複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

本手順の目的は、緑色蛍光タンパク質（GFP）報告遺伝子で標識された複数の欠損を持つ酵母株を作製することである。まず、標的遺伝子の1つがGFP欠損カセットに置換された「プロモンスター」と呼ばれる単一のハプロイド変異体を調製する。次に、プロモンスター株にも導入されている、GMツールキットAおよびGMツールキットαという2セットの二倍体および単倍体選択マーカーを用いて、酵母株の接合と胞子形成により欠損を組み合わせて選別する。

次に、フローサイトメトリーを用いて減数分裂細胞集団から高蛍光細胞を選択し、2つの欠損を持つ株を濃縮します。最終ステップでは、ソートされた株の遺伝子型を確認します。最終的に、得られた株から始めて、交配とフローサイトメトリーによる濃縮を繰り返し行うことで、より多重欠損を持つ株を構築できます。

マーカー再利用のためのG法や逐次的な遺伝子欠損などの既存手法に対する本手法の主な利点は、1サイクルあたりに複数の欠損を導入できるため、多重変異体の構築をより迅速に行える点にあります。このビデオに付随する書面プロトコルに従ってプロモンスター（pro monster）を作製した後、1.6 mL エッペンドルフチューブに確立済みのプロモンスターGFP欠損株の培養液を調製し、有性生殖サイクルを開始します。まず、接合型Aの欠損株を、ヒスタミン欠損合成完全培地（-his培地）100 µLに調製します。同様に、接合型αの欠損株を、ロイシン欠損合成完全培地（-leu培地）100 µLに調製し、空気交換のために1.6 mL エッペンドルフチューブに入れます。

70% ethanolで処理したプッシュピンを用いて、チューブのキャップに穴を開けます。チューブを30 °Cで一晩、水平に回転させます。この際、回転軸をチューブの長軸と平行にする必要があります。

光学密度から推定し、GFP欠損株の haplo 細胞約 250,000 個と alpha haplo 細胞約 250,000 個を 1.6 mL のエッペンドルフチューブ内で混合します。この細胞数は、通常、各 overnight 培養液 7 µL に相当します。これらの細胞を準備するため、まず 800 ×g で 2 分間遠心分離を行います。

上澄みを除去した後、70% ethanolで処理したプッシュピンを用いて、蓋に穴を開けます。空気交換を可能にするため、800 Gで5分間、迅速にボルテックス遠心分離を行い、50 µLのYPDA培地を加えます。その後、空のチップボックス、小型チップスタンド、および濡れたペーパータオルで作成した加湿ボックスにチューブを配置します。

ボックスを30 °Cで一晩インキュベートします。交配混合液10 µLを、抗生物質G 4 1 8およびnatを含むアガロースなしのGNA培地500 µLが入った、蓋を緩めた5 mL培養チューブに移します。この時の600 nmにおける初期光学密度は、およそ0.1となります。この培養物を30 °Cで24時間回転培養します。

これにより、G418およびNatの両方に耐性を持つ二倍体のみが、GMツールキットAのcan MX4およびnat MX4の両方を保持しているため、二倍体を選択することが可能になります。GMツールキットAlphaは、G418およびNatの存在下で増殖可能です。1日培養した培養液20 µLを、G418およびNatを含む500 µLの新鮮なGN培地に移します。600 nmにおける開始時の光学密度は約0.2です。

細胞を対数増殖期にするため、チューブを30 °Cで5時間回転させます。次に、二倍体を相関させ、胞子を単離します。記載されたプロトコルに従い、手順を進めてください。

SPO関連細胞の懸濁液を300 µLずつ2つの分量に分け、それぞれ別々の1.5 mLエンドリフチューブに入れます。チューブを800 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去した後、各チューブの蓋に穴を開けます。

プッシュピンを用いて、1本のチューブのペレットに100 µLのminus his培地を加えます。もう一方のチューブでPTのハプロタイプを選択するため、100 µLのminus leu培地を加え、αハプロタイプを選択します。

チューブを30 °Cで一晩回転させます。600 nmにおける最終的な光学密度（OD600）は0.5未満である必要があります。600 nmにおける光学密度が高くなりすぎる傾向がある場合は、室温で培養してください。

GFPを誘導するために、20 µg/mLのドキシサイクリンを含む新鮮なminus hissまたはminus LU培地100 µLを、各菌株に添加します。ドキシサイクリンの最終濃度は10 µg/mLとなります。チューブをボルテックスし、30 °Cで2日間振盪培養します。

フローサイトメトリーを開始するために、あらかじめろ過したTEバッファー 900 µLを、5 mLポリプロピレンチューブに加えます。この際、チューブのキャップを5 mLポリスチレンチューブのセルストレーナーキャップに交換しておきます。フローサイトメトリーにはポリプロピレンチューブが適しています。ストレーナーキャップは、大きな粒子を除去するために使用されます。

