Name: 細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング大腸菌合成遺伝子配列を用いて (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: 学ぶ大腸菌の遺伝的相互作用ネットワーク解析法eSGA。二重変異体作製とコロニー定量により遺伝子機能関係を網羅的に探索し、細菌の経路相互作用を解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この作品は、ゲノムカナダ、オンタリオ州ゲノミクス研究所、保健研究助成金のカナダの協会からJGとAE社への資金によってサポートされていましたヴァニエ·カナダ大学院奨学金の受賞者です。

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、GIを問い合わせることによって経路レベルで細菌の遺伝子の機能を調べるためにロボットeSGAスクリーニングを使用するための段階的なプロトコルについて概説しました。このアプローチは、 大腸菌内の個々の遺伝子だけでなく、全体のシステム生物学を研究するために使用することができます大腸菌 。慎重に実験手順を実行すると、すべての適切なコントロールを含め、上記のように、そして厳格に分析し、独立して、GIのデータが新しい機能の発見を行う際にeSGAの成功のための重要な側面で検証する。 eSGA、 大腸菌にGIを研究するための概念的に類似した方法に加えて、 大腸菌は 、巨大大腸菌17と称され、しばしばこのようなプロテオーム23または単独で表現型の13スクリーンなど他のアプローチでは見逃される新規機能的な関係を照らすために使用することができます。それにもかかわらず、任意のゲノムワイドなアプローチと同様に、制限は、例えば、他の細菌種に、eSGAまたは巨大大腸菌の適用に存在しない。これは部分的であることです特に標的突...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;I. 抗生物質&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>バイオショップ</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Luria-Bertani培地&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LB粉末</td><td>バイオショップ</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>バイオショップ</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. 細菌株およびプラスミド&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hfr Cavalli株 &amp;#955;&lt;sub&gt;赤&lt;/sub&gt; システム（JL238）</td><td>バブ &lt;em&gt;ら&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;大腸菌&lt;/em&gt; 遺伝子ストックセンター、イェール大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;大腸菌&lt;/em&gt; F-受容体コレクション</td><td>日本のバイオリソースプロジェクト (NBRP)&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低機能（ハイポモーフィック） &lt;em&gt;大腸菌（E. coli） &lt;/em&gt;F- SPAタグ株</td><td>オープンバイオシステムズ；Babu &lt;em&gt;他ら&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. プライマー&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pKD3ベースの脱塩済み定数プライマー</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>脱塩済みカスタムプライマー</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>脱塩済みカスタムプライマー</td><td></td><td></td><td>F2およびR2：pKD3配列に基づく20 ntの定数領域と、45 ntのカスタム相同領域&lt;br/&gt; F2定常領域：&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; R2定常領域：&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
S1およびS2：SPA-Cmカセットの増幅プライミング用の27 nt固定領域、および45 ntのカスタム相同領域&lt;br/&gt; S1定常領域：&lt;br/&gt; 5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG-3'&#039;&lt;br/&gt; S2定数領域：&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-FおよびKOCO-C：非必須遺伝子の欠損部位、または必須遺伝子の［欠損部位から］200 bp離れた位置に設計した20 ntのプライマー&lt;br/&gt; gene SPAタグ挿入部位</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. PCRおよび電気泳動用試薬&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10倍PCRバッファー</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>バイショップ</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>ローディングダイ</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>バイショップ</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBEバッファー</td><td>バイオショップ</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris塩基</td><td>バイオショップ</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>シグマ</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>DNAラダー</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. DNA抽出および精製キット&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ゲノムDNA抽出・精製キット</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>プラスミドMidiキット</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;7. PCR、形質転換およびレプリカピンニング用装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 cm エレクトロポレーションキュベット</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;C ウォーターバスシェーカー</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;振盪機</td><td>New Brunswick Scientific（米国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C プレートインキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoToR-HDAベンチトップロボット</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96、384および1,536ピン密度のパッド</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96本または384本のロングピン</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;8. イメージング装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>カメラスタンド</td><td>カイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ、1000万画素</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライトボックス、Testrite 16&quot; x 24&quot; 単位</td><td>テストライト</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;9. パッドまたはプレートの再利用 &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10% 漂白剤</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌蒸留水</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クリーンベンチ</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外線ランプ</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10. 器具・消耗品&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>50 mlポリプロピレンチューブ</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロ遠心チューブ</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml三角フラスコ</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 滅菌培養チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>凍結保存チューブ</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>長方形プレート</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルおよび384ウェルマイクロタイタープレート</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>マルチウェル用シーリングプレートローラー</td><td>シグマ</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>プレート</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>粘着プレートシール</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;Cフリーザー</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細菌機能ネットワークとpathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

