Name: Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶ金ナノ粒子コーティングカバースリップを用いたファゴキネティックトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価法。この手法は標準的な光学顕微鏡で細胞運動を可視化し、複数サンプルの比較分析が可能です。

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この作品は、国立衛生研究所（AI050677、HD-051998、およびGM103433）、マルコム·ファイスト心臓血管研究フェローシップ、アメリカ心臓協会博士号を取得する前のフェローシップ（10PRE4200007）からの補助金によって支えられている。

1。ゼラチンコートしたカバーガラスの作製<ol><li>滅菌したプラスチック製100 mmディッシュ（ES）の場所は、酸洗浄したカバーグラス（直径15ミリメートル）。皿あたり8から9カバーガラスを置き、彼らがお互いに触れたり、お皿の両側いないことを確認してください.. </li></ol> 注：カバーガラス、針やピンセットは可能混入微生物、ならびに運動性を含む細胞機能に影響を与えるでしょうエンドトキシンを除去するために滅菌する必要があります。 <ol start="2"><li>ゼラチン粉末を秤量し、0.5 g/300 mlの最終濃度とゼラチン溶液を作るために、脱イオン水に粉体を懸濁します。次に、ゼラチン溶液は、オートクレーブ滅菌する必要があります。 </li><li>各カバースリップ上にゼラチンのピペット2〜3滴（〜100〜150ミリリットル）。 </li></ol> 注：ゼラチンは皿に触れたり、皿からカバーガラスを削除することはできませんがないようにしてください。 <ol start="4"&gt; <li> 10分間90℃のオーブンで100 mmディッシュでゼラチンコートしたカバーガラスを焼く。 </li><li>穏やかにピペッティングすることによって過剰ゼラチンを削除します。 </li><li> 45分間、70℃のオーブン中で100 mmディッシュ°Cでカバースリップを乾かします。 </li><li>一度乾燥、滅菌、エンドトキシンフリーの針とピンセット（針が優しく除去するために軽くピンセット用アクセスできるようにするためにカバースリップをナッジするために使用されます）を使用して100 mmディッシュからカバーガラスを削除します。 </li><li> 24ウェル皿の別々のウェルに、個々のゼラチンコートしたカバーガラスを置きます。 </li></ol> 2。金コロイドで被覆されたカバーガラスの作製<ol><li>塩化金酸（テトラクロロ金酸三水和物; HAuCl 4·3H 2 O）の適切な量を計量してから、最後の14.5 mMの溶液（毒性）を調製し、無菌の脱イオン水に懸濁します。 8月9日カバースリップあたりの溶液1.5mlを準備します。 </li></ol> 警告：塩化金酸はHであり、ひと抱え飲み込んだ場合は、重篤な皮膚の薬傷·眼の損傷を引き起こし、アレルギー性​​皮膚反応を引き起こす可能性があります。飲み込むと有毒。 <ol start="2"><li>クエン酸ナトリウム適量（三ナトリウム二水素2 -ヒドロキシ-1,2,3 -トリカルボン酸;のNa 3 C 6 H 5 O 7）を計量し、その後、最終0.5％溶液を作るために脱イオン水に粉体を懸濁します。 8月9日カバースリップあたり溶液1mlを準備します。 </li></ol> 警告：クエン酸ナトリウムは、目や皮膚に炎症を起こすことがあります。また、呼吸器や消化管の炎症を引き起こす可能性があります。 <ol start="3"><li>滅菌、エンドトキシンフリーのビーカーに無菌14.5 mMのHAuCl 4溶液および滅菌脱イオン水13.5ミリリットルの1.5ミリリットルを組み合わせ、その結果はかすかな黄色溶液が得られるはずです。前述のボリュームが作られている8月9日、金コロイドのカバーが可能になる。 </li><li>連続的に撹拌しながら、AがBに開始されるまで、ホットプレート上で溶液を加熱オイル。 </li></ol> 警告：蒸気は毒性/害を及ぼす可能性があるとして、溶液の加熱は、ドラフト内で行うべきである。蒸気は粘膜及び上気道の組織に破壊的である。 <ol start="5"><li>ホットプレートからビーカーを取り出します。 </li><li>撹拌しながら、0.5％クエン酸ナトリウム溶液0.7 mlを加える。前述のボリュームが作られている8月9日、金コロイドのカバーが可能になる。 </li><li>約2分間、この統合されたソリューションを撹拌しておく（注：溶液の色が徐々に最終的に赤ワインに到達する前に、深い紫色に、紫色、灰色に、クリアまたは、好ましくは、さび色に、淡い黄色から変更されます） 。本製品は、金コロイド溶液である。 </li><li> 1〜2分（金コロイド溶液が追加されたときに融解カバースリップ上にゼラチン層を維持するために）のために10ミリリットルピペット内の金コロイド溶液を冷却してからcolloidaの1.0〜2.0ミリリットルを追加以前に24ウェルディッシュ（ES）に置かれ、各ゼラチン被覆カバーガラス上にlの金溶液（あなたはゼラチンコートしたカバーガラスに追加した金コロイド溶液の量は、金粒子が溶液中に沈殿どれだけに依存する - を参照してください下のコメント欄）。 </li></ol> 注：金粒子の析出効率の変動があるかもしれないので、それが最初にゼラチンコートしたカバーガラスに金コロイド溶液0.5〜1 mlを加え、その後0.5時間インキュベーター内で24ウェル皿を置くことをお勧めします。このインキュベーション時間後、カバーはカバースリップ上の金粒子の適切な密度のために、光学顕微鏡下でチェックする必要があります。金粒子の低すぎるとあまりにも高濃度の例の20倍の顕微鏡写真を図1を参照してください。金粒子の理想的な濃度の40倍の顕微鏡画像（少なくとも単球と使用）については、 図2を参照してください。オプトインスライド上の金ナノ粒子のimal密度は、実験的に異なる細胞の特性はカバースリップ上に運動の強さが決まりますので、使用される各細胞型のために決定されるべきである。金粒子の濃度が不足している場合は、ゼラチンコートしたカバーガラスに金コロイド溶液の追加0.5〜1ミリリットルを追加します。 セルの大きさに応じて、金粒子の適切な濃度は変わることができると、このように最終的に運動性を検討し、セルのサイズに依存します。例えば、ヒト単球は小型の細胞（10月20日〜28ミクロン）であることと、金粒子の高い濃度は我々の分析では必須であった。金ナノ粒子の適切な配分を簡単かつ効率的に細胞のトラックのエッジを区別する能力を持つ研究者を提供しています。高すぎると、金粒子の濃度が正確に測定することが移動するとする細胞の能力を妨げる値が低すぎるものが運動能力の正確な軌道を描くことである金粒子の濃度はしばらくその運動、。 重要な注意：金ナノ粒子の合成に問題がある場合には、合成された金ナノ粒子が5〜400nmのサイズで市販されている。さらに、蛍光ミクロスフェアは、細胞の運動性29の研究にも使用されてきた。しかし、これらの微小球の使用は、細胞遊走の分析のための蛍光顕微鏡を必要とします。 <ol start="9"><li> 37℃インキュベーター中のコロイド金で覆われたカバーグラスで24ウェル皿を置き、1時間から一晩℃にインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、リンス/（PBS; pH7.4）で緩衝化生理食塩水、滅菌リン酸にカバースリップ（3X）を浸漬することによって結合していない金を削除します。 </li><li> PBSを含むクリーンな12ウェルディッシュ（es）は、これらのコロイド金でコーティングされたカバーガラスを置きます。 </li><li> 4℃まで、これらのカバーガラスを格納する準備（パラフィルム冷蔵庫に置く前板）を使用します。 </li></ol> 重要な注意：金粒子がカバーガラスから剥がれ落ち、できるだけ乾燥させた場合は、常に液体/メディアのいくつかのタイプに金コロイドコーティングしたカバースリップを保つ。金コロイドのカバーは、それらが作られた日付2から3ヶ月以内にご使用ください。 品質管理：単一phagokineticトラック運動アッセイでは、それは金粒子の同様の濃度によって特徴付けられるカバーグラスを使用することが重要です。この簡単なポイントは、治療ではなく、金コロイドコーティングしたカバーガラスの物理的性質の性質のみに起因するサンプル間の細胞運動性の定量的な違いを考慮するでしょう。我々は、金ナノ粒子の密度がある限りが等しいことが示されているが、我々は、個々の実験で同時に作られる唯一のカバーガラスを使用して好む、カバーガラスの使用異なる調製物から適切である。 3。