複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

グリーンモンスターメソッドは、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子でマークされた複数の削除を迅速に組み立てることができます。このメソッドは、性的失の品揃えや、その他の欠失を保有する細胞の蛍光ベースの濃縮の繰り返しサイクルを通して酵母菌株を駆動に基づいています。

この手順の全体的な目的は、報告された緑色蛍光タンパク質遺伝子でマークされた複数の欠失を持つ酵母の株を生成することです。これは、最初にプロモンスターと呼ばれるハプロ単一変異体を準備することによって達成され、各変異体は標的遺伝子の1つの代わりにGFP欠失カセットを持っています。第2のステップは、GMツールキットAおよびGMツールキットアルファと呼ばれる2組の二倍体およびハプロ選択マーカーを使用して、酵母株の交配およびポリオンを介して欠失を分類することです。

次に、フローサイトメトリーを使用して筋細胞集団から蛍光性の高い細胞を選択し、2つの欠失を持つ株を濃縮します。最後のステップは、選別された株の遺伝子型を確認することです。最終的に、得られた菌株から始めて、交配とフローサイトメトリー濃縮を繰り返すと、より高いオーラムマルチ欠失株が生成されます。

マーカーの再利用および逐次的な遺伝子欠失のためのG方法のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、サイクルごとに複数の欠失を取得できることであり、その結果、マルチミュータントのより迅速な組み立てが可能になるこのビデオに添付された書面によるプロトコルに記載されているように、プロモンスターの生成に続いて、1.6ミリリットルのeendオーフチューブで確立されたプロモンスターGFP欠失株の培養を準備することにより性的サイクリングを開始します。ヒスタミンを欠く合成完全培地の100マイクロリットルで嵌合タイプAの菌片をマイナス彼の培地として参照して、欠失、配光型Aの株を準備します。また、ロイシンを欠く合成完全培地100マイクロリットル、または空気交換用の1.6ミリリットルのeendオーフチューブ内のマイナスlu培地中の嵌合型αの欠失株を調製します。

70%エタノールで処理されたプッシュピンを使用して、チューブのキャップに穴を開けます。チューブを摂氏30度で一晩水平に回転させます。回転軸は、チューブの長手方向軸と平行である必要があります。

光学密度から推定すると、1.6ミリリットルのeinorチューブに約250, 000のaハプロ細胞と250, 000のアルファハプロ細胞がGFP欠失株を混合しました。この細胞数は通常、各一晩の培養ボルテックスの7マイクロリットルに対応します。細胞は、最初に800Gで2分間遠心分離することにより、これらの細胞を作製します。

仰臥位を取り出した後、70%エタノールで処理したプッシュピンを使用して蓋に穴を開けます。空気交換を可能にするために、500マイクロリットルのYPDA培地をクイックボルテックス遠心分離機に続いて、800Gで5分間ゲインを追加します。次に、空のチップボックス、小さなチップスタンド、濡れたペーパータオルで作成した湿ったボックスにチューブを置きます。

ボックスを摂氏30度で一晩インキュベートします。10マイクロリットルの嵌合混合物を、抗生物質G4 1 8およびnatを含有する寒天を含まない500マイクロリットルのGNA培地に500マイクロリットルのGNA培地に移し、蓋を緩めた5ミリリットルの培養チューブで、開始光学密度が600ナノメートルであるおよそ0.1である。培養物を摂氏30度で24時間回転させます。

これにより、両方を含む二倍体のみがGMツールキットAのMX 4とnat MX fourのMX 4を設定できるため、二倍体を選択できます。GMツールキットでは、アルファはG、4、18、Natの存在下で成長することができ、1日の文化の20マイクロリットルをG、4、18、ネットを含む新鮮なGN培地の500マイクロリットルに転送します。600ナノメートルでの開始光学密度は約0.2です。

チューブを摂氏30度で5時間回転させて、細胞を対数相にします。sには、二倍体を相関させ、胞子を分離します。書面によるプロトコルに概説されている手順に従ってください。

SPO関連細胞の懸濁液を2つの300マイクロリットル部分に分割し、それぞれを別々の1.5ミリリットルのeendオーフチューブに入れるに進みます。チューブを800Gで5分間遠心分離します。S上清を取り除いた後、各チューブの蓋に穴を開けます。

プッシュピンを使用して、1本のチューブのペレットに100マイクロリットルのマイナス彼の媒体を追加します。他のチューブのPTにハプロを選択するには、マイナストイレミディアムの100マイクロリットルを追加します。アルファハプロを選択します。

チューブを摂氏30度で一晩回転させます。600ナノメートルでの最終的な光学密度は0.5未満である必要があります。600ナノメートルでの光学密度が室温でトリオールが高すぎる傾向がある場合。

GFPを誘発するには、100マイクロリットルの新鮮なマイナスヒスまたはミリリットルあたり20マイクログラムのドキシサイクリンを含むマイナスLU培地をさまざまな株に加えます。ドキシサイクリンの最終濃度は1ミリリットルあたり10マイクログラムです。チューブを渦巻き、摂氏30度で2日間回転させます。

