Name: 細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング大腸菌合成遺伝子配列を用いて (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: 学ぶ大腸菌の遺伝的相互作用ネットワーク解析法eSGA。二重変異体作製とコロニー定量により遺伝子機能関係を網羅的に探索し、細菌の経路相互作用を解明する。

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この作品は、ゲノムカナダ、オンタリオ州ゲノミクス研究所、保健研究助成金のカナダの協会からJGとAE社への資金によってサポートされていましたヴァニエ·カナダ大学院奨学金の受賞者です。

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、GIを問い合わせることによって経路レベルで細菌の遺伝子の機能を調べるためにロボットeSGAスクリーニングを使用するための段階的なプロトコルについて概説しました。このアプローチは、 大腸菌内の個々の遺伝子だけでなく、全体のシステム生物学を研究するために使用することができます大腸菌 。慎重に実験手順を実行すると、すべての適切なコントロールを含め、上記のように、そして厳格に分析し、独立して、GIのデータが新しい機能の発見を行う際にeSGAの成功のための重要な側面で検証する。 eSGA、 大腸菌にGIを研究するための概念的に類似した方法に加えて、 大腸菌は 、巨大大腸菌17と称され、しばしばこのようなプロテオーム23または単独で表現型の13スクリーンなど他のアプローチでは見逃される新規機能的な関係を照らすために使用することができます。それにもかかわらず、任意のゲノムワイドなアプローチと同様に、制限は、例えば、他の細菌種に、eSGAまたは巨大大腸菌の適用に存在しない。これは部分的であることです特に標的突...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;I. 抗生物質&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>バイオショップ</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Luria-Bertani培地&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LB粉末</td><td>バイオショップ</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>バイオショップ</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. 細菌株およびプラスミド&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hfr Cavalli株 &amp;#955;&lt;sub&gt;赤&lt;/sub&gt; システム（JL238）</td><td>バブ &lt;em&gt;ら&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;大腸菌&lt;/em&gt; 遺伝子ストックセンター、イェール大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;大腸菌&lt;/em&gt; F-受容体コレクション</td><td>日本のバイオリソースプロジェクト (NBRP)&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低機能（ハイポモーフィック） &lt;em&gt;大腸菌（E. coli） &lt;/em&gt;F- SPAタグ株</td><td>オープンバイオシステムズ；Babu &lt;em&gt;他ら&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. プライマー&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pKD3ベースの脱塩済み定数プライマー</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>脱塩済みカスタムプライマー</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>脱塩済みカスタムプライマー</td><td></td><td></td><td>F2およびR2：pKD3配列に基づく20 ntの定数領域と、45 ntのカスタム相同領域&lt;br/&gt; F2定常領域：&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; R2定常領域：&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
S1およびS2：SPA-Cmカセットの増幅プライミング用の27 nt固定領域、および45 ntのカスタム相同領域&lt;br/&gt; S1定常領域：&lt;br/&gt; 5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG-3'&#039;&lt;br/&gt; S2定数領域：&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-FおよびKOCO-C：非必須遺伝子の欠損部位、または必須遺伝子の［欠損部位から］200 bp離れた位置に設計した20 ntのプライマー&lt;br/&gt; gene SPAタグ挿入部位</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. PCRおよび電気泳動用試薬&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10倍PCRバッファー</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>バイショップ</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>ローディングダイ</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>バイショップ</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBEバッファー</td><td>バイオショップ</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris塩基</td><td>バイオショップ</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>シグマ</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>DNAラダー</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. DNA抽出および精製キット&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ゲノムDNA抽出・精製キット</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>プラスミドMidiキット</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;7. PCR、形質転換およびレプリカピンニング用装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 cm エレクトロポレーションキュベット</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;C ウォーターバスシェーカー</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;振盪機</td><td>New Brunswick Scientific（米国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C プレートインキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoToR-HDAベンチトップロボット</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96、384および1,536ピン密度のパッド</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96本または384本のロングピン</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;8. イメージング装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>カメラスタンド</td><td>カイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ、1000万画素</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライトボックス、Testrite 16&quot; x 24&quot; 単位</td><td>テストライト</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;9. パッドまたはプレートの再利用 &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10% 漂白剤</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌蒸留水</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クリーンベンチ</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外線ランプ</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10. 器具・消耗品&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>50 mlポリプロピレンチューブ</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロ遠心チューブ</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml三角フラスコ</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 滅菌培養チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>凍結保存チューブ</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>長方形プレート</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルおよび384ウェルマイクロタイタープレート</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>マルチウェル用シーリングプレートローラー</td><td>シグマ</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>プレート</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>粘着プレートシール</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;Cフリーザー</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細菌機能ネットワークとpathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