細胞運動性の解析<ol><li>目的の細胞に適した細胞の培地中でコロイド金でコーティングされたカバーガラスを置きます。 </li><li> 24ウェルディッシュ（ES）に置かれた金コロイドコーティングしたカバーガラス上に適切に処理された細胞を転送</li></ol> 注：単一のウェルに移した細胞の数は、各細胞型が研究のために決定する必要があります。理想的には、細胞が均等に順番に単一のセルで作成されたトラックのみの統計的分析を可能とする金コロイドコーティングしたカバースリップ上で配布する必要があります。細胞があまりにも高濃度で播種している場合は、複数のセルの重複トラックが見られる可能性が高いことになります。重複トラックを正確に定量することはできませんし、従って、それらはテストされた細胞の動きの最終解析において考慮することができません。の結果として、トラックを重複複数のセルの関与は通常容易に観察される、2つ以上のセルが同じ連続クリアされた領域で観察することができる合併または交差トラック（分析の分野で）。 <ol start="3"><li> 37℃で24時間のためのC / 5％CO 2（または任意の適切な時間のために、我々は6時間と12時間の後処理で24時間、後処理と内皮細胞との間で単球の運動性を解析した例を参照 ）。細胞型が研究し、こうして実験的に各細胞型（ - 12時間の治療後の良い出発点は、しかし、6である）のために決定されるべきであると細胞運動性を決定し、測定するための最適な時間枠は異なります。 </li></ol> 注：実験コロイド金でコーティングされたカバースリップを後で保存および/ ​​または分析する必要がある場合、セルと金ナノ粒子は、カバーガラス上に固定する必要があります。この固定ステップを達成するために、以下のステップ3.3、最初の洗浄は1xで慎重に2回カバースリップPBSは（カバーガラスから金ナノ粒子の除去は避けなければならないようにカバーガラスを浸漬することが好ましい）、そのような室温3％パラホルムアルデヒドとのインキュベーションなどの標準的な細胞固定法を使用します。 15分間インキュベートした後、3％パラホルムアルデヒドを除去する必要があり、カバーガラスは、1x PBSで注意深く3回洗浄した。固定されたカバースリップを冷蔵庫に保存することができます。 <ol start="4"><li>光学顕微鏡を使用して、単一の可動セル（：確かに、調査中の細胞のタイプによって異なります携帯トラックの写真を撮るために使用される倍率注）によって作成されたトラックの画像をキャプチャします。コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で非運動性と運動性の細胞によって作成された携帯電話のトラックの例を図2に示します。 </li></ol> 注：phagokineticトラック運動性アッセイで使用されるサイズの金ナノ粒子はセル30に対して完全に無毒であることが判明している。必要に応じて、調べた細胞の生存率はトリパンブルーで染色することによって評価または細胞生存の他のマーカーを調べることができます。一つは、このステップが実施する必要がある場合は、アカウントに固定等の固定、型の必要性を取らなければならないだろう。 <ol start="5"><li> ImageJのようなソフトウェア（自由に利用できるソフトウェア、使い方<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ）またはNIHイメージ（ <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a>で開発）、両方を米国立衛生研究所（NIH）、またはImageToolを（ <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.htmlは</a> ）サンアントニオのテキサス健康科学センターによりクリアコロイド金の平均面積（任意の単位）の大学で開発された10から20以上のセル（サンプルあたり）撮影した画像から、各実験群のために決定される。統計情報は、トンでも実行でき彼は結果を収集した。たとえば、結果は平均±スチューデント実行t検定 、および&lt; のP値のサンプル間の統計的有意性の尺度として使用さ0.05の平均値の標準誤差（SEM）としてプロットすることができます。 図3および図4のステップは、セルでクリアコロイド金の面積の分析。 </li></ol>

