Name: 複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 学ぶグリーンモンスター法による酵母の複数遺伝子欠失株構築。GFP蛍光マーカーとフローサイトメトリーを用いて、交配サイクルと蛍光選択で多遺伝子欠失株を効率的に作成する手法を解説します。

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この作品はFPRFPRにYSは、RSLにアルフレッド·P·スローン財団からの助成金、そして健康の助成金は、米国国立衛生研究所R01 HG003224とR21 CA130266に米国国防総省の国防高等研究計画庁契約N66001-12-C-4039でサポートされていたことだったまた、先端研究のためのカナダの研究所からの交わりによっておよびカナダの優秀研究チェアプログラムでサポートされている。

1。 ProMonstersの世代<ol><li> テト2-GFPマーカーおよび配列を有するプライマーを用いてプラスミドpYOGM012（アンピシリン耐性）からURA3マーカーを増幅することによって、普遍的なGFPの交換用カセットを準備します。 GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCGとGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT（太字の地域をターゲットに交換できKanMX4カセットの隣接領域との相同性を提供してください）。 PCR反応は、0.5 ng /μLののテンプレートDNA濃度で始まるPhusionポリメラーゼは、HFバッファ、および3％ジメチルスルホキシド（New England Biolabs）で行われるべきである。 PCRプログラムは98 10秒30秒、98℃35サイクル℃で、49℃で30秒のC、1.5分間72℃である。反応容量は、各形質転換実験に十分なDNAを提供すること&gt;を50μlにする必要があります。私たちは、浄化製品には、列ごとに処理PCR反応の〜50μlでQIAクイックPCR精製キット（Qiagen）を用いますが、精製工程を省略すると、形質転換体の収量を増加させることができる。 あるいは、制限酵素EcoRI（New England Biolabs）を用いてプラスミドpYOGM057（アンピシリン耐性）を消化することによって、標的テト2-GFPおよびKanMX4の相同URA3マーカーと同様、領域を含む断片を放出。この反応におけるDNA濃度は約30 ng /μlにする必要があります。反応容量は&gt; 34μLである必要があります。 KanMX4以外の領域にGFPのカセットを統合するための、適切な相同配列に上記のPCRプライマーの相同領域を調整します。 </li><li>ユニバーサルGFPの削除カセットでKanMX4酵母ノックアウトコレクション12からA-ハプロイド株を形質転換。のウッズとGietz 13 0.34μlを別のプロトコルに続いてDNAサンプル（精製されたPCR産物または非精製制限消化）は、各形質転換実験に使用されるべきです。 CAA-裏プレートに形質転換混合物（0.67％酵母窒素ベース、2％グルコース、0.6％カザミノ酸、0.0025％アデニンヘミ、0.005％トリプトファン、2％寒天）のプレート5分の1。 </li><li>単離されたコロニーを得るために新鮮なCAA-浦プレート上で形質転換体のうちストリーク。 </li><li>成長の欠如を確認するために200μg/ mlのG418を含むYPDAプレート上にコロニー由来の細胞を移す。成功したGFPの統合​​を確認するには、手順（1.5）に従う - （1.9）コロニーPCRを行う。 </li><li> 0.2 mlのPCRチューブや96ウェルプレートのウェルに溶解緩衝液2μl（0.1Mリン酸ナトリウム、pH 7.4、ZymoResearchから1ユニットザイモリアーゼ）にコロニーから採取された細胞を追加します。ピペットチップの内と外液をピペッティング。 </li><li> P200ピペットマン（ギルソン）を使用してミネラルオイルを1滴（約20μL）をオーバーレイ。 </li><li> 37℃で混合物をインキュベート95℃で20分、その後のC℃で10分間。 </li><li> 50μlの水で溶解液を希釈します。 10回inとoutソリューションをピペッティングして混和します。 </li><li>上流の隣接領域にアニールは、シーケンスCCTGAGAAAGCAACCTGACC（カセットの先頭から285 bp）のプライマーと組み合わせること、（A）フォワードプライマーと10μlのPCR反応を用いてライセート1μlを、（B）の逆を分析プライマーその一連GCATTGGGTCAACAGTATAG（端から375 bp）のプライマーと対下流領域にアニール（C）の二つの配列がCGTACTCCTGATGATGCATGと（181 bp）のGACGAAATACGCGATCGCTGとKanMX4にアニールするプライマー、及び（D）は、2つのプライマーをその標的遺伝子の野生型配列（ 図4）にアニールする。