Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

この手順の全体的な目標は、金ナノ粒子ベースの細胞運動性アッセイを使用して、細胞の運動性を経時的に定量的に測定できるようにすることです。これは、最初に金ナノ粒子のコーティング用のガラスカバースリップを準備することによって達成されます。具体的には、エンドトキシンフリーのカバースリップをゼラチンでコーティングし、焼き上げます。

第2のステップは、金ナノ粒子を生成するクロロオル酸を還元し、ゼラチンコーティングされたカバースリップを溶液で均一にコーティングすることです。次に、細胞を金ナノ粒子コーティングカバースリップ上に、実験細胞の所望の時間枠で配置する。次に、ゼラチンは金ナノ粒子を置き換えてトラックを作成します。

最後のステップは、顕微鏡を使用して細胞の運動性をモニタリングおよび定量し、移動する細胞によって作成されたトラックを画像化することです。最終的に、トラックの面積測定は、無料で入手できるソフトウェアを使用して実行されます。この手法がタイムラプスイメージングなどの既存の方法よりも優れている主な利点の1つは、このアッセイが標準的な光学顕微鏡、標準的なカメラのみを必要とし、自由に利用できるイメージングソフトウェアを使用することです。

さらに、このアッセイでは、ハイスループットスクリーニングが可能なMethodistを使用して、複数のサンプルの分析と比較も容易になります。この方法は、さまざまな生理学的要因や細胞の動きの影響についての洞察を提供することができますが、病原体が感染細胞の運動性に及ぼす影響に関する研究など、他のシステムにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、プロトコルに示されている体積と温度に厳密に従う必要があるため、苦労する可能性があります。

このプロトコルでは、沈殿した金ナノ粒子の最終溶液の色を評価することに重点が置かれており、成功を確実にします。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。FGOキネティックトラック運動性アッセイのステップは習得が困難です。

それらには、細胞生物学および分子生物学の研究室では一般的に使用されないいくつかの手順が含まれています。ゼラチンコーティングされたカバースリップを調製するには、まずResusがゼラチンと脱イオン水を懸濁して、最終濃度が300ミリリットルあたり0.5グラムの溶液を作り、混合物を15〜30分間オートクレーブします。これは、組織培養フードにゼラチンを添加してから2時間以内に行うことが重要です。

最初に8〜9個の酸洗浄されたカバースリップを100ミリメートルのプラスチック皿に移すことにより、コーティング用のカバースリップを準備します。カバースリップが互いに接触したり、皿の側面に接触したりしていないことを確認してください。プレートへのオーバーフローを避けるために、各カバースリップに2〜3滴のゼラチンを慎重にピペットで移します。

次に、ゼラチンコーティングされたカバーが入った皿をオーブンに入れ、摂氏90度で10分間焼きます。10分後、皿をオーブンから取り出し、ティッシュに戻します。カルチャーフード。

余分なゼラチンをそっとピペットで取ります。皿をオーブンに戻し、カバースリップを摂氏70度で45分間乾かします。カバースリップが乾いたら、オーブンから皿を取り出し、ティッシュカルチャーフードに戻します。

滅菌針を繊細に使用して、カバースリップの片側を持ち上げます。次に、滅菌ピンセットを使用して、ゼラチンコーティングされたカバースリップを皿から取り出し、24ウェルプレートの別々のウェルに入れます。次のステップは、コロイド金コーティングされたカバースリップを準備することです。

組織培養フードで10ミリリットルの0.5%クエン酸ナトリウム溶液を調製することから始めます 14.5ミリモルのクロロORIC酸溶液の1.5ミリリットルとオートクレーブ脱イオン水の13.5ミリリットルを無菌エンドトキシンフリーの三角フラスコに組み合わせます 8〜9枚のカバースリップごとに、結果はかすかな黄色の溶液を生成するはずです。クロロORIC酸は有毒であり、慎重に取り扱う必要があります。また、光に敏感なため、沸騰ステップは暗い場所で実行する必要があります。

溶液が沸点に達したら、フラスコをホットプレートから取り出し、攪拌プレートに移します。溶液中でコロイド状の金粒子を形成するために、攪拌しながらクロロORIC酸溶液の15ミリリットルあたり0.7ミリリットルのクエン酸ナトリウム溶液を加え、約2分間攪拌を続けます。この間、溶液はかすかな黄色から透明、灰色、紫、濃い紫に変わります。

