデオでは、ヒト膵島をマウスの眼の前房に移植し、in...

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腹部臓器移植、膵臓移植は早期グラフトの損失に最終的につながる重症虚血再灌流傷害関連付けられているグラフト損傷を開発する傾向があります。このプロトコルでは、これらの初期、劇物の被害解析に最適な非縫合腱を用いたマウス膵移植のモデルについて説明します。...

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大網移植マウスの島のための方法を紹介します。膵島は、ハイドロゲルと混合され、混合物は糖尿病マウスの大網のポーチに配置されます。血糖値を監視し、免疫組織化学的解析を行っています。...

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このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。...

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

ここでは、マウスにおける門脈内膵島移植(臨床的には関連性はあるが技術的に困難な外科的処置)を成功裏に実施するための洗練された外科的処置を提示する。...

マウスの肝内膵島移植中の注入後門脈静脈出血の最小化

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶ、糖尿病マウスの腎臓カプセル下への膵島移植法。精製した膵島をピペットで正確に移植し、細胞とマウスのストレスを最小化する技術です。移植耐性や糖尿病治療研究に応用可能です。

糖尿病マウスの腎臓のカプセルに膵島の移植

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