表現型は、物理（蛋白質-蛋白質など ）と機能（ 例えば遺伝子遺伝子または遺伝的）相互作用（GI）1一連の複雑によって決定されます。物理的な相互作用が細菌のタンパク質が複合体として関連付けられているかを示すことができますが、それらは必ずしも経路レベルの機能relationships1を明らかにしない。 2削除または不活性化された遺伝子をもつ二重変異株の増殖を測定し、対応する単一の変異体と比較されるGIの画面は、遺伝子座の間の上位性の依存性を照らすそれゆえ小説機能的関係2を照会し、発見するための手段を提供することができる。大規模GIマップは酵母3月7日のような真核生物のために報告したが、GIの情報は、細菌ゲノムの機能アノテーションを妨げる原核8日のための疎のままされています。この目的のために、我々と他の人は、ハイスループット定量的な細菌性胃腸スクリーニング方法（9）（10）を開発しました</&gt;（商標）。 ここでは、定量的なEを実行するために必要な主要な手順を提示全身的に生成し、コロニー配列形式の二重変異体の多数の適合度を測定するために自然な細菌接合と相同組換えを用いて大腸菌ゲノムスケールの9の合成遺伝子アレイ（eSGA）スクリーニング手順は、 簡単に述べると、ロボットを転送するために使用され、共役を介して、クロラムフェニコール（Cm） - 著しいF-レシピエント株 - （組換えの高周波）エンジニアリングHFRから変異アレルをマーク &#39;ドナー株&#39;カナマイシン（菅）の規則正しい配列にします。一般的に、我々はに機能喪失型の非必須遺伝子欠失をもつ単一突然変異（ &#39;慶應義塾&#39;コレクション11 など ）と必須遺伝子hypomorphic変異（還元タンパク質の発現、安定性、または活動9、12、13を付与する 、すなわち対立遺伝子）を使用非必須と必須遺伝子の機能アソシエーション、resを問い合わせるpectively。相同組換えによる共役とその後の遺伝子交換を媒介した後、得られた二重変異体は、両方の抗生物質を含有する固体培地上で選択されています。伸長した後、プレートをデジタル画像化されるとコロニーサイズを定量的に社内自動画像処理システム14を用いて採点されます。二重変異体の成長率はどちら有意に良好または9予想以上に悪化しているときにGISは明らかにされています。悪化（または負）GISは、多くの場合、同じ基本的なプロセス2に当たる代償経路からの遺伝子のペアにおける機能喪失型変異との間に生じる。ここでは、単一の遺伝子の損失は、単一の変異が生存可能であるように、バッファリングされます。しかし、両経路の損失は有害であると合成致死性または病気（ すなわち低成長）が返されます。逆に、緩和（または正）の相互作用と同じ経路またはタンパク質複合体2の遺伝子の間に発生する可能性がありますいずれかの遺伝子の欠失だけでは、多くの場合、追加摂動はさらに、活性を低下させるため、成長しないような経路または複合体の正常な機能を混乱させるのに十分である。全体的に、体系的にGIのネットワークを識別し、分析することは、他の手法では見逃さ経路レベルの情報が9推測することができ、そこから多数の遺伝子間の機能的関係の公平、グローバルマップを提供することができます。