表現型は、物理（蛋白質-蛋白質など ）と機能（ 例えば遺伝子遺伝子または遺伝的）相互作用（GI）1一連の複雑によって決定されます。物理的な相互作用が細菌のタンパク質が複合体として関連付けられているかを示すことができますが、それらは必ずしも経路レベルの機能relationships1を明らかにしない。 2削除または不活性化された遺伝子をもつ二重変異株の増殖を測定し、対応する単一の変異体と比較されるGIの画面は、遺伝子座の間の上位性の依存性を照らすそれゆえ小説機能的関係2を照会し、発見するための手段を提供することができる。大規模GIマップは酵母3月7日のような真核生物のために報告したが、GIの情報は、細菌ゲノムの機能アノテーションを妨げる原核8日のための疎のままされています。この目的のために、我々と他の人は、ハイスループット定量的な細菌性胃腸スクリーニング方法（9）（10）を開発しました</&gt;（商標）。 ここでは、定量的なEを実行するために必要な主要な手順を提示全身的に生成し、コロニー配列形式の二重変異体の多数の適合度を測定するために自然な細菌接合と相同組換えを用いて大腸菌ゲノムスケールの9の合成遺伝子アレイ（eSGA）スクリーニング手順は、 簡単に述べると、ロボットを転送するために使用され、共役を介して、クロラムフェニコール（Cm） - 著しいF-レシピエント株 - （組換えの高周波）エンジニアリングHFRから変異アレルをマーク &#39;ドナー株&#39;カナマイシン（菅）の規則正しい配列にします。一般的に、我々はに機能喪失型の非必須遺伝子欠失をもつ単一突然変異（ &#39;慶應義塾&#39;コレクション11 など ）と必須遺伝子hypomorphic変異（還元タンパク質の発現、安定性、または活動9、12、13を付与する 、すなわち対立遺伝子）を使用非必須と必須遺伝子の機能アソシエーション、resを問い合わせるpectively。相同組換えによる共役とその後の遺伝子交換を媒介した後、得られた二重変異体は、両方の抗生物質を含有する固体培地上で選択されています。伸長した後、プレートをデジタル画像化されるとコロニーサイズを定量的に社内自動画像処理システム14を用いて採点されます。二重変異体の成長率はどちら有意に良好または9予想以上に悪化しているときにGISは明らかにされています。悪化（または負）GISは、多くの場合、同じ基本的なプロセス2に当たる代償経路からの遺伝子のペアにおける機能喪失型変異との間に生じる。ここでは、単一の遺伝子の損失は、単一の変異が生存可能であるように、バッファリングされます。しかし、両経路の損失は有害であると合成致死性または病気（ すなわち低成長）が返されます。逆に、緩和（または正）の相互作用と同じ経路またはタンパク質複合体2の遺伝子の間に発生する可能性がありますいずれかの遺伝子の欠失だけでは、多くの場合、追加摂動はさらに、活性を低下させるため、成長しないような経路または複合体の正常な機能を混乱させるのに十分である。全体的に、体系的にGIのネットワークを識別し、分析することは、他の手法では見逃さ経路レベルの情報が9推測することができ、そこから多数の遺伝子間の機能的関係の公平、グローバルマップを提供することができます。

GIは遺伝子間の機能的関係を明らかにします。同様に、同一パスウェイ上の遺伝子は類似したGIパターンを示し、GIプロファイルの類似性は表現型の合致度を表すため、GIプロファイルをクラスタリングすることで機能的に関連する遺伝子をパスウェイとしてグループ化できます。GIおよびGI相関ネットワークを、物理的相互作用情報やゲノムコンテキスト（GC）関係などの他の関連データと統合することで、細菌におけるコアとなる生物学的システム（およびシステム間のクロストーク）を規定する高次機能モジュールの構成を明らかにすることも可能です。例えば、酵母4, 6, 7, 26と同様に、緩和的な相互作用を示し、かつGIプロファイルに高い相関があるE. coliの遺伝子ペアは、物理的に結合している（e.g.複合体を形成する；Figure 4a）か、または共通の生化学的パスウェイで協調的に作用する（e.g.線形カスケードの構成要素）タンパク質をコードする傾向があります。代表的な例がFigure 4bに示されており、必須のFe-S生...

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述<em&gt;大腸菌</em&gt;。

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

表現型は、物理的（例：タンパク質-タンパク質）および機能的（例：遺伝子-遺伝子または遺伝的）相互作用（GI）という複雑な一連の相互作用によって決定されます。一方で...

