細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング

この手順の目的は、細菌の遺伝子とパスウェイの間の機能的な関係を調査することです。これは、まず、接合または交配させるための単一変異株であるceia coliのアレイを調製することによって達成されます。第2のステップは、単一変異株をプレート上でアレイ形式で接合させることです。

次に、二重変異体を回収します。最終ステップとして、二重変異体のプレートをイメージングし、二重変異体コロニーを定量化して菌株の適応度を決定します。最終的に、コロニーサイズのデータを解析して遺伝子相互作用スコアを算出し、機能的に相互作用する遺伝子、パスウェイ、およびプロセスを特定します。

ランダム変異導入などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、多数の個別の二重変異株を作製できることです。さらに、遺伝子のサイズ、必須性、または単一遺伝子変異株の適応度に関係なく、多くの遺伝子間の相互作用を同時に評価できます。この方法は、遺伝子機能や、パスウェイおよびプロセスの間の機能的なクロストークに関する疑問など、システム生物学分野における重要な問いへの回答に役立ちます。

この手法の意義は、細菌感染症の治療にまで及びます。なぜなら、機能的に中心となるほとんどの遺伝子やプロセスに関する知見、および細菌の遺伝子、経路、プロセスのどの組み合わせを摂動させれば細菌の適応度（fitness）が向上または低下するかという理解があれば、最も効果的な介入戦略を開発できるためです。本プロトコルの開始にあたり、記述された手順に従い、2ステップのネステッドPCR増幅を用いて、標的オープンリーディングフレームをPKD3プラスミド由来のクロラムフェニコール耐性マーカーに置換します。

目的産物であることを確認し、製造元のプロトコルに従って得られたフラグメントをPCR精製します。PCR産物を30 µLの滅菌蒸留水で溶出した後、濃度が約50 mg/µLになるように希釈します。精製した産物は、形質転換まで-20 °Cで保存します。

次に、ドナー構築用の高頻度組換え（HFR）Cavalコンピテント細胞を調製します。まず、HFR Cavalli株の飽和したオーバーナイト培養液1 mLを、50 mg/mL Ampicillinを35 µL添加した新鮮なLB培地70 mLが入った250 mLフラスコに接種します。

吸光度が約0.5から0.6になるまで、220 RPMで緩やかに振盪しながら32 °Cで培養します。次に、Lambda Red組換えシステムの熱誘導を行うため、培養液をウォーターバスに移し、160 RPMで振盪しながら42 °Cで15分間保持して誘導を停止させます。その後、培養液を冷却した氷 slush ウォーターバスに移し、160 RPMで10分から20分間静置します。

形質転換まで細胞を低温に保ってください。記載されたプロトコルに従って細胞を洗浄し、遠心分離で回収した後、上清を捨て、ペレットを500 µLの氷冷した10% glycerol Eloquaに再懸濁します。細胞を50 µLずつ個別の冷却済み1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注し、直ちに形質転換に進みます。

精製した遺伝子欠損カセットを100 nanograms、コンピテントセルに加えます。チューブを軽く叩き、懸濁液を氷上で5分間静置します。その後、懸濁液をあらかじめ冷却したエレクトロポレーションキュベットに移し、直ちに細胞混合物を電気穿孔します。

室温のSOC培地を1 mL加え、エレクトロポレーション後の細胞を15 mLの培養チューブに移します。220 RPMでオービタルシェイクを行いながら、32 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を4,400 ×gで5分間遠心分離します。

室温で、上清を約850 µL取り除き、残った液体で細胞ペレットを再懸濁します。細胞を17 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLBプレートに塗布し、32 °Cで一晩インキュベートします。翌日、2つの個別の形質転換体をLBクロラムフェニコールプレートにストリーキングして変異を確認します。同様の形質転換体をLBカナマイシンプレートにストリーキングし、菌株がカナマイシン耐性ではないことを確認します。

次に、記載されているプロトコルに従い、3組の異なるノックアウト確認用プライマーを用いてDNAを増幅させます。1組目のプライマーセットは、標的領域の200 bp上流に位置する20ヌクレオチドのフランキングフォワードプライマーと、クロラムフェニコール耐性カセットに相補的なリバースプライマーで構成されています。この増幅により、445ヌクレオチドのアンプリコンが生成されることが期待されます。

2番目のセットには、クロラムフェニコール耐性カセット配列にアニーリングするフォワードプライマーと、欠損遺伝子の3'末端から200 bp下流にアニーリングするように設計されたリバースフランキング確認プライマーが含まれています。この増幅反応では、309ヌクレオチドのアンプリコンが生成されることが期待されます。3番目のPCRには、上流および下流の両方のフランキングプライマーが含まれています。

この反応は、選択した株が、一方の遺伝子座がカセットに置換され、もう一方が重複して野生型遺伝子のコピーが保持されたままの、狭義の二倍体ではないことを確認するために必要です。この増幅では、1.4 KBの産物が得られることが予想されます。E. coli K-12の非必須単一遺伝子欠損変異体コレクションを、ロボットを用いて24 384プレートにレプリカプレートしました。