GIは遺伝子間の機能的関係を明らかにします。同様に、同一パスウェイ上の遺伝子は類似したGIパターンを示し、GIプロファイルの類似性は表現型の合致度を表すため、GIプロファイルをクラスタリングすることで機能的に関連する遺伝子をパスウェイとしてグループ化できます。GIおよびGI相関ネットワークを、物理的相互作用情報やゲノムコンテキスト（GC）関係などの他の関連データと統合することで、細菌におけるコアとなる生物学的システム（およびシステム間のクロストーク）を規定する高次機能モジュールの構成を明らかにすることも可能です。例えば、酵母4, 6, 7, 26と同様に、緩和的な相互作用を示し、かつGIプロファイルに高い相関があるE. coliの遺伝子ペアは、物理的に結合している（e.g.複合体を形成する；Figure 4a）か、または共通の生化学的パスウェイで協調的に作用する（e.g.線形カスケードの構成要素）タンパク質をコードする傾向があります。代表的な例がFigure 4bに示されており、必須のFe-S生...

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述<em&gt;大腸菌</em&gt;。

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

表現型は、物理的（例：タンパク質-タンパク質）および機能的（例：遺伝子-遺伝子または遺伝的）相互作用（GI）という複雑な一連の相互作用によって決定されます。一方で...

