げっ歯類における腸運動と腸壁の炎症の機能評価：腸管操作の標準化されたモデルで分析

以下の一連の実験の全体的な目的は、げっ歯類モデルにおいて腸管操作を行い、術後イレウスの発生および消失を検討することである。これは、2本の湿らせた綿棒の間で小腸を標準的な方法で操作することによって達成される。次に、胃腸および結腸の通過時間を解析し、術後の運動性を測定する。その後、炎症レベルを調べるため、小腸の筋層外膜の組織化学的分析および器官培養を行う。

好中球顆粒球の腸管への強い浸潤と、腸管培養における一酸化窒素の過剰産生が認められ、その結果、胃腸および結腸の通過時間が遅延することが示されました。この手法は、術後腸閉塞の発症と解決に関する重要な疑問への回答や、潜在的な予防法または治療法の検討に役立ちます。本手順の実演は、当研究室の技術者であるMario Lewisonが行います。雄マウスに酸素中で0.8～1%のイソフルランを投与した後、動物を仰臥位に置き、粘着テープで四肢を固定します。

軽い疼痛刺激を与えて、深い鎮静状態にあるかを確認します。次に、長さ2 cmの中央開腹術を行います。続いて、2つの滅菌リトラクターを挿入して腹部を開いたままにし、小腸を慎重に左側へ翻転させ、濡らした脱脂綿の上に置きます。

2本の湿らせた綿棒を使用し、綿棒を孔（pori）から盲腸まで同時に転がしながら、小腸全体の管腔内容物を除去します。虚血や機械的閉塞を防ぐため、腸管をねじれないようにして腹腔内に戻します。その後、5.0ポリアミド非吸収性縫合糸を用いて2層の連続縫合を行い、腹部の切開創を閉鎖します。

動物を保温ランプの下に置き、麻酔から回復するまで観察します。その後、マウスをケージに戻し、餌と水を与えます。翌日。

マウスを完全に麻酔した後、頭部を慎重に過伸展させ、鈍的なピンセットを用いて舌を引き出します。1 mL シリンジに 100 µL 以上のフルオレセイン標識デキストランを満たします。これを動脈カテーテルに接続し、カテーテルを胃管として胃の中に慎重に挿入します。100 µL の FITC デキストランを速やかに注入し、カテーテルを抜去します。

動物を意識回復させ、90分間待機します。90分後、マウスを安楽死させ、胃から直腸までの全胃腸管を摘出します。腸をポリスチレンパッドの上に置き、伸展させないように注意してください。

次に、小腸と結腸の全長を測定します。カニューレを使用して、腸管をポリスチレンパッドに固定します。小腸を10等分に、結腸を3等分に分割します。

腸管を規定の位置で切断した後、各セクションを1 mLの Krebs-Henseleit 重炭酸緩衝液（KHB）で1回洗浄します。セクションを順次ラベルを付けた2 mLチューブに移し、激しくボルテックスして遠心分離します。その後、上清を清潔な番号付きの1.5 mLチューブに移します。

分析まで4 °Cの暗所で保存します。次に、各上清を100 µLずつ2回、ブラックの96ウェルプレートに分注し、蛍光リーダーでプレートを測定して、動物を毎週麻酔した後の結腸通過時間を確認します。

フィステルを挿入し、結腸の開通性を慎重に確認します。プローブを用いて、肛門から結腸内へと挿入します。直径2mmのガラス球を結腸内に3cmまで挿入し、プローブを抜去します。

直ちにタイマーを開始します。マウスを透明なケージに入れ、糞便が排出されるまでの時間を計測します。これは、中腸サンプルの組織化学的解析のためです。

腸管から組織片を切り出し、シリコン製ディッシュ内の冷えたKHBに浸した後、昆虫針を用いて腸間膜をディッシュに固定します。組織片を腸間膜側に沿って切り開き、長さと幅をそれぞれ120%まで伸展させます。腸間膜側から針を用いて組織を機械的に固定します。

muscularis externa（外縦筋層）または me を tunica mucosa（粘膜層）から分離します。このプロトコルの培養に関する記述に従って、サンプルの固定と染色を行ってください。me。

腸管操作 procedure の 24 時間後、小腸全体を摘出し、ペニシリン G およびストレプトマイシンを含む冷やした KHB に入れる。腸管を 3 cm 長さに切断し、細い鋏を用いて各セグメントをシリコンコーティングされたガラス皿の上にピンで固定する。腸間膜を除去し、鋭いピンセットを用いて腸管をノッディングニードルにスライドさせて固定する。

湿らせた綿棒を用いて、粘膜下組織から緩やかに剥離させ、冷たいKHB（PS添加）に浸します。次に、剥離した粘膜を2〜4 mmの長さに切り分け、氷冷したKHB（PS添加）中で30分間インキュベートします。その後、検体を数回すすぎます。

次に、500 µLのDMEMを含む滅菌済みの24ウェルプレートに、約50〜60 mgの組織を移します。組織を37 °C、5% CO2の条件下で24時間インキュベートします。上清を回収し、1000 RCFで5分間遠心分離します。

次に、サイトカインまたは一酸化窒素の測定のため、液体窒素中で急速凍結させます。最後に、清潔なペーパータオルで筋組織を30秒間吸水し、重量を測定します。術後イレウスの重症度を評価するための最も重要なパラメータは、生体内での胃腸管通過時間（GIT）の検討です。

この図は、手術から24時間後の未処置コントロール群および腸管操作マウスにおける、胃腸管に沿ったFITCデキストランの典型的な分布を示しています。ここに示すように、偽手術（sham）群の動物は正常なGIT（胃腸管通過時間）を示し、算出された幾何学的中心は盲腸にありました。Imは近位空腸におけるGITの有意な遅延を引き起こしましたが、ガラス球を用いた結腸運動性解析では、偽手術マウスは48〜200秒以内に球を排出したのに対し、Imは炎症を測定するために排泄時間を470〜775秒まで延長させました。

ME内の白血球レベルを、ここに示すように組織化学または免疫組織化学を用いて解析しました。対照群のマウスでは多形核好中球はわずかしか観察されませんでしたが、小腸の炎症によりそれらの強い浸潤が誘導されました。細胞から放出された多くの炎症性メディエーターは、組織内で検出することが困難です。

器官培養のライセートを用いることで、培養液中の炎症マーカーの検出が可能になります。上清において、POIの代表的なメディエーターの一つに、胃腸管における主要な抑制性神経伝達物質である一酸化窒素（NO）があります。この図は、meにおいてNOが検出されなかったことを示しています。

対照群の器官培養、および偽手術を施したマウスの培養上清では、nnoの基底レベルが観察されました。しかし、腸管操作を施したマウスの培養物は、24時間のインキュベーション後、有意に多くのnnoを産生しました。この腸管操作の手法に習熟すれば、適切に実施することで15分以内に完了させることが可能です。

このビデオを視聴することで、マウスにおいて術後イレウスを誘発する方法と、その重症度を分析する方法について十分に理解することができます。