削除コレクションで株の約8％が14異数性を含むことが知られているので、（D）は重要です。正しい形質転換体は、正の（A）と（B）と（C）と（D）と負になります。 </li><li>紹介する形質転換にGMToolkitは、形質転換株および1.6 mlのエッペンドルフチューブにRY0146（GMToolkit含有）またはRY0148（GMToolkit-αを含む）のいずれかの250,000個の細胞から約250,000個の細胞を追加します。渦。 RY0146 RY0148との遺伝子型はMATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit-[CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-SP-his5]とMATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit-α[CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr·アールLEU2]、それぞれ。 prはプロモーターを意味する。細胞数は、前培養物の光学密度から推定されるべきである。 </li><li> 2分間、800×gで遠心分離します。 </li><li>上清を取り除きます。 </li><li>空気交換を可能にするために、70％エタノールで処理した画鋲を使用して蓋に穴を開ける。 </li><li> YPDA培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース、および0.003パーセントアデニンhemisulfat50μlを追加e）に示す。渦。 </li><li> 5分間800×gで遠心分離します。 </li><li>湿ったボックスにチューブを置きます。これは、空のチップボックス、小さなチップスタンド、湿らせたペーパータオルを使用して作成できます。 </li><li> 30℃で一晩ボックスをインキュベート℃に</li><li>第一は、CAAの浦プレート上の細胞をストリーキングで交尾二倍体を選択してください。 1日のために30℃で静置します。 </li><li>二倍体を選択するための200μg/ mlのG418を含むYPDAプレート上で単離されたコロニー（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース、0.003％アデニンヘミ、2％寒天）を作るためにバルク領域、ストリークからそれらを細胞を取り出す含むGMToolkit-GMToolkit-αを含む二倍体を選択するか、または100μg/ mlのnourseothricin（NAT）15。 </li><li> 3日間30℃で静置します。 </li><li>隔離されたコロニーから始めて、寒天培地（1％酵母エキス、3％ディフコ栄養ブイヨン、5％ブドウ糖なしでGNA培地500μlに細胞の大部分を移す。オートクレーブグルコースとtの残り彼のコンポーネントは別々としてふたが付いている5mlの培養管でカラメル化を避けるために、2×ソリューション）を緩めた。 </li><li> 30℃で5時間、水平管を回転℃に回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 </li><li>で使用されているコロニーを確認して（1.21）裏は、+ CAA-裏板の上にそれらをストリーキングで。 </li><li> 2分間、800×gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。 </li><li>最小限の胞子形成培地（;フィルター滅菌を1パーセント酢酸カリウム、0.005％酢酸亜鉛）500μlを添加する。渦。 </li><li> 2分間、800×gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。 </li><li>リピート（1.25） - （1.26）倍。 </li><li> 7.5μg/ mlのリジン、7.5μg/ mlのロイシン、5μg/ mlのヒスチジン、5μg/ mlのメチオニン、および1.25μg/ mlのウラシル（栄養要求株の胞子形成率を高めるために）を補充した最小限の胞子形成培地1mlを追加。渦。 </li><li> 1日室温でチューブを回転させます。 </li><li> 2日間30℃でチューブを回転させます。 </li><li> 2分間800 xgで1.6 mlのエッペンドルフチュー​​ブに、この混合物の125μLを遠心分離します。上清を捨てる。 </li><li>ザイモリアーゼ溶液（100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、1Mソルビトール、及びZymoResearchからザイモリアーゼ2単位）の50μlを添加する。ピペットチップの内と外液をピペッティング。 </li><li> 1時間30℃でインキュベートする。 </li><li> 0.02％NP-40の50μlを添加する。ピペットチップの内と外液をピペッティング。 </li><li> 5分間室温でチューブのままにしておきます。 </li><li>水500μlを添加する。 </li><li>チューブを氷上に置きます。 </li><li>ソニファイアー450（ブランソン）と3.2 mmのマイクロチップを使用して15秒に1の出力設定（最弱設定）で二回、この混合物を超音波洗浄します。超音波処理の2ラウンドの間、〜0℃に温度を戻すためにチューブを氷上に置く</li><li> 5分間、800×gで遠心する。上清を捨てる。 </li><li> SC-裏彼を200μl加え（a）またはクロスGMToolkitまたはGMToolkit-αを組み込むためのものであるかに応じて、SC-裏レイ（α）の媒体。メディアを準備するには、SC - 裏のHisレイ培地（0.67％酵母窒素ベース、2％グルコース、0.01％アルギニン0.01％、アスパラギン酸、0.01％グルタミン酸、0.01％イソロイシン0.01％、リジン、メチオニン0.01パーセント作る、0.01％フェニルアラニン、0.08％セリン、0.04％トレオニン、0.002％チロシン、0.03％バリン、0.0025％アデニン、0.005％トリプトファン、0.003％アデニン、0.005％トリプトファン）および滅菌ヒスチジンまたはロイシンでそれを補うために、使用前に最終濃度0.01％になる。 </li><li> 70％エタノールで処理した画鋲を使用して蓋に穴をあけます。 </li><li> 2日間30℃で水平にチューブを回転させます。回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 </li><li> SC-裏彼またはSC-裏レイ寒天プレート（上記と同じ成分を加えた2％寒天上の細胞外ストリークは、トレオニンとアスパラギン酸の後に追加する必要がありutoclaving; ProMonster株の単離されたコロニーを作るために）注ぐ前にヒスチジンまたはロイシンを追加します。 </li></ol> 2。性的サイクリング<ol><li> SC-HIS（）または°Cで一晩1.6 mlエッペンドルフチューブを用いて30℃で交配型に応じて、SC-レイ（α）を100μlの確立されたGFPの欠失株の培養物を回転させます。空気交換のために、70％エタノールで処理した画鋲を使って穴を開ける。水平チューブを回転させます。回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 大挙して交配を介して複数の株を横断することが可能です。ソートされたサンプルは、直接2日間30℃で200μlのこの目的は、培養細胞に使用される場合。 SC-裏のHis-Leuの媒体へとヒスチジン（0.01％）またはロイシン（0.01％）：培地を調製し、ウラシル（0.0025％最終濃度）を追加します。 </li><li> 1.6ミリリットルEPPEで250,000半数体細胞とGFP欠失株25万のα-半数体細胞を混ぜるndorfチューブ。渦。 </li><li> （1.17） - 次の手順（1.11）によって、これらの細胞を交配。 </li><li>緩め蓋を5mlの培養チューブに200μg/ mlのG418および100μg/ mlのナットを含む500μlのGNAの媒体に交配混合物10μlを転送します。出発OD 600がおよそ0.1である。 </li><li> 24時間30℃で培養を回転させます。 GMToolkit-αのGMToolkitとNatMX4でKanMX4両方を含む唯一の二倍体は、G418およびNAT（ 図3）の存在下で増殖することができるので、これは二倍体の選択を可能にする。 </li><li> G418とナットを含む新鮮なGNAの500μlに1日間培養液20μlを転送します。出発OD 600がおよそ0.2である。 </li><li>対数期（〜1のOD 600）にセルを持って来るために5時間30℃でチューブを回転させます。 </li><li>二倍体の胞子形成と胞子を分離するために（1.38） - ステップ（1.24）に従ってください。 </li><li> 2つの300-μLに胞子形成細胞の懸濁液を分割部品と別の1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブにそれぞれを置く。 </li><li> 5分間、800×gで遠心する。上清を捨てる。 </li><li> 1チューブのペレットに、-半数を選択するには、SC-Hisを100μlの培地を追加します。他のチューブのペレットには、α-半数を選択するために、SC-Leuの培地100μlを添加する。 </li><li> 30℃で一晩チューブを回転させます。最終OD 600が 0.5未満でなければなりません。 OD 600が高くなりすぎる場合は、室温で培養することを試みる。 </li><li> GFPを誘導するために、新鮮なSC-HIS（）または20μg/ mlのドキシサイクリンを含むSC-レイ（α）を100μlの培地を追加します。ドキシサイクリンの最終濃度は10μg/ mlである。渦。 </li><li> 2日間30℃でチューブを回転させます。 </li></ol> 3。フローサイトメトリー<ol><li>キャップを5 mlのポリプロピレンチューブ（BDファルコン＃352063）に10μg/ mlのドキシサイクリンを含む事前にフィルタ処理されたTEバッファー900μlの液（pH 7.5）を入れると交換セル5 mLのポリスチレンチューブからストレーナーキャップ（BDファルコン＃352235）。ポリプロピレンチューブは、フローサイトメトリーに適しています。ストレーナーキャップは大きい粒子を除去するために望まれている。 </li><li>優しくセルストレーナーキャップのドキシサイクリンをTE緩衝液75μlを置く。 </li><li>キャップで解決策に誘導された細胞の25μlを添加する。 </li><li>メッシュに対してピペットマンの先端を押しながら、ストレーナーを通して統合ソリューションのすべてを撃つ。 </li><li>ストレーナのキャップを押し下げて、ボルテックスチューブ。 </li><li> SC-HisまたはSC-Leuの200μlでフィルされたコレクションチューブ（1.6 mlのエッペンドルフチュー​​ブ）を用意します。 </li><li>セルソーターを起動し、メーカーの説明書に従って設定を調整します。 </li><li>渦両方コレクションチューブ（コートに媒体と壁）とセルソーターにそれらをロードする前に細胞が入ったチューブ。 </li><li>サンプルのフローサイトメトリーデータを取得する。 GFPを含有していない株はネガティブコントロールすることができます。 </li><li>並べ替えのためにゲートを描きます。 （）高いGFPの強度を発揮することができる細胞凝集を避けるために、FSCの高さのプロットとFSCを用いたパルス幅とパルス高MoFloソーター用または不釣り合いに小さいFSCの高さのプロットを用いて前方散乱（FSC）のために過度に大きなパルス幅の外れ値を破棄FACSAriaセルソーター（ 図5、左上のパネル）の領域。 （B）は大FSC（面積）を細胞凝集のために期待されているので、最低FSCおよび側方散乱（SSC）の細胞破片が頻繁に発見された値を使用して領域を回避しながら、唯一、FSCで下位20％に細胞を取る（ 図5、右上のパネル）。 （C）は、SSC（面積）とGFPシグナルは（面積）は、多くの場合、正の相関がある。単に上記ゲート与えられた最も明るい細胞を取っているので、高SSCの値を持つ細胞を濃縮するでしょう、各点から明るい細胞の同様の比率を取るために、GFP強度およびSSCのプロットを用いて人口の周囲に沿ってゲートを描くSSCの軸（ 図5、ボットのOM-左図）。 （C）で選択された集団は、（B）で選択された人口の0.1から1パーセントでなければなりません。 </li><li> （3.10）で与えられた基準とコレクションチューブに200個の細胞をソートします。必要に応じて一斉にプロセスについてや、より複雑な人口を必要とする他のプロジェクトのために、より多くの細胞をソートします。 </li><li>渦コレクションチューブを培地で選別された細胞をカバーする。 </li><li>プレートジェノタイピング用YPDAプレート上の細胞のサブセット（例えば、50セル）。 </li><li> 2日間30℃で静置します。 </li><li> （1.8） - ステップ（1.5）以下〜12個のコロニーのための溶解液を作る。 </li><li>そっと先端を持つプレートに触れることにより、G418およびNATを含むYPDAプレート上のスポットにで使用されるチップ（1.5）上の残りの細胞を移す。選択された半数は、この板の上に育つべきではありません。二倍体はもっとGFPのコピーを持っていることがあるため、明るくなるかもしれません。このテストでは、半数体選択の効率を示すことができます。 </li><li>タイピングについては、10μlのPCR rを用いてライセート1μlを分析するシーケンスCCTGAGAAAGCAACCTGACCのプライマーと対になって削除された各遺伝子の上流隣接領域にアニールすることをフォワードプライマーとeaction。 可能であれば、多重PCR反応（条件は単一の変異体の溶解液を用いて決定することができる）。または384ウェルフォーマット - PCRは96で行うことができます。後者の形式は、わずか5μlの反応容量に適しています。