細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング大腸菌合成遺伝子配列を用いて

この手順の目的は、細菌の遺伝子と経路の間の機能的関係を調査することです。これは、最初にceia coli、結合または交配される単一の突然変異株の配列を準備することによって達成されます。2番目のステップは、プレート上に配列形式で単一の変異体を結合することです。

次に、二重変異体が選択されます。最後のステップは、二重変異体プレートを画像化し、二重変異体コロニーを量子化してひずみ適応度を決定することです。最終的に、コロニーサイズのデータを分析して、遺伝的相互作用スコアを計算し、機能的に相互作用する遺伝子、経路、およびプロセスを特定します。

この手法の主な利点は、ランダム突然変異誘発のような既存の方法よりも、多くの個々の二重変異株を作成できることです。さらに、多くの遺伝子間の相互作用は、遺伝子のサイズ、必須性、または単一遺伝子変異体の適応度に関係なく、同時に評価できます。この方法は、遺伝子機能やパスウェイとプロセス間の機能的クロストークに関連する問題など、システムバイオロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の意味合いは、細菌感染症の治療にまで及びます。なぜなら、最も機能的に中心的な遺伝子およびプロセスに関する知識、ならびに、摂動されたときの細菌の遺伝子、経路およびプロセスのどの組み合わせの理解が、細菌の適応度を改善または減少させるかの理解が、最も効果的な介入戦略を開発するのに役立つからです。2ステップのネスト。PCR増幅は、文書化された手順に記載されているように、ターゲットのオープンリーディングフレームをPKD 3プラスミドからのクロラムフェニコール耐性マーカーに置き換えるために使用されます。

期待される製品を確認し、得られたフラグメントをメーカーのプロトコルに従ってPCR精製します。PCR産物を30マイクロリットルの滅菌蒸留水で溶出した後、マイクロリットルの濃度あたり約50ミリグラムに希釈します。精製された生成物は、形質転換前にマイナス20°Cで保存されます。

次に、ドナー構築用の高頻度組換え細胞またはHFR Cavalコンピテントセルを調製します。まず、HFR Cavalli株の飽和一晩培養物1ミリリットルを、1ミリリットルあたり50ミリグラムの35マイクロリットルを含む70ミリリットルの新鮮なLB培地に接種します。250ミリリットルのフラスコに入ったアンピシリン。

220 RPMで穏やかに振とうし、約0.5〜0.6の光学密度が得られるまで、32°Cで培養物をインキュベートします。次に、培養物をウォーターバスに移し、ラムダレッド組換えシステムを摂氏42度で15分間熱誘導し、160RPMで振とうして誘導を停止します。培養物を冷やした氷スラリー水浴に160RPMで10〜20分間移します。

形質転換後まで細胞を冷たく保ってください。書かれたプロトコルに記載されているように遠心分離により細胞を洗浄し、回収した後、センナをデカントし、ペレットを500マイクロリットルの氷冷、10%グリセロールEloquaに再懸濁します。50マイクロリットルの容量の細胞を個々の予冷済み1.5ミリリットルのマイクロセントリチューブに入れ、すぐに形質転換に進みます。

100ナノグラムの精製遺伝子欠失、カセットをコンピテントセルに加えます。チューブをフリックし、サスペンションを氷の上に5分間置きます。次に、懸濁液を予め冷却したエレクトロポレーションvete electroに移し、すぐにセル混合物を操作します。

1ミリリットルの室温SOC培地を加え、培地中のエレクトロポレーション細胞を15ミリリットルの培養チューブに移します。細胞を摂氏32度で1時間インキュベートし、220RPMで眼窩振盪を行います。インキュベーション後、Gの4,400倍の細胞を5分間遠心分離します。

室温で、約850マイクロリットルの ?? 酸を取り除き、残りの液体に細胞ペレットを再懸濁します。.1ミリリットルあたり17マイクログラムのクロラムフェニコールを含むLBプレートに細胞を広げ、摂氏32度で一晩インキュベートします。翌日、LBクロラムフェニコールプレート上の2つの個々の形質転換体をストリークアウトし、変異体確認のためにLB缶マイシンプレート上の同じ形質転換体をストリークアウトして、株が缶マイシン耐性ではないことを確認します。

次に、DNAを、書面によるプロトコルに記載されているように、3セットのノックアウト確認プライマーで増幅します。第1のプライマーセットは、標的領域の上流200塩基対に位置する20ヌクレオチド隣接フォワードプライマーと、クロラムフェニコール耐性カセットに相補的なリバースプライマーからなる。この増幅により、445ヌクレオチドアンプリコンが生成されることが期待されます。

第2のセットには、フォワードプライマー、クロラムフェニコール耐性カセット配列へのニーリング、および欠失遺伝子の3つのプライムエンドの下流に200塩基対をane するように設計されている逆側方位確認プライマーが含まれています。この増幅反応により、309ヌクレオチドアンプリコンが生成されることが期待されます。3 番目の PCR には、アップストリームとダウンストリームの両方の隣接プライマーが含まれています。

この反応は、選択された株が、1つの遺伝子座がカセットに置き換えられ、別の遺伝子座が重複しているが、それ以外は野生型の遺伝子コピーがまだ存在する骨髄二倍体ではないことを確認するために必要です。この増幅により、1.4 KB の製品が生成されることが予想されます。e coli ke io単一の非必須遺伝子欠失変異体コレクションは、24 384にロボットで固定されています。