バッファー75 µLをセルストレーナーのキャップ上に静かに滴下します。ピペットのチップをメッシュに押し当てながら、誘導細胞25 µLをキャップ上の溶液に加えます。混合溶液すべてをストレーナーを通してろ過します。

ストレーナーキャップを押し下げ、チューブをボルテックスします。回収用チューブとして、200 µLのminus hissまたはminus lube培地を満たした1.6 mLフェンドルチューブを用意します。セルソーターを起動し、メーカーのマニュアルに従って設定を調整します。

回収チューブをボルテックスして、壁面を培地でコーティングします。また、セルソーターにロードする前に、細胞が入ったチューブもボルテックスしてください。サンプルのフローサイトメトリーデータを取得します。

GFP不含の株を陰性コントロールとして使用できます。細胞凝集塊は高いGFP強度を示す可能性があるため、ソート時にこれらを排除するようにゲートを設定してください。パルス幅とパルス高さのプロット、または前方散乱光（FSC）の面積とFSC高さのプロットを用い、パルス幅またはFSC面積が不当に大きいアウトライヤーを排除します。

細胞凝集塊ではFSCが高くなることが予想されるため、FSCの下位20%の細胞のみを選択してください。細胞デブリが多く見られるFSCおよびサイドスキャッター（SSC）の値が極めて低い領域は避けてください。SSCとGFPシグナルは、しばしば正の相関を示します。

SSC値の高い細胞が濃縮されるのを避けるため、GFP強度とSSCのプロットを用いて、SSC軸上の各点から同等の割合で最も輝度の高い細胞を抽出するように、細胞集団の周辺にゲートを設定します。このステップの前に行われたFSCおよびSSCゲートで選択されたサブポピュレーションの0.1～1%をソート対象としてマークし、200個を回収チューブにソートします。回収チューブをボルテックスし、ソートされた細胞が培地で完全に覆われるようにしてください。

ジェノタイピング用にA-Y-P-D-Aプレート上の細胞の一部を分取します。その後、プレートを30 °Cで2日間培養します。約12個のコロニーを用いてライセートを作成します。

ジェノタイピングの書面プロトコルに記載された手順に従います。フォワードプライマーを用いて、10 µLのPCR反応液で希釈ライセート1 µLを解析します。その10 µLの反応では、各欠失遺伝子のアップストリーム隣接領域にアニールするフォワードプライマーと、すべての欠失遺伝子座内にアニールする共通プライマーを組み合わせて使用します。

PCRは96ウェルまたは384ウェル形式で実施可能です。増幅後、電気泳動を用いてPCR産物を解析します。

目的の遺伝子型を持つ可能性が高いハプロタイプを特定します。これらの株を新しいプレートで継代し、さらに25% glycerolを用いて-80 °Cで凍結保存します。

欠損遺伝子の野生型配列が存在しないことの確認や、フィールドゲル電気泳動後の解析などの追加試験が推奨されます。有用な株を用いて有性サイクルを繰り返してください。2つの株の交配から得られた半数体後代において、GFPを発現させました。

各遺伝子欠損株にはGFPカセットが導入されており、フローサイトメーターを用いてゲートを設定し、得られた細胞集団を選択しました。この集団には、デブリや細胞凝集塊が含まれていないと考えられます。前方散乱光の面積（FSC-A）および前方散乱光の高さ（FSC-H）に基づいて細胞をゲーティングし、最も輝度の高い上位1%の細胞をソートして回収しました。

前方散乱光（FSC）面積が不釣り合いに大きい傾向にある細胞凝集塊は除外した。一方で、前方散乱光と側方散乱光（SSC）に基づき、前方散乱光の下位20%の細胞をゲートすることで、前方散乱光および側方散乱光が最も低いデブリを除外して細胞を回収した。さらに、側方散乱光とGFP信号に基づいてゲートを行い、特定の側方散乱光範囲内でより蛍光強度の高い細胞を抽出することで、myotic mixとGFPを発現しない陰性コントロールサンプルの比較を可能にした。P3集団の選択に使用したものと同一のAGがダイアグラムに示されている。別のハプロイドにおいて同様に選択した陰性コントロール細胞を、GFPを発現するように誘導し、蛍光に基づいてソートした後、PCRで解析した。ランダムな分離の結果として、ソートされていない細胞における想定欠失数は7.5であった。

この特定の実験において、ソートされた細胞の平均欠損数は8.8 ± 0.3であり、これには10箇所の欠損を持つ5つの細胞が含まれていた。DO遺伝型。ソートされた菌株のPCLは、リバースプライマーを用いて実施した。

そのプライマーは、フォワードプライマーと対になる下流側のフランキング領域にアニールします。もう一方はカセットの末端にアニールします。バンドが出現した場合は、GFPカセットが存在することを示しています。

このビデオを視聴することで、酵母における欠損導入にグリーンモンスター法（green Monster Method）を用いる方法について、十分に理解できるはずです。