マルチチャンネルピペットまたは液体ハンドリングロボットを用いて行うことができるPCRマスターのアレイ化するプライマー及びこれらの混合物に、細胞溶解物のほかに異なるミックス。異なるPCRミックスに同じライセートを追加するときにチップの変更は省略可能です。 </li><li> PCR産物を分析します。ジェルXLウルトラV-2の電気泳動システム（Labnet）は、マルチチャンネルピペットを用いて試料のローディングと互換性があります。 </li><li>からの情報（3.16）と（3.18）をもとに、遺伝子型を希望している可能性半数体を識別します。 </li><li>新鮮なプレート（YPDA、CAAの浦、またはSC-Ura-His/Leu）にこれらの株を確立します。また、それらの凍結-80℃で25％グリセロール℃、そのような削除された遺伝子およびパルスフィールド·ゲル電気泳動のための野生型配列の有無の確認などの追加テストが推奨されています。 </li><li>有用菌株と（2.1）から性的サイクルを繰り返します。 </li></ol>

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々はグリーンモンスターアプローチを開発したように、我々は、ゲノム再編成につながる、異なるGFPの交換カセット間の組換えの可能性に関心を持っていた。このような事態を軽減することに成功交配と減数分裂の複数のラウンドを受けた細胞のための私達の選択である。再配列ゲノムを持つ細胞は、同一の再調整なしに細胞に交配後少なくフィットすることが期待されています。実際、我々は、GFPカセット11との間の組換えに起因するいかなるゲノム不安定性を観察しなかった。しかし、我々はこの可能性を完全に除外することはできませんので、ユーザーが再配置のために生成された菌株をテストすることをお勧めします。パルスフィールドゲル電気泳動は、総異常を検出するために使用することができます。削除内の配列にアニールするプライマーを用いてPCRを野生型配列の有無を確認するために使用できます。 GF、確立された菌株の蛍光レベルに基づいて、Pの強度は飽和が1〜16の欠失11のテストした範囲内の問題ではないことを示唆している、削除の数とほぼ直線的な関係を持っていた。しかし、多くの非重複欠失を...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や器具の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> G418 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A1720 </td><td> （0.2μmフィルター）を水に溶解し、フィルター滅菌してください。ストック濃度：200 mg / mlである。 4℃で保存する</td></tr><tr><td> ClonNAT（nourseothricin） </td><td>ヴェルナー生体物質</td><td> 5001000 </td><td> （0.2μmフィルター）を水に溶解し、フィルター滅菌してください。ストック濃度：100 mg / mlである。 4℃で保存する</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D9891 </td><td> 50％エタノールに溶解し、フィルター滅菌（0.2μmフィルター）。ストック濃度：10 mg / mlである。 4週間ごとに新鮮なことを確認します。 4でアルミ箔とストアを使用して光からシールド℃の</td></tr><tr><td>ザイモリアーゼ</td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco酵母窒素ベースW / Oアミノ酸</td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td>リボルバー（チューブ用回転子） </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td>エンデューロジェルXLの電気泳動装置</td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td>ソニファイアー450 </td><td>ブランソン</td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td>ソニファイアー450用マイクロチップ</td><td>ブランソン</td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAriaセルソーター</td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFloセルソーター</td><td>ベックマン·コールター- </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FXまたは同等のロボット</td><td>ベックマン·コールター</td><td></td><td>オプション。ジェノタイピングPCRを設定するため。 </td></tr></tbody> &lt;/ TABLE&gt;