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<li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li>
<li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

この記事で紹介phagokineticトラック運動性アッセイは、細胞遊走の定量分析のためのシンプルで非常に効果的な方法です。複数の細胞型が9月17日を分析することができるので、この方法は、複数の分野にまたがる広範な潜在的な用法を持っています。コロイド金コートしたカバーガラスの使用は、移動セルでクリアトラック領域の測定が可能になる。アッセイは、細胞の運動性で異なる刺激の効果（ すなわち、増殖因子、ECMのリガンドを精製し、ウイルス、細菌）を測定することができる。さらに、細胞固定のための要件の欠如は、異なる実験の時点で細胞移動の監視が可能となります。また、検定は標準光学顕微鏡、CCD（電荷結合素子）イメージセンサと自由に利用可能なソフトウェアを使用して、標準のカメラを必要とします。したがって、洗練された顕微鏡やカメラが必要、また、特別なソフトウェアスイートですされていません。にもかかわらず尻AYは、設計が単純である、それは統計的に実験条件の多数の下に複数の種類の細胞の運動性を研究するための強力なツールです。たとえば、この点で、これらのアッセイは、効果的に実験的な少数のサンプルを勉強するだけでなく、効果...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>カバーガラス（15ミリメートル） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン300ブルーム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td>テトラクロロ金酸三水和物</td><td>フィッシャーケミカル</td><td> G54-1 </td><td> 14.5ミリメートル（最終作業溶液） </td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP327-500 </td><td> 0.5％（最終的な作業溶液） </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> O4042 </td><td> 3％（最終的な作業溶液） </td></tr><tr><td> 100mmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1802 </td><td></td></tr><tr><td> 12ウェルプレート</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td>テクネオーブンHybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td>標準的な実験室のオーブンで十分でしょう</td></tr><tr><td> 10ミリリットル血清ピペット</td><td>ザルスタット</td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイドフィラー/ディスペンサー</td><td>ドラモンド</td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200シングルチャンネルピペットマニュアル</td><td>レイニン</td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200ミリリットルバリアのヒント</td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJのソフトウェア</td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">HTT</a>P :/ / rsb.info.nih.gov / IJ / </td><td></td><td>ライセンス：パブリックドメイン</td></tr><tr><td> photometrics CoolSNAPfxニコンエクリプスTE300は、12ビットCCDカメラをモノクロ</td><td>ニコン</td><td></td><td>中止、ほとんど匹敵する仕様は、ニコンエクリプスTiを持っていますが、下端ニコン80Iも適しています。他のブランドも匹敵する顕微鏡を提供する。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 注：下記の試薬 ​​および機器は私たちの様々な研究で我々が利用されてきた。その他の消耗品サプライヤー、試薬、機器がある限り、彼らは同様の仕様を持っているとして、使用することができます。 </td></tr></tbody></table>

phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

細胞の運動性は単細胞と多細胞生物の両方にとって重要な生物学的プロセスである。これは、ほんの数1,2,3役割に言及し、組織の発達、免疫監視および創傷治癒には不向きな条件からだけでなく、多細胞生物に離れて栄養源に向かって、または単細胞生物の動きのために不可欠です。このプロセスの規制緩和は重大な、神経、心血管および免疫疾患につながるだけでなく、腫瘍の形成と拡散4,5を悪化させたことができます。分子、アクチンの重合と受容体のリサイクルは、セル6,7,8の前方への移動を駆動する携帯電話の拡張（葉状仮足）の作成 ​​に重要な役割を果たすことが示されている。しかし、細胞の遊走についての多くの生物学的な疑問は未解決のままです。 ヒトの健​​康と疾患における細胞の運動性のための中心的な役割は、特定のMECを理解することの重要性を強調hanismsは、このプロセスに関与しており、特に重要な細胞の運動性を評価するための正確な方法になります。顕微鏡は、通常の細胞の動きを視覚化するために使用されています。しかし、細胞は運動性細胞の定量的な時間経過のムービーを作成するために高価なカメラとソフトウェアを必要とするリソースのかかるプロセスで細胞遊走の定量的な測定を行うことではなく、徐々に移動します。したがって、費用対効果が細胞移動の定量的な測定を実行する能力、非骨の折れる、共通実験装置を利用し、多くの研究者のための大きい必要があります。 phagokineticトラック運動性アッセイは、金コロイドで被覆されたガラスカバースリップ9,10に測定可能なトラックを作成し、そのパスから金粒子をクリアする移動細胞の能力を利用しています。自由に利用できるソフトウェアを使用して、複数のトラックが統計的要件を達成するために、各治療のために評価することができます。アッセイは、評価するために利用することができがん細胞など多くの細胞型、11,12、線維芽9、好中球13、骨格筋細胞14、ケラチノサイト15トロホブラスト16、内皮細胞17、および単球の運動性10,18-22。プロトコルは、クエン酸ナトリウムによって塩化金酸の還元金（Au 3 +）によって生成された金ナノ粒子（金°）で被覆されたスライドの作成 ​​が含まれます。この方法は、1951年23インチ Turkevich らによって開発された後、Frens らによって1970年代に改善された。24,25。この化学還元工程の結果として、金粒子（直径10〜20 nm）は、反応混合物から沈殿させ、その後、細胞移動の解析9,26,27で使用するための準備ができているカバーガラスに適用することができます。 一般的に、phagokineticトラック運動性アッセイは、細胞の運動性、迅速かつ簡単に定量的な尺度である。加えて、それ時間経過イメージング、ならびに研究者のニーズに応じて他の用途に適さない種類の細胞で使用するために、単純なハイスループットアッセイとして利用することができる。一緒に、定量的に高価な顕微鏡やソフトウェアを必要とせずに、複数の種類の細胞の細胞の運動性を測定する能力は、一般的な実験器具や薬品の使用とともに、phagokineticトラック運動分析セルラーを理解することに関心を持つ科学者のための堅実な選択肢作る運動性。

示されている単一電池（我々の実験から単球を図2に示されている）によってクリアトラック領域を示す光学顕微鏡下で撮影した画像の一例です。非運動性の細胞は、特徴的な、小さな楕円形またはこれらの刺激細胞（ 図2Aおよび2B）のための運動の低い基底レベルを示す自身の周りに円形の管を作成します。これとは対照的に、非常に運動性の細胞[私たちのシステムでは、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）感染細胞]は細長いトラック領域として図2Cおよび2Dに示す方向性によって特徴づけられる。 40Xを目的とした倒立顕微鏡を使用してトラック領域の複数の画像を取得した後、総トラック領域は、ImageJのソフトウェア（図3）を使用してマークされていた、似たような結果は、他のアプリケーションソフトウェアを使って取得できます。それが無料で使いやすいですので、我々はImageJのソフトウェアを好む。運動性の細胞は、標準的な、幾何学的な形のトラックデュを作成しないでください彼ら...

phagokinetic運動追跡アッセイは、細胞の動きを評価するために使用される方法です。具体的には、アッセイは、定量的な方法で時間をかけてケモキネシス（ランダム細胞の運動性）を測定します。アッセイは、コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で彼らの動きの測定可能なトラックを作成する細胞の能力を活用しています。

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

細胞運動性は、単細胞生物と多細胞生物の両方にとって重要な生物学的プロセスである。これは単細胞生物の移動に不可欠であり、...