各ウェルに80 µLの液体LB培地を満たしたマイクロプレートを用意します。これに50 µg/mLのカナマイシンを添加します。ポジティブコントロールとして、またプレートの標準化および自動コロニー定量化を補助するために、カナマイシン耐性株を導入します。各プレートの最外周のウェルから接種した培地を取り除いて新しいプレートに移し、最外周のウェルは空の状態にします。

同様に、各プレート内の別の場所から任意の2つの菌株を取り除き、それらを新しいプレートに転移させることで、ネガティブコントロールスポットを作成します。次に、境界コントロールウェルとネガティブコントロールウェルを含む空のウェルに、17 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLV培地を満たします。これらのネガティブコントロールスポットは、レシピエントおよび二重変異体プレートにおいて空になると予想されます。

これらは、イメージングの番号付けやプレートのピンニング時に、処理またはプレート操作の誤りがなかったことを確認するために行います。記載の手順に従って境界陽性株を調製した後、アレイ株および境界陽性株を32 °Cで190 RPMのオービタルシェイキングを加えながら一晩培養します。翌日、境界ウェルに一晩培養した液を約80 µL分注します。組み立てられたプレートは、次のセクションで説明する交配に使用できます。

あるいは、長期保存の場合、受容プレートの各ウェルに15% glycerolを添加し、培地とglycerolを混合します。その後、プレートを-80°Cで保存します。交配手順を開始するため、クロラムフェニコール耐性カセットで標識されたクエリ遺伝子欠損を持つHFRドナー株を、17 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLB液体富栄養培地を用いて32°Cで一晩培養します。

THオーダーのレシピエント変異株コレクションを、50 µg/mLのカナマイシンを添加した固形LBプレートに384コロニー密度で播種しました。同時に、ドナークエリ変異株を同数のLBプレートに384コロニー密度でピンニングしました。

17 µg/mLのクロラムフェニコールを添加します。菌株を接合させるため、プレートを32 °Cで一晩インキュベートします。3枚の84コロニー一晩ドナープレートから、ドナーを固形LBプレートにピンニングします。

次に、1枚の384コロニー受容体プレートから、新たにピンニングしたドナー上の各株にピンニングし、一晩静置します。ピンニングした接合プレートを32 °Cで16〜24時間インキュベートします。続いて、各384密度の接合プレートを、クロラムフェニコールを含む単一のLB固形培地プレートにピンニングします。

すべての接合プレートのピンニングが完了するまで、このプロセスを繰り返します。ピンニングした一次選択プレートを32°Cで16〜36時間インキュベートします。インキュベーション後、各一次選択プレートを1536 SPOTフォーマットの二次二剤選択プレートに再度ピンニングし、各一次選択コロニーが4つのコロニーとして転写されるようにします。

2枚目の選択プレートにおいて、プレートを16から36時間インキュベートします。32 °Cで最終的な二重変異体選択プレートを撮影し、変異体の増殖適応度を定量的に測定し、遺伝子ペア間の相互作用を解析します。同じ経路にある遺伝子は密接に相関したGIパターンを示すため、機能的に関連する遺伝子を、Sスコアプロファイルの全体的な類似性に基づいてクラスタリングすることでグループ化できます。

GIプロファイルの類似性は、2つの遺伝子を変異させた際の表現型の整合性を表しており、これら2つの遺伝子が同一または重複するパスウェイで作用しているかどうかの指標となります。ここでは、物理的に相互作用するタンパク質をコードする遺伝子ペアと、ランダムに抽出した遺伝子ペアの間におけるGIプロファイルの相関係数の分布を示しています。精子の排出に必要なヘテロ三量体複合体を形成する2つのトランスポーターについて、相関する遺伝的プロファイルの散布図の例を、酵母のecoline遺伝子の例とともに示します。

高度に相関したGIプロファイルを持つ相互作用を軽減すると、物理的に関連している経路や、共通の生化学的経路において協調的に機能する経路がコードされる傾向があります。ここでは、不可欠なプロセスに共同で関与する機能的に冗長なISCおよびSUF鉄硫黄生物合成経路の構成要素が、広範な悪化相互作用によって互いに連結された個別のクラスターを形成している代表的な例を示します。統計的指標を用いることで、特定の経路の組み合わせ間における相互作用の有意な濃縮を検出したり、GIネットワークと物理的相互作用、およびゲノムコンテキストなどの他の機能的関連データと統合したりすることが可能です。

相関関係を明らかにすることで、細菌におけるコア生物学的システムを規定する高次機能モジュールの構成を解明できる可能性があります。また、クラスター解析をゲノムアイランド（GI）ネットワークに適用し、アノテーション済み遺伝子の機能を予測することも可能です。ただし、クラスタリングアルゴリズムは多様であるため、注意が必要です。

ただし、クラスタリングによって決定された推定機能割り当てには、独立した実験的検証が必要です。この手順を行う際は、必要なすべての陽性と陰性の対照を組み込むことが重要です。また、特定の遺伝子機能や、遺伝子とパスウェイ間の機能的関係の性質に関するさらなる疑問を解消するために、プロテオミクス、生化学的な追試、ケミカルゲノミクスなどの他の手法を併用することができます。

このビデオを視聴することで、二重変異株の構築、受容体アレイの組み立て、およびE. coliにおける遺伝子とプロセスの機能的関係を調査するためのESGAスクリーニングの実施方法について、十分に理解することができます。