複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

遺伝子欠失のための表現型は、しばしば突然変異が特定の遺伝的背景や環境条件1,2でテストされているときにのみ明らかにされています。多くの遺伝子が隠された遺伝子の機能3,4のマスクを解除するために削除する必要がある例があります。重要な発見の可能性にもかかわらず、3つ以上の遺伝子が関与する遺伝的相互作用は、主に未踏されています。マルチ変異体の相互作用の網羅的な検索が欠失の可能な組み合わせの膨大な数のために現実的ではありません。しかし、このような共通機能を共有することの大きいアプリオリの確率でパラログのセットなどの遺伝子の選択セットの研究は、有益であろう。 酵母 Saccharomyces cerevisiaeにおいて、遺伝子ノックアウトは、相同組換えを介した選択マーカーと遺伝子を交換することによって達成されます。マーカーの数が限られているので、このメソッドでは、SAMを削除し、再利用のために開発されている<html>電子マーカー5,6,7,8,9,10。時間が生成される削除の数に比例して直線的に必要なので、これらのメソッドを使用して順次工学複数の変異は時間がかかります。 ここでは、日常的に酵母11に複数の削除を工学のためのグリーンモンスター方法を説明します。この方法では、削除に統合された緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターが定量的に各菌株に含まれる削除の数（ 図1）に記載の菌株にラベルを付けるために使用されています。これらの欠失の多くを運ぶ株のフローサイトメトリー濃縮と相まって酵母の接合と減数分裂を経由して、GFP-著しい失の品揃えの繰り返しラウンドは株の欠失（ 図2）の蓄積につながる。各プロセスがラウンドごとに1つ以上の欠失を組み込むとともに、並行して複数のプロセスを実行し、ひずみ建設に必要な時間が短縮されます。 GFPの削除された遺伝子座でのレポーターや&quot;ツールキット&quot;座·どちらグリーンモンスターGMToolkitまたは少なくともGMToolkit-αの1を運びそれぞれのコンテンツは、 &quot;&gt;と呼ばれる最初のステップは、半数体、単変異体を作製することは&#39;ProMonsters、&#39; can1Δ軌跡（ 図3）酵母削除コレクション12から菌株を用い、GFP顕著な欠失が便利なユニバーサルGFPでこれらの株に存在する共通のKanMX4カセット交換することによって生成することができます- URA3断片を各GMToolkitが含まれています。どちらか-またはα接合型特異半数体選択マーカー1とその2つのマーカーのちょうど1つ、両方GMToolkitsが存在する場合に、一括して二倍体の選択を可能にする。 第二段階は、欠失遺伝子座がランダムな組み合わせ、および/または減数recombにより単一細胞内で組み合わせることができるような性的サイクリングを実施することである交配と胞子形成の各サイクルを伴うもののみ。

4、GFP-著しい欠損を（ycl033cΔyer042wΔykl069wΔyol118cΔ）を運ぶのa-ハプロイド株は4失を運ぶのα-ハプロイド株と交配したとき（ycl033cΔydl242wΔydl227cΔyer042wΔ）、2つの欠失を持つ（ycl033cΔyer042wΔ）2系統、代表で共有結果が得られた。交配混合物は、二倍体を選択するには、G418およびNATを含むYPDA培地で培養した。結果として二倍体は、胞子形成培地で培養した。胞子はザイモリアーゼ治療、超音波処理により分散させ、半数選択培地で発芽させた。次いで、細胞を、GFPを発現するように誘導した。フローサイトメーターでゲートを使用して、細胞の集団は、残骸や細胞凝集体（ 図5）が含まれている可能性は低いことを選択しました。この集団内では、細胞の最も明るい1％がソートされています。選別された細胞とソートされていない細胞は遺伝だった彼らはプレート上のコロニーを形成した後に入力した。ランダムに選択されたコロニーは、いくつ...

グリーンモンスターメソッドは、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子でマークされた複数の削除を迅速に組み立てることができます。このメソッドは、性的失の品揃えや、その他の欠失を保有する細胞の蛍光ベースの濃縮の繰り返しサイクルを通して酵母菌株を駆動に基づいています。

遺伝子欠損による表現型は、特定の遺伝的背景または環境条件下で変異を検証した場合にのみ明らかになることが多くあります1,2。...