本手順の総合的な目的は、金ナノ粒子を用いた細胞運動性アッセイを用いて、細胞の運動性を経時的に定量測定できるようにすることです。これは、まず金ナノ粒子をコーティングするためのガラスカバースリップを準備することによって達成されます。具体的には、エンドトキシンフリーのカバースリップにゼラチンをコーティングし、その後、加熱乾燥させます。第2段階では、塩化金酸を還元して金ナノ粒子を生成し、ゼラチンコーティングされたカバーガラスをこの溶液で均一にコーティングします。次に、実験で設定した時間枠に従って、細胞を金ナノ粒子コーティング済みのカバーガラス上に配置します。続いて、ゼラチンが金ナノ粒子を置換し、トラックを形成させます。最終ステップは、移動する細胞によって形成されたトラックを顕微鏡で撮影し、細胞運動性のモニタリングと定量化を行うことです。最終的に、フリーウェアを用いてトラックの面積測定が行われます。タイムラプスイメージングなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点の一つは、標準的な光学顕微鏡と標準的なカメラのみで実施でき、無料で利用可能なイメージングソフトウェアを使用する点にあります。さらに、本アッセイはハイスループットスクリーニングが可能な手法であるため、多数のサンプルの分析および比較を容易に行うことができます。この手法は、さまざまな生理学的要因や細胞運動の影響に関する知見を提供できるだけでなく、病原体が感染細胞の運動性に及ぼす影響の研究など、他の系にも適用可能です。一般的に、本手法を初めて行う方は、プロトコルに記載された分量や温度を厳格に遵守する必要があるため、習得に苦労する可能性があります。このプロトコルでは、成功を確認するために、沈殿した金ナノ粒子の最終溶液の色を評価することに重点を置いています。FGOキネティックトラック運動性アッセイの手順を習得することは困難であるため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。これらには、細胞・分子生物学研究室では一般的ではないいくつかの手順が含まれています。ゼラチンコーティングしたカバーガラスを調製するには、まずゼラチンと脱イオン水を再懸濁させて、最終濃度が0.5 grams/300 millilitersの溶液を作成し、その後、混合物を15から30分間オートクレーブします。この操作は、組織培養フード内でゼラチンを添加してから2時間以内に行うことが重要です。まず、酸洗浄済みのカバーガラスを8〜9枚、100 mmのプラスチックディッシュに移してコーティングの準備をします。カバーガラス同士やディッシュの壁面に触れないように配置してください。各カバーガラスに、プレート上に溢れないよう注意しながら、ゼラチンを2〜3滴慎重にピペットで滴下します。次に、ゼラチンコーティングしたカバーガラスを入れたディッシュをオーブンに入れ、90 °Cで10分間加熱します。10分後、ディッシュをオーブンから取り出し、組織培養フードに戻します。余分なゼラチンをピペットで静かに取り除きます。ディッシュをオーブンに戻し、カバーグラスを 70 °C で 45 分間乾燥させます。カバーグラスが乾燥したら、ディッシュをオーブンから取り出し、組織培養フードに戻します。滅菌済みの針を用いて、カバーガラスの端を慎重に持ち上げます。次に、滅菌済みのピンセットを使用して、ゼラチンコーティングされたカバーガラスをディッシュから取り出し、24ウェルプレートの個別のウェルに移します。次のステップは、コロイド金コーティングカバーガラスを調製することです。組織培養用クリーンベンチ内で、滅菌済みエンドトキシンフリーのエルレンマイヤーフラスコを用い、14.5 mMの塩化金酸溶液1.5 mLとオートクレーブ滅菌済みの脱イオン水13.5 mLを混合し、0.5%クエン酸ナトリウム溶液10 mLを調製します。カバーガラス8〜9枚につき、淡黄色の溶液が得られるはずです。塩化金酸は毒性があるため、慎重に取り扱ってください。また、光に敏感であるため、沸騰ステップは低照度の環境で行ってください。溶液が沸点に達したら、フラスコをホットプレートから取り外し、スターラープレートへ移します。溶液中にコロイド金粒子を形成させるため、クロロ金酸溶液15 mLに対して0.5%クエン酸ナトリウム溶液0.7 mLを撹拌しながら加え、そのまま約2分間撹拌を続けます。この間に、溶液の色は淡黄色から透明、灰色、紫色、そして濃紫色へと変化します。最終的に赤ワイン色、あるいは好ましくは錆色になる前に、コロイド金溶液を10 milliliterピペットで吸い上げ、室温になるまで1〜2分間ピペット内で冷却させます。