この手順の目的は、細菌の遺伝子とパスウェイの間の機能的な関係を調査することです。これは、まず、接合または交配させるための単一変異株であるceia coliのアレイを調製することによって達成されます。第2のステップは、単一変異株をプレート上でアレイ形式で接合させることです。次に、二重変異体を回収します。最終ステップとして、二重変異体のプレートをイメージングし、二重変異体コロニーを定量化して菌株の適応度を決定します。最終的に、コロニーサイズのデータを解析して遺伝子相互作用スコアを算出し、機能的に相互作用する遺伝子、パスウェイ、およびプロセスを特定します。ランダム変異導入などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、多数の個別の二重変異株を作製できることです。さらに、遺伝子のサイズ、必須性、または単一遺伝子変異株の適応度に関係なく、多くの遺伝子間の相互作用を同時に評価できます。この方法は、遺伝子機能や、パスウェイおよびプロセスの間の機能的なクロストークに関する疑問など、システム生物学分野における重要な問いへの回答に役立ちます。この手法の意義は、細菌感染症の治療にまで及びます。なぜなら、機能的に中心となるほとんどの遺伝子やプロセスに関する知見、および細菌の遺伝子、経路、プロセスのどの組み合わせを摂動させれば細菌の適応度（fitness）が向上または低下するかという理解があれば、最も効果的な介入戦略を開発できるためです。本プロトコルの開始にあたり、記述された手順に従い、2ステップのネステッドPCR増幅を用いて、標的オープンリーディングフレームをPKD3プラスミド由来のクロラムフェニコール耐性マーカーに置換します。目的産物であることを確認し、製造元のプロトコルに従って得られたフラグメントをPCR精製します。PCR産物を30 µLの滅菌蒸留水で溶出した後、濃度が約50 mg/µLになるように希釈します。精製した産物は、形質転換まで-20 °Cで保存します。次に、ドナー構築用の高頻度組換え（HFR）Cavalコンピテント細胞を調製します。まず、HFR Cavalli株の飽和したオーバーナイト培養液1 mLを、50 mg/mL Ampicillinを35 µL添加した新鮮なLB培地70 mLが入った250 mLフラスコに接種します。吸光度が約0.5から0.6になるまで、220 RPMで緩やかに振盪しながら32 °Cで培養します。次に、Lambda Red組換えシステムの熱誘導を行うため、培養液をウォーターバスに移し、160 RPMで振盪しながら42 °Cで15分間保持して誘導を停止させます。その後、培養液を冷却した氷 slush ウォーターバスに移し、160 RPMで10分から20分間静置します。形質転換まで細胞を低温に保ってください。記載されたプロトコルに従って細胞を洗浄し、遠心分離で回収した後、上清を捨て、ペレットを500 µLの氷冷した10% glycerol Eloquaに再懸濁します。細胞を50 µLずつ個別の冷却済み1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注し、直ちに形質転換に進みます。精製した遺伝子欠損カセットを100 nanograms、コンピテントセルに加えます。チューブを軽く叩き、懸濁液を氷上で5分間静置します。その後、懸濁液をあらかじめ冷却したエレクトロポレーションキュベットに移し、直ちに細胞混合物を電気穿孔します。室温のSOC培地を1 mL加え、エレクトロポレーション後の細胞を15 mLの培養チューブに移します。220 RPMでオービタルシェイクを行いながら、32 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を4,400 ×gで5分間遠心分離します。室温で、上清を約850 µL取り除き、残った液体で細胞ペレットを再懸濁します。細胞を17 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLBプレートに塗布し、32 °Cで一晩インキュベートします。翌日、2つの個別の形質転換体をLBクロラムフェニコールプレートにストリーキングして変異を確認します。同様の形質転換体をLBカナマイシンプレートにストリーキングし、菌株がカナマイシン耐性ではないことを確認します。次に、記載されているプロトコルに従い、3組の異なるノックアウト確認用プライマーを用いてDNAを増幅させます。1組目のプライマーセットは、標的領域の200 bp上流に位置する20ヌクレオチドのフランキングフォワードプライマーと、クロラムフェニコール耐性カセットに相補的なリバースプライマーで構成されています。この増幅により、445ヌクレオチドのアンプリコンが生成されることが期待されます。2番目のセットには、クロラムフェニコール耐性カセット配列にアニーリングするフォワードプライマーと、欠損遺伝子の3'末端から200 bp下流にアニーリングするように設計されたリバースフランキング確認プライマーが含まれています。この増幅反応では、309ヌクレオチドのアンプリコンが生成されることが期待されます。3番目のPCRには、上流および下流の両方のフランキングプライマーが含まれています。この反応は、選択した株が、一方の遺伝子座がカセットに置換され、もう一方が重複して野生型遺伝子のコピーが保持されたままの、狭義の二倍体ではないことを確認するために必要です。この増幅では、1.4 KBの産物が得られることが予想されます。E. coli K-12の非必須単一遺伝子欠損変異体コレクションを、ロボットを用いて24 384プレートにレプリカプレートしました。各ウェルに80 µLの液体LB培地を満たしたマイクロプレートを用意します。これに50 µg/mLのカナマイシンを添加します。ポジティブコントロールとして、またプレートの標準化および自動コロニー定量化を補助するために、カナマイシン耐性株を導入します。