本手順の目的は、緑色蛍光タンパク質（GFP）報告遺伝子で標識された複数の欠損を持つ酵母株を作製することである。まず、標的遺伝子の1つがGFP欠損カセットに置換された「プロモンスター」と呼ばれる単一のハプロイド変異体を調製する。次に、プロモンスター株にも導入されている、GMツールキットAおよびGMツールキットαという2セットの二倍体および単倍体選択マーカーを用いて、酵母株の接合と胞子形成により欠損を組み合わせて選別する。次に、フローサイトメトリーを用いて減数分裂細胞集団から高蛍光細胞を選択し、2つの欠損を持つ株を濃縮します。最終ステップでは、ソートされた株の遺伝子型を確認します。最終的に、得られた株から始めて、交配とフローサイトメトリーによる濃縮を繰り返し行うことで、より多重欠損を持つ株を構築できます。マーカー再利用のためのG法や逐次的な遺伝子欠損などの既存手法に対する本手法の主な利点は、1サイクルあたりに複数の欠損を導入できるため、多重変異体の構築をより迅速に行える点にあります。このビデオに付随する書面プロトコルに従ってプロモンスター（pro monster）を作製した後、1.6 mL エッペンドルフチューブに確立済みのプロモンスターGFP欠損株の培養液を調製し、有性生殖サイクルを開始します。まず、接合型Aの欠損株を、ヒスタミン欠損合成完全培地（-his培地）100 µLに調製します。同様に、接合型αの欠損株を、ロイシン欠損合成完全培地（-leu培地）100 µLに調製し、空気交換のために1.6 mL エッペンドルフチューブに入れます。70% ethanolで処理したプッシュピンを用いて、チューブのキャップに穴を開けます。チューブを30 °Cで一晩、水平に回転させます。この際、回転軸をチューブの長軸と平行にする必要があります。光学密度から推定し、GFP欠損株の haplo 細胞約 250,000 個と alpha haplo 細胞約 250,000 個を 1.6 mL のエッペンドルフチューブ内で混合します。この細胞数は、通常、各 overnight 培養液 7 µL に相当します。これらの細胞を準備するため、まず 800 ×g で 2 分間遠心分離を行います。上澄みを除去した後、70% ethanolで処理したプッシュピンを用いて、蓋に穴を開けます。空気交換を可能にするため、800 Gで5分間、迅速にボルテックス遠心分離を行い、50 µLのYPDA培地を加えます。その後、空のチップボックス、小型チップスタンド、および濡れたペーパータオルで作成した加湿ボックスにチューブを配置します。ボックスを30 °Cで一晩インキュベートします。交配混合液10 µLを、抗生物質G 4 1 8およびnatを含むアガロースなしのGNA培地500 µLが入った、蓋を緩めた5 mL培養チューブに移します。この時の600 nmにおける初期光学密度は、およそ0.1となります。この培養物を30 °Cで24時間回転培養します。これにより、G418およびNatの両方に耐性を持つ二倍体のみが、GMツールキットAのcan MX4およびnat MX4の両方を保持しているため、二倍体を選択することが可能になります。GMツールキットAlphaは、G418およびNatの存在下で増殖可能です。1日培養した培養液20 µLを、G418およびNatを含む500 µLの新鮮なGN培地に移します。600 nmにおける開始時の光学密度は約0.2です。細胞を対数増殖期にするため、チューブを30 °Cで5時間回転させます。次に、二倍体を相関させ、胞子を単離します。記載されたプロトコルに従い、手順を進めてください。SPO関連細胞の懸濁液を300 µLずつ2つの分量に分け、それぞれ別々の1.5 mLエンドリフチューブに入れます。チューブを800 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去した後、各チューブの蓋に穴を開けます。プッシュピンを用いて、1本のチューブのペレットに100 µLのminus his培地を加えます。もう一方のチューブでPTのハプロタイプを選択するため、100 µLのminus leu培地を加え、αハプロタイプを選択します。チューブを30 °Cで一晩回転させます。600 nmにおける最終的な光学密度（OD600）は0.5未満である必要があります。600 nmにおける光学密度が高くなりすぎる傾向がある場合は、室温で培養してください。GFPを誘導するために、20 µg/mLのドキシサイクリンを含む新鮮なminus hissまたはminus LU培地100 µLを、各菌株に添加します。ドキシサイクリンの最終濃度は10 µg/mLとなります。チューブをボルテックスし、30 °Cで2日間振盪培養します。フローサイトメトリーを開始するために、あらかじめろ過したTEバッファー 900 µLを、5 mLポリプロピレンチューブに加えます。この際、チューブのキャップを5 mLポリスチレンチューブのセルストレーナーキャップに交換しておきます。フローサイトメトリーにはポリプロピレンチューブが適しています。ストレーナーキャップは、大きな粒子を除去するために使用されます。