次に、24ウェルプレート内のゼラチンコート済みカバーガラスの上に、0.5〜1 milliliterを添加します。コロイド金が塗布されたカバーガラスが入った24ウェルプレートを37 °Cのインキュベーターに入れ、30分間インキュベートします。粒子がゼラチンコート済みカバーガラス上に沈降した後、光学顕微鏡下でその密度を確認します。金ナノ粒子の適切な分散は、ソーラートラックの端を簡単かつ効率的に識別するのに役立ちます。最適な密度は細胞サイズによって異なります。金粒子の濃度が高すぎると細胞の移動能が妨げられ、逆に金粒子の濃度が低すぎると、運動性の正確な軌跡を記述する能力が制限されます。このため、個々の実験では、同じバッチで製造された、あるいは密度が同じであることが確認されているカバーガラスのみを併用する必要があります。金粒子の濃度が不十分な場合は、ゼラチンコーティングしたカバーガラスにコロイド金溶液をさらに0.5〜1 mL加えてください。しかし、ここで示している例のように金粒子の濃度が高すぎる場合は、コロイド金溶液を再度調製し、新しいカバーガラスにコーティングし直すことが唯一の効果的な方法です。粒子密度が適切であれば、プレートを37°Cのインキュベーターに戻し、1時間から一晩インキュベートします。その後、カバーガラスを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に3回浸し、結合していない金粒子を洗い流します。次に、コロイド金でコーティングしたカバーガラスを、PBSを満たした清潔な12ウェルプレートのウェルに入れ、使用時まで4°Cで保存します。カバーガラスを乾燥させないようにし、作製日から2〜3ヶ月以内に使用してください。次のステップは、細胞培養用のコロイド金コーティングカバーガラスを準備することです。まず、約0.3 millilitersの培地をあらかじめ添加した24ウェルプレートの各ウェルに、カバーガラスを配置します。その後、各コロイド金コーティングカバーガラスに約5,000から50,000個の細胞を播種します。細胞数は細胞種によって異なりますが、同一領域内で複数の細胞による走行軌跡が重なり合わないよう、細胞密度を十分に低く抑える必要があります。プレートに蓋をし、37 °C、5% carbon dioxide のインキュベーターで6〜24時間培養します。細胞種の運動能に基づき、最適な時間は細胞種ごとに実験的に決定する必要があります。培養後、すぐに解析しないカバーガラスは、まずPBSに2回浸し、続いて室温で3% para formaldehyde に15分間浸して固定します。顕微鏡を用いて、固定前または固定後のカバーガラス上の単一の移動細胞によって形成された軌跡の画像をキャプチャします。細胞軌跡の撮影に使用する倍率は細胞種によって異なりますが、結果を比較できるように、各研究において同一の倍率を使用しなければなりません。単球の場合、40倍の倍率が適しています。ImageJ、JNIH image、またはImage Toolなどのフリーソフトウェアを使用して、ここで示したキャプチャ画像から、各サンプルにつき10〜20個以上の細胞によって除去されたコロイド金の中央値を決定します。ここに示しているのは、40倍の対物レンズで撮影した、刺激を与えていない単一の単球によるコロイド金粒子の除去経路です。非運動性細胞は、自身の周囲に特徴的な小さな楕円形または円形の軌跡を作成し、これは基底レベルの低い運動性を示しています。対照的に、運動性の高い細胞は、不規則な形状に起因する方向性を持った運動として細長い軌跡を描き、全体的に広い除去面積を形成することを特徴とします。細胞の軌跡は、Image Jソフトウェアのフリーハンドツールを使用してその領域を囲むことで最適に解析できます。その後、Image Jの解析メニューにある計測ツールを用いて、定量的な面積測定を行うことができます。この手順を行う際は、プロトコルに記載されている量と温度を厳密に守ることが重要です。これらの逸脱は最終的な結果に強く影響する可能性があります。このビデオを視聴することで、ゼラチンコートカバースリップの作製方法、金ナノ粒子および金ナノ粒子コートカバースリップの調製方法、そして光学顕微鏡を用いた細胞移動のモニタリングおよび定量評価の方法について十分に理解できるはずです。ホットプレートで沸騰した溶液を扱う際は、特にフルオロ、AIC酸、クエン酸ナトリウムの沸騰溶液から発生する蒸気が危険であることに留意してください。本手順の実施にあたっては、ドラフトチャンバー内での作業や常識的な安全策を常に講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、in vivoでの好中球走化性因子のソースに対応して好中球動員中に動的な好中球 -...

