げっ歯類における腸運動と腸壁の炎症の機能評価：腸管操作の標準化されたモデルで分析

次の実験の全体的な目標は、腸の操作を行うことです げっ歯類モデルでの術後イレウスの発達と溶解を研究します、これは 2つの湿った綿のアプリケーター間の小腸の標準化された操作によって達成されます。次に、消化管と結腸のトランジットを分析して、術後の運動性を測定します。その後、小腸筋筋、外腸筋、または私の組織化学的分析と臓器培養を行い、炎症のレベルを調べます。

好中球顆粒球のmeへの強い浸潤と、me培養物中の一酸化窒素の過剰産生が胃腸および結腸の通過時間の遅延をもたらすことを示す結果が得られました。この方法は、術後腸骨の開発と解決に関する重要な質問に答えるのに役立ち、潜在的な予防または治療を調査する際に、手順を実証するのは、私たちの研究室の技術者であるマリオ・ルイソンになります 酸素中の0.8〜1%イソフルランをオスマウスに投与した後。動物を仰臥位に置き、粘着テープを使用して四肢を固定します。

わずかな痛みの刺激を使用して、深い鎮静をテストします。次に、長さ2センチメートルの中央開腹術を行います。次に、腹部を開いたままにするために2つの滅菌リトラクターを挿入し、小腸を慎重に左に向け、濡れた綿ガーゼの上に置きます。

2つの湿った綿のアプリケーターを使用して、アプリケーターをポリから盲腸に同時に転がすことにより、小腸全体の管腔内容物を排出します。虚血や機械的閉塞を防ぐためにねじらずに腸を腹腔に戻したり、2層の連続5.0ポリアミド非吸収性縫合糸を使用したりします。腹部切開部を閉じます。

動物を加熱ランプの下に置き、麻酔から回復するまで監視します。次に、マウスをケージに戻し、餌と水にアクセスできるようにします。翌日。

マウスを完全に麻酔した後、慎重に頭を過度に伸ばし、鈍い鉗子を使用します舌を引き出すには、1ミリリットルの注射器にデキストランとラベル付けされた少なくとも100マイクロリットルのフルオレセインを満たします。動脈カテーテルに接続し、カテーテルを胃管として胃に慎重に挿入します。100マイクロリットルのFITCデキストランをすばやく注入し、カテーテルを取り外します。

動物が意識を取り戻すのを待って、90分待ちます。90分後、マウスを安楽死させ、胃から直腸までの胃腸管全体を切除します。腸をポリスチレンパッドの上に置き、ストレッチを避けます。

次に、小腸と結腸の全長を測定します。カニューレを使用して腸をポリスチレンパッドに固定します。小腸を10の等しいセグメントに分割し、結腸を3つの等しいセグメントに分割します。

行進位置で腸を横断した後、1ミリリットルのクレブスヘリ、重炭酸緩衝液、またはKHBで切片を一度洗い流します。切片を連続して標識された2ミリリットルチューブに移し、プローブを激しく遠心分離します。次に、スーパーナットをきれいな番号の付いた1.5ミリリットルのチューブに移します。

分析まで、暗所で摂氏4度で保管してください。次にピペット。各上清の100マイクロリットルのアリコートを黒い96ウェルプレートに複製し、蛍光リーダーを使用してプレートを読み取り、結腸の通過時間を確認します。

瘻孔を挿入して結腸の開存性を慎重に調べます。プローブを使用して、肛門から結腸までプローブします。2ミリメートルのガラス球、3センチメートルを結腸に挿入し、プローブを取り外します。

すぐにタイマーを開始します。マウスを透明なケージに入れ、ボールが排泄されるのにかかる時間を監視します。ミッドトールサンプルの組織化学分析用。

腸から組織セグメントを切断し、シリコンを充填した皿の冷たいKHBに浸した後、昆虫針を使用して腸間膜を皿に固定します。腸間膜の境界に沿ってセグメントを切り開き、組織をその長さと幅の120%に伸ばします。腸間膜から始まる針で組織を固定します。機械的。

外筋筋または私を粘膜から分離します。このプロトコルの書かれた部分に従ってサンプルを固定し、培養します。私です。

腸操作手順の24時間後、小腸全体を切除し、ペニシリン、G、ストレプトマイシンを含むKHBを冷やします。.腸を3センチの長さに切り、細いハサミを使用してシリコンコーティングされたガラス皿に各セグメントを固定します。腸間膜を取り外し、鋭い鉗子でうなずく針に腸をスライドさせます。

しっとりとしたコットンアプリケーターを使って、やさしくインキュンします。粘膜下組織から剥がし、KHBとPsを併用して冷やします。次に、MEストリップを2〜4mmの長さに切り、氷冷したKHBとPSで30分間インキュベートします。標本を数回すすぎます。

次に、約50〜60ミリグラムの私を500マイクロリットルのDMEMを含む滅菌24ウェルプレートに移します。組織を摂氏37度、CO25%で24時間インキュベートします。上清を回収し、1000 RCFで5分間遠心分離します。

その後、スナップして液体窒素で凍結し、サイトカインまたは一酸化窒素を測定します。最後に、きれいな紙のティッシュブロットを使用して、筋肉組織を30秒間乾燥させ、体重を量ります。術後イレウスの重症度を評価するための最も重要なパラメーターは、 胃腸トランジットまたはGITinvivo。

この図は、手術の24時間後に未治療のコントロールと腸を操作したマウスの胃腸管に沿ったFITCデキストランの典型的な分布を示しています。ここに示すように、偽の手術を受けた動物は、盲腸に計算された幾何学的中心を持つ正常なGITを示しました。Imは近位空腸のGITに有意な遅延をもたらしましたが、ガラス球を用いた結腸運動性解析では、偽操作マウスは48〜200秒以内に球を排泄し、Imは排泄時間を470〜775秒に延長して炎症を測定しました。

ME内では、白血球のレベルは、ここに見られるように組織化学または免疫組織化学を使用して分析されました。対照マウスでは多形核好中球はほとんど観察されませんでしたが、私は彼らの強い浸潤につながった小さな腸のものです。細胞から遊離した多くの炎症性メディエーターは、組織内で検出するのが困難です。

ライセート臓器培養物は、培養物中の炎症マーカーの検出を可能にします。POIの代表的なメディエーターである上清は、胃腸管の主要な抑制性神経伝達物質である一酸化窒素(no)です。この図は、私の中でnnoを検出できなかったことを示しています。

臓器培養、対照の上清、偽操作マウスの動物、基礎nnoレベルが観察された。しかし、腸内操作マウスの培養物は、24時間のインキュベーション後に大幅に多くのnnoを生成します。この腸管操作の技術は、適切に行えば15分以内に行うことができます。

このビデオを見た後、マウスに術後イレウスを誘発する方法とその重症度を分析する方法についてよく理解しているはずです。