バッファー75 µLをセルストレーナーのキャップ上に静かに滴下します。ピペットのチップをメッシュに押し当てながら、誘導細胞25 µLをキャップ上の溶液に加えます。混合溶液すべてをストレーナーを通してろ過します。ストレーナーキャップを押し下げ、チューブをボルテックスします。回収用チューブとして、200 µLのminus hissまたはminus lube培地を満たした1.6 mLフェンドルチューブを用意します。セルソーターを起動し、メーカーのマニュアルに従って設定を調整します。回収チューブをボルテックスして、壁面を培地でコーティングします。また、セルソーターにロードする前に、細胞が入ったチューブもボルテックスしてください。サンプルのフローサイトメトリーデータを取得します。GFP不含の株を陰性コントロールとして使用できます。細胞凝集塊は高いGFP強度を示す可能性があるため、ソート時にこれらを排除するようにゲートを設定してください。パルス幅とパルス高さのプロット、または前方散乱光（FSC）の面積とFSC高さのプロットを用い、パルス幅またはFSC面積が不当に大きいアウトライヤーを排除します。細胞凝集塊ではFSCが高くなることが予想されるため、FSCの下位20%の細胞のみを選択してください。細胞デブリが多く見られるFSCおよびサイドスキャッター（SSC）の値が極めて低い領域は避けてください。SSCとGFPシグナルは、しばしば正の相関を示します。SSC値の高い細胞が濃縮されるのを避けるため、GFP強度とSSCのプロットを用いて、SSC軸上の各点から同等の割合で最も輝度の高い細胞を抽出するように、細胞集団の周辺にゲートを設定します。このステップの前に行われたFSCおよびSSCゲートで選択されたサブポピュレーションの0.1～1%をソート対象としてマークし、200個を回収チューブにソートします。回収チューブをボルテックスし、ソートされた細胞が培地で完全に覆われるようにしてください。ジェノタイピング用にA-Y-P-D-Aプレート上の細胞の一部を分取します。その後、プレートを30 °Cで2日間培養します。約12個のコロニーを用いてライセートを作成します。ジェノタイピングの書面プロトコルに記載された手順に従います。フォワードプライマーを用いて、10 µLのPCR反応液で希釈ライセート1 µLを解析します。その10 µLの反応では、各欠失遺伝子のアップストリーム隣接領域にアニールするフォワードプライマーと、すべての欠失遺伝子座内にアニールする共通プライマーを組み合わせて使用します。PCRは96ウェルまたは384ウェル形式で実施可能です。増幅後、電気泳動を用いてPCR産物を解析します。目的の遺伝子型を持つ可能性が高いハプロタイプを特定します。これらの株を新しいプレートで継代し、さらに25% glycerolを用いて-80 °Cで凍結保存します。欠損遺伝子の野生型配列が存在しないことの確認や、フィールドゲル電気泳動後の解析などの追加試験が推奨されます。有用な株を用いて有性サイクルを繰り返してください。2つの株の交配から得られた半数体後代において、GFPを発現させました。各遺伝子欠損株にはGFPカセットが導入されており、フローサイトメーターを用いてゲートを設定し、得られた細胞集団を選択しました。この集団には、デブリや細胞凝集塊が含まれていないと考えられます。前方散乱光の面積（FSC-A）および前方散乱光の高さ（FSC-H）に基づいて細胞をゲーティングし、最も輝度の高い上位1%の細胞をソートして回収しました。前方散乱光（FSC）面積が不釣り合いに大きい傾向にある細胞凝集塊は除外した。一方で、前方散乱光と側方散乱光（SSC）に基づき、前方散乱光の下位20%の細胞をゲートすることで、前方散乱光および側方散乱光が最も低いデブリを除外して細胞を回収した。さらに、側方散乱光とGFP信号に基づいてゲートを行い、特定の側方散乱光範囲内でより蛍光強度の高い細胞を抽出することで、myotic mixとGFPを発現しない陰性コントロールサンプルの比較を可能にした。P3集団の選択に使用したものと同一のAGがダイアグラムに示されている。別のハプロイドにおいて同様に選択した陰性コントロール細胞を、GFPを発現するように誘導し、蛍光に基づいてソートした後、PCRで解析した。ランダムな分離の結果として、ソートされていない細胞における想定欠失数は7.5であった。この特定の実験において、ソートされた細胞の平均欠損数は8.8 ± 0.3であり、これには10箇所の欠損を持つ5つの細胞が含まれていた。DO遺伝型。ソートされた菌株のPCLは、リバースプライマーを用いて実施した。そのプライマーは、フォワードプライマーと対になる下流側のフランキング領域にアニールします。もう一方はカセットの末端にアニールします。バンドが出現した場合は、GFPカセットが存在することを示しています。このビデオを視聴することで、酵母における欠損導入にグリーンモンスター法（green Monster Method）を用いる方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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