この手順の目的は、細菌の遺伝子とパスウェイの間の機能的な関係を調査することです。これは、まず、接合または交配させるための単一変異株であるceia coliのアレイを調製することによって達成されます。第2のステップは、単一変異株をプレート上でアレイ形式で接合させることです。次に、二重変異体を回収します。最終ステップとして、二重変異体のプレートをイメージングし、二重変異体コロニーを定量化して菌株の適応度を決定します。最終的に、コロニーサイズのデータを解析して遺伝子相互作用スコアを算出し、機能的に相互作用する遺伝子、パスウェイ、およびプロセスを特定します。ランダム変異導入などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、多数の個別の二重変異株を作製できることです。さらに、遺伝子のサイズ、必須性、または単一遺伝子変異株の適応度に関係なく、多くの遺伝子間の相互作用を同時に評価できます。この方法は、遺伝子機能や、パスウェイおよびプロセスの間の機能的なクロストークに関する疑問など、システム生物学分野における重要な問いへの回答に役立ちます。この手法の意義は、細菌感染症の治療にまで及びます。なぜなら、機能的に中心となるほとんどの遺伝子やプロセスに関する知見、および細菌の遺伝子、経路、プロセスのどの組み合わせを摂動させれば細菌の適応度（fitness）が向上または低下するかという理解があれば、最も効果的な介入戦略を開発できるためです。本プロトコルの開始にあたり、記述された手順に従い、2ステップのネステッドPCR増幅を用いて、標的オープンリーディングフレームをPKD3プラスミド由来のクロラムフェニコール耐性マーカーに置換します。目的産物であることを確認し、製造元のプロトコルに従って得られたフラグメントをPCR精製します。PCR産物を30 µLの滅菌蒸留水で溶出した後、濃度が約50 mg/µLになるように希釈します。精製した産物は、形質転換まで-20 °Cで保存します。次に、ドナー構築用の高頻度組換え（HFR）Cavalコンピテント細胞を調製します。まず、HFR Cavalli株の飽和したオーバーナイト培養液1 mLを、50 mg/mL Ampicillinを35 µL添加した新鮮なLB培地70 mLが入った250 mLフラスコに接種します。吸光度が約0.5から0.6になるまで、220 RPMで緩やかに振盪しながら32 °Cで培養します。次に、Lambda Red組換えシステムの熱誘導を行うため、培養液をウォーターバスに移し、160 RPMで振盪しながら42 °Cで15分間保持して誘導を停止させます。その後、培養液を冷却した氷 slush ウォーターバスに移し、160 RPMで10分から20分間静置します。形質転換まで細胞を低温に保ってください。記載されたプロトコルに従って細胞を洗浄し

mapping-bacterial-functional-networks-pathways-escherichia-coli-using

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

マススペクトロメトリー（APMS）との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー（SPA）をAPMSの手順を説明...

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可...

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

この5日間のプロトコルは、すべての手順、機器、およびベースの効率的な内在大腸菌ゼロからTX-TLの無細胞発現系を作成し、実行するために必要な追加ソフトウェアの概要を説明します。試薬を用いて、プロトコルは8セットアップ時間以下の反応、収集、およびプロセスデータをとる。...

実装するためのプロトコルエシェリヒア·コリに基づくTX-TLの無細胞発現系

単一分子追跡と組み合わさ光活性化局在化顕微鏡（PALM）は、生大腸菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用の直接観察及び定量化を可能にする。...

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

ここでは、推定ファージ遺伝子の機能的特徴付けのための現象的アプローチを提示します。技術には、宿主の同化代謝を監視できる開発されたアッセイ、マルチ表現型アッセイプレート(MAP)、確立されたメタボロミクスの方法に加えて、異化代謝への影響を測定することができます。...

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

細菌のエフェクタータンパク質は、成功した感染を確立するために重要です。このプロトコルは、その自然の植物宿主における細菌のエフェクタータンパク質のタンパク質性結合パートナーの実験的同定を記載します。酵母ツーハイブリッドスクリーニングを介してこれらのエフェクターの相互作用を同定することは、分子病原性戦略の解明に重要なツールとなっています。...

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

本論文では、遺伝子操作された細胞およびプログラマブル材料表面を制御し、操作するために、合成遺伝子操作大腸菌を有効に官能基化表面を開発するための一連のプロトコルを提示します。...

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

ここでは、非コーディング DNA...

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

ベンチトップ機器を使用した全ゲノムシーケンス(WGS)戦略の実現可能性により、ラボ環境での公衆衛生に関連するすべての微生物のゲノム調査が簡素化されました。細菌WGSのワークフローの方法論的適応について説明し、分析のためのバイオインフォマティクスパイプラインも提示します。...

オレオクロミス属由来の病原性大腸菌株のキャラクタリゼーション 全ゲノムシーケンシングを使用する農場

ここでは、テトラサイクリン制御ベースの誘導合成回路を設計、構築、および提供するためのプロトコルが提示されます。寄生虫の除去とサイトカイン発現に対する合成回路の影響は、提示されたパイプラインをチャネリングすることで研究できます。このプロトコルは、感染症における合成回路ベースの治療薬を研究する研究者に関連しています。...

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

学ぶ大腸菌の遺伝的相互作用ネットワーク解析法eSGA。二重変異体作製とコロニー定量により遺伝子機能関係を網羅的に探索し、細菌の経路相互作用を解明する。

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング

さらに動画を探す