まあ、ウェルあたり80マイクロリットルの液体LB培地を含むマイクロプレート。ミリリットルあたり50マイクログラムの缶マイシンを補充して、ポジティブコントロールとして不足していた境界制御株のためのスペースを確保し、プレートの正規化と自動コロニー量子化を支援します。接種した培地を各プレートの最も外側のウェルから取り出し、新しいプレートに移し、最も外側のウェルを空のままにします。

同様に、各プレート内の異なる位置から任意の2つのひずみを除去し、そのひずみを新しいプレートに移すことにより、ネガティブコントロールスポットを作成します。次に、国境管理井戸とネガティブコントロール井戸を含む空の井戸を、1ミリリットルあたり17マイクログラムのクロラムフェニコールを含むLV培地で満たします。これらのネガティブコントロールスポットは、レシピエントでは空であり、したがって二重変異プレートであると予想されます。

これらは、プレートのナンバリング、イメージング、またはピン留め時に処理エラーやプレートハンドリングエラーがなかったことを確認するのに役立ちます。手順書に記載の通りにボーダー陽性株を調製した後、アレイ株とボーダー陽性株を摂氏32度で一晩成長させ、翌日に190RPMの軌道振とうを行い、約80マイクロリットルの一晩培養でボーダーウェルを充填する。組み立てられたプレートは、次のセクションで説明するように嵌合に使用できます。

あるいは、長期保存のために、レシピエントプレートの各ウェルに15%グリセロールを補充し、培地とグリセロールを混合します。その後、プレートは摂氏マイナス80度で保管されます。クロラムフェニコール耐性カセットでマークされたクエリ遺伝子欠失を、クロラムフェニコールピンのミリリットルあたり17マイクログラムの濃厚なLB液体培地で摂氏32度で一晩中保持するHFRドナー株を成長させることから交配手順を開始します。

THは、3 84コロニー密度のレシピエント変異体コレクションを固体LBプレート上に注文しました。缶マイシンのミリリットルあたり50マイクログラムを補給。並行して、ドナーは3 84コロニー密度の変異株を同じ数のLBプレートに照会します。

1ミリリットルあたり17マイクログラムのクロラムフェニコールを補給。プレートを摂氏32度で一晩インキュベートし、菌株を結合させます。3 84コロニーオーバーナイトドナープレートからドナーを固体LBプレートに固定します。

次に、単一の3 84コロニー一晩レシピエントプレートからの株を、新たにピン留めしたドナーにピン留めします。ピン留めされた標識プレートを摂氏32度で16〜24時間インキュベートします。次に、各384密度標識プレートをクロラムフェニコールを含む単一の固体LBプレートに固定します。

また、マイシンは、すべての標識プレートがピン留めされるまでこのプロセスを繰り返すことができますか?新たにピン留めした最初の選択プレートを摂氏32度で16〜36時間インキュベートします。インキュベーション後、各第1選択プレートを1536 SPOTフォーマットの第2ダブルドラッグ選択プレートに再ピン留めし、各第1選択コロニーが4つのコロニーで表されるようにします。

2番目の選択プレートで、プレートを16〜36時間インキュベートします。32°ossで最終的な二重変異体選択プレートを撮影し、変異体の成長適合性を定量的に測定し、遺伝子ペア間の相互作用を分析します。同じ経路の遺伝子は密接に相関したGIパターンを示すため、機能的に関連する遺伝子は、Sスコアプロファイルの全体的な類似性に従ってクラスター化することでグループ化できます。

GIプロファイルの類似性は、2つの遺伝子の突然変異に対する表現型の一致を表しており、2つの遺伝子が同じ経路で作用するか、重複する経路で作用するかを示す必要があります。ここに示されているのは、物理的に相互作用するタンパク質をコードする遺伝子ペアとランダムに描画された遺伝子ペアのGIプロファイルとの間の相関係数の分布です。精子排泄に必要なヘテロ三量体複合体を形成する2つのトランスポーターの相関遺伝プロファイルの散布図の例を、酵母エコライン遺伝子が示す場合と同様に示しています。

相関性の高いGIプロファイルとの相互作用を緩和すると、物理的に関連する経路、または共通の生化学的経路で首尾一貫して作用する経路がコードされる傾向があります。ここでは、機能的に冗長なISCおよびSUF鉄硫黄生合成経路の成分が、重要なプロセスに共同で関与し、広範な悪化相互作用によって互いにリンクされる異なるクラスターを形成する代表的な例を示します。統計的尺度を使用して、経路の特定の組み合わせ間の相互作用、GIネットワークと物理的相互作用の統合、およびゲノムコンテキストなどの他の機能的関連データに対する有意な濃縮を見つけることができます。

関係性は、細菌の中核的な生物学的システムを定義する高次の機能モジュールの組織を明らかにすることができます。クラスター解析は、アノテーションされた遺伝子の機能を予測するために、GIネットワークにも適用できます。クラスタリングアルゴリズムは異なるため。

ただし、クラスタリングによって決定された推定機能の割り当てには、独立した実験的検証が必要です。この手順を試行する際は、この手順に続いて、必要なすべてのポジティブとネガティブを含めることを忘れないでください。プロテオミクス、生化学的追跡実験、化学ゲノミクスなどの他の方法を実行して、特定の遺伝子機能や、遺伝子と経路間の機能的関係の性質に関する追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、大腸菌の遺伝子とプロセス間の機能的関係を調査するための二重変異株の構築方法、レシピエントアレイの組み立て方法、ESGAスクリーニングの実施方法について十分に理解できるはずです。