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

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タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

我々は、様々な成長因子の存在下での腸溶神経堤細胞の遊走電位の正確な定量を可能にex vivoで細胞遊走アッセイを提示する。...

マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

一般的に使用される、 インビトロで細胞遊走および浸潤を調べるための高度にアクセス可能な方法が記載されている。第一の方法は、細胞運動性を測定する細胞創傷閉鎖アッセイである。第二の方法は、走化性、細胞の浸潤能を評価するトランスウェル遊走および浸潤アッセイである。...

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

一次元閉じ込められた微小環境における細胞の自発的な遊走を研究するための定量的方法が記載されている。この方法は、微細加工されたチャネルを利用し、単一の実験では、異なる条件下で多数の細胞の遊走を研​​究するために使用することができる。...

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

細胞移動は、癌のような創傷治癒および免疫応答、および病態生理学的過程として、生理の茄多に関与している生物学的な現象である。 3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、3D生理的環境における内の異なる細胞型の遊走特性を分析するための多目的なツールである。...

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

多くのアップレギュレーションされた遺伝子は、腫瘍細胞の遊走と浸潤を刺激し、予後不良につながります。どの遺伝子が腫瘍細胞の遊走と浸潤を制御しているかを決定することは非常に重要です。このプロトコルは腫瘍のセルの移動そして侵入に対する遺伝子の高められた表現の効果をリアルタイムで調査するための方法を示す。...

合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

この手順では、 Acanthamoeba spp .運動。...

アカントアメーバ属の定量化運動

このプロトコルは、一次マウスT細胞の単離および特定の環境条件下でのT細胞遊走のタイムラプス顕微鏡法を定量的分析とともに提供します。...

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

フローサイトメトリーによる負傷者/病理学的な中枢神経系における細胞性炎症の定量は感度/精度を低下させる、細胞に類似した大きさと造粒を持つことができる脂質/ミエリン破片によって複雑になる。我々は、ミエリン破片を除去し、損傷した脊髄のフローサイトメトリーによって細胞の検出を向上させるために細胞の調製法を進めてきた。...

フローサイトメトリーによって負傷した脊髄組織における免疫細胞の定量的評価：セルの精製方法のための新しい使用法

学ぶ金ナノ粒子コーティングカバースリップを用いたファゴキネティックトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価法。この手法は標準的な光学顕微鏡で細胞運動を可視化し、複数サンプルの比較分析が可能です。

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

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