フローサイトメトリーを開始するには、5ミリリットルのポリプロピレンチューブに900マイクロリットルのプレフィルターTEバッファーを加え、キャップを5ミリリットルのポリスチレンチューブのセルストレーナーキャップに交換します。ポリプロピレンチューブはフローサイトメトリーに適しています。ストレーナキャップは、大きな粒子を除去するために望まれます。

75マイクロリットルのバッファーをセルストレーナーキャップにそっと置きます。誘導した細胞の25マイクロリットルをキャップの溶液に加え、パープの先端をメッシュに押し付けます。組み合わせた溶液をすべてストレーナーに通します。

ストレーナキャップを押し下げ、チューブを渦巻きにします。200マイクロリットルのマイナスヒスまたはマイナス潤滑油媒体で満たされた1.6ミリリットルのフェンダーチューブのコレクションチューブを準備します。セルソーターを起動し、メーカーのマニュアルに従って設定を調整します。

収集チューブを渦巻きにして、壁をメディウムでコーティングします。また、セルソーターにロードする前に、セルを含むチューブをボルテックスします。サンプルのフローサイトメトリーデータを取得します。

GFPのない株はネガティブコントロールになる可能性があります。高いGFP強度を示す可能性のある細胞凝集体を避けるために、ソーティング用のゲートを描画します。パルス幅とパルス高さのプロット、または FSC 面積と FSC 高さのプロットを使用して、前方散乱の省略形 FSC のパルス幅またはパルス幅または面積が不釣り合いに大きい外れ値を破棄します。

細胞凝集体には大きなFSCが予想されるため、FSCでは下位20%の細胞のみを取ります。FSCと側方散乱光、または細胞の破片がよく見られるSSCの値が最も低い領域は避けてください。SSCとGFPのシグナルは、多くの場合、正の相関があります。

高い SSC 値で細胞が濃縮されるのを避けるには、GFP 強度と SSC のプロットを使用して、集団の周辺に沿ってゲートを描画し、SSC 軸に沿って各ポイントから最も明るい細胞の同程度の割合を採取します。このステップの前に FSC ゲートと SSC ゲートを使用して選択した亜集団の 0.1 から 1% を、ソーティング 200 をコレクションチューブに分類するようにマークする必要があります。収集チューブをボルテックスして、選別された細胞を中プレートで覆います。

ジェノタイピング用のA-Y-P-D-Aプレート上の細胞のサブセット。インキュベーション後2日間、プレートを摂氏30度でインキュベートします。約12コロニーのライセートを作製します。

ジェノタイピングの書面によるプロトコルに概説されている手順に従います。フォワードプライマーを用いた10マイクロリットルのPCR反応を用いて、希釈したライセート1マイクロリットルを分析します。その10は、すべての欠失遺伝子座内で10がひざまずく共通のプライマーと対になった各欠失遺伝子の上流の隣接領域にひざまずきます。

PCRは96または3 84で行うことができます。増幅に続く井戸のフォーマット。電気泳動を使用してPCR産物を分析します。

目的の遺伝子型を持つ可能性が高いハプロを特定します。これらの株を新鮮なプレートに確立します。また、マイナス80°Cで25%グリセロールで凍結します。

欠失遺伝子の野生型配列が存在しないことの確認や、フィールド後のゲル電気泳動などの追加の試験が推奨されます。有用な株で性的サイクリングを繰り返します。2つの系統の交配からのHaploの子孫は、GFPを発現するように誘導されました。

各遺伝子欠失は、フローサイトメーターを備えたゲートを使用してGFPカセットを有し、得られた細胞の集団を選択した。この集団内に破片や細胞凝集体が含まれている可能性は低いです。最も明るい1%の細胞を、前方散乱面積および前方散乱高さに基づいてゲーティングセルによって選別し、保持した。

散乱領域が不釣り合いに大きい傾向があるか、または前方散乱細胞および前方散乱細胞を基にして細胞をゲーティングすることにより排除される細胞凝集体を、前方散乱およびGFPシグナルに基づいて細胞をゲーティングすることにより、前方散乱および側方散乱が最も低い日破片を除外し、前方散乱および側方散乱を許容し、 所与の側方散乱範囲にあるものの中でより多くの蛍光細胞を採取し、ミオティックミックスとGFPA GAを発現しないネガティブコントロールサンプルをP3集団の選択に使用したものと同一に比較できるようにした。同様に選択されたネガティブコントロールの細胞については、別のハプロスでGFPを発現するように誘導した後、PCRで分析し、蛍光に基づいて選別しました。ランダムな分離の結果としてソートされていないセルの予想される削除数は 7.5 でした。

この特定の実験では、選別された細胞の平均欠失数は8.8プラスマイナス0.3で、10個の欠失を含む5つの細胞が含まれていました。DO遺伝子型。選別した株PCLは、リバースプライマーを用いて行った。

その10は、フォワードプライマーとペアになった下流の側面領域にひざまずきます。その10はカセットの端にひざまずきます。バンドの存在は、GFPカセットの存在を示します。

このビデオを見た後、グリーンモンスター法を使用して酵母の欠失を設計する方法をよく理解しているはずです。