各プレートの最外周のウェルから接種した培地を取り除いて新しいプレートに移し、最外周のウェルは空の状態にします。同様に、各プレート内の別の場所から任意の2つの菌株を取り除き、それらを新しいプレートに転移させることで、ネガティブコントロールスポットを作成します。次に、境界コントロールウェルとネガティブコントロールウェルを含む空のウェルに、17 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLV培地を満たします。これらのネガティブコントロールスポットは、レシピエントおよび二重変異体プレートにおいて空になると予想されます。これらは、イメージングの番号付けやプレートのピンニング時に、処理またはプレート操作の誤りがなかったことを確認するために行います。記載の手順に従って境界陽性株を調製した後、アレイ株および境界陽性株を32 °Cで190 RPMのオービタルシェイキングを加えながら一晩培養します。翌日、境界ウェルに一晩培養した液を約80 µL分注します。組み立てられたプレートは、次のセクションで説明する交配に使用できます。あるいは、長期保存の場合、受容プレートの各ウェルに15% glycerolを添加し、培地とglycerolを混合します。その後、プレートを-80°Cで保存します。交配手順を開始するため、クロラムフェニコール耐性カセットで標識されたクエリ遺伝子欠損を持つHFRドナー株を、17 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLB液体富栄養培地を用いて32°Cで一晩培養します。THオーダーのレシピエント変異株コレクションを、50 µg/mLのカナマイシンを添加した固形LBプレートに384コロニー密度で播種しました。同時に、ドナークエリ変異株を同数のLBプレートに384コロニー密度でピンニングしました。17 µg/mLのクロラムフェニコールを添加します。菌株を接合させるため、プレートを32 °Cで一晩インキュベートします。3枚の84コロニー一晩ドナープレートから、ドナーを固形LBプレートにピンニングします。次に、1枚の384コロニー受容体プレートから、新たにピンニングしたドナー上の各株にピンニングし、一晩静置します。ピンニングした接合プレートを32 °Cで16〜24時間インキュベートします。続いて、各384密度の接合プレートを、クロラムフェニコールを含む単一のLB固形培地プレートにピンニングします。すべての接合プレートのピンニングが完了するまで、このプロセスを繰り返します。ピンニングした一次選択プレートを32°Cで16〜36時間インキュベートします。インキュベーション後、各一次選択プレートを1536 SPOTフォーマットの二次二剤選択プレートに再度ピンニングし、各一次選択コロニーが4つのコロニーとして転写されるようにします。2枚目の選択プレートにおいて、プレートを16から36時間インキュベートします。32 °Cで最終的な二重変異体選択プレートを撮影し、変異体の増殖適応度を定量的に測定し、遺伝子ペア間の相互作用を解析します。同じ経路にある遺伝子は密接に相関したGIパターンを示すため、機能的に関連する遺伝子を、Sスコアプロファイルの全体的な類似性に基づいてクラスタリングすることでグループ化できます。GIプロファイルの類似性は、2つの遺伝子を変異させた際の表現型の整合性を表しており、これら2つの遺伝子が同一または重複するパスウェイで作用しているかどうかの指標となります。ここでは、物理的に相互作用するタンパク質をコードする遺伝子ペアと、ランダムに抽出した遺伝子ペアの間におけるGIプロファイルの相関係数の分布を示しています。精子の排出に必要なヘテロ三量体複合体を形成する2つのトランスポーターについて、相関する遺伝的プロファイルの散布図の例を、酵母のecoline遺伝子の例とともに示します。高度に相関したGIプロファイルを持つ相互作用を軽減すると、物理的に関連している経路や、共通の生化学的経路において協調的に機能する経路がコードされる傾向があります。ここでは、不可欠なプロセスに共同で関与する機能的に冗長なISCおよびSUF鉄硫黄生物合成経路の構成要素が、広範な悪化相互作用によって互いに連結された個別のクラスターを形成している代表的な例を示します。統計的指標を用いることで、特定の経路の組み合わせ間における相互作用の有意な濃縮を検出したり、GIネットワークと物理的相互作用、およびゲノムコンテキストなどの他の機能的関連データと統合したりすることが可能です。相関関係を明らかにすることで、細菌におけるコア生物学的システムを規定する高次機能モジュールの構成を解明できる可能性があります。また、クラスター解析をゲノムアイランド（GI）ネットワークに適用し、アノテーション済み遺伝子の機能を予測することも可能です。ただし、クラスタリングアルゴリズムは多様であるため、注意が必要です。ただし、クラスタリングによって決定された推定機能割り当てには、独立した実験的検証が必要です。この手順を行う際は、必要なすべての陽性と陰性の対照を組み込むことが重要です。また、特定の遺伝子機能や、遺伝子とパスウェイ間の機能的関係の性質に関するさらなる疑問を解消するために、プロテオミクス、生化学的な追試、ケミカルゲノミクスなどの他の手法を併用することができます。このビデオを視聴することで、二重変異株の構築、受容体アレイの組み立て、およびE. coliにおける遺伝子とプロセスの機能的関係を調査するためのESGAスクリーニングの実施方法について、十分に理解することができます。

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細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング

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