最終的に赤ワインまたはできれば錆びた色に到達する前に、10ミリリットルのピペットでコロイド状の金溶液を吸い上げ、溶液が室温に達するまでピペットで1〜2分間冷却します。次に、ゼラチンでコーティングされたカバースリップの上に0.5〜1ミリリットルを追加します 24ウェルプレート コロイド状の金で覆われたカバースリップを含む24ウェルプレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、30分間インキュベートします。粒子がゼラチンコーティングされたカバースリップに沈殿する時間があったら、光学顕微鏡で粒子の密度を確認します。

金ナノ粒子の適切な分布は、ソーラートラックのエッジを容易かつ効率的に区別するのに役立ちます。最適な密度はセルサイズによって異なります。金粒子の濃度が高すぎると細胞の移動能力が妨げられ、金粒子の濃度が低すぎると、運動性の正確な追跡を描く能力が制限されます。

このため、同じバッチで作成されたカバースリップ、または同じ密度になるように設定されたカバースリップのみを個々の実験で一緒に使用する必要があります。金粒子の濃度が不十分な場合は、ゼラチンコーティングされたカバースリップにコロイド状の金溶液を0.5〜1ミリリットル追加します。しかし、ここに示されているように、金粒子の濃度が高すぎる場合は、金コロイド溶液を作り直し、新しいカバースリップをコーティングするしか有効な選択肢はありません。

粒子密度が正しい場合は、プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻し、カバースリップを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に3回浸して、未結合の金粒子を一晩洗い流すために1時間インキュベートします。次に、コロイド状金コーティングされたカバースリップを、使用する準備ができるまで、摂氏4度のきれいな12ウェルプレートのPBS充填ウェルに保管します。カバースリップは乾燥させてはならず、作成日から2〜3か月以内に使用する必要があります。

次のステップは、細胞培養用のコロイド状金コーティングカバースリップを準備することです。カバースリップの追加前に約0.3ミリリットルの培養培地が追加された24ウェルプレートの個々のウェルにそれらを配置することから始めます。セル番号はセル タイプによって異なりますが、セル密度は、同じエリア内の複数のセルからのセル トラックが重ならないように十分に低くする必要があります。

プレートを覆い、5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに6〜24時間置きます細胞タイプの運動性に基づいて、インキュベーション後の各細胞タイプに最適な時間枠を実験的に決定し、すぐに分析されないカバースリップを最初にPBSに2回浸し、次に室温で3%パラホルムアルデヒドに15分間インキュベートして固定します。ライトは、固定されていないまたは固定されたカバースリップ上の単一の移動セルによって作成されたトラックの画像をキャプチャします。細胞の軌跡を撮影するために使用される倍率は、細胞の種類によって異なります。ただし、結果を比較できるようにするには、各スタディで同じ倍率を使用する必要があります。

単球の場合、40倍の拡大は、画像、JNIH画像または画像ツールなどの無料で利用可能なソフトウェアを使用してうまく機能し、ここに示されているキャプチャ画像から各サンプルの10〜20以上の細胞によってクリアされた金コロイドの平均面積は、40倍対物レンズで撮影された単一の非刺激単球によるコロイド金粒子のクリアパスです。非運動性細胞は、それ自体の周囲に特徴的な小さな楕円形または円形のトラックを作成しますが、これは家臣の動きのレベルが低いことを示しています。対照的に、運動性の高い細胞は、細長い管として方向性のある動きを特徴とし、その不規則な形状のために全体の面積が大きくなります。

セルトラックは、Image Jソフトウェアのフリーハンドツールを使用してボリュームのアウトラインを作成することで解析するのが最適です。定量的な面積測定は、Image J.Whileの解析メニューにある測定ツールを使用して行うことができますが、この手順を試行している間は、偏差が最終結果に強く影響する可能性があるため、プロトコルに示されている体積と温度に厳密に従うことを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、ゼラチンコーティングされたカバースリップの作成方法、金ナノ粒子および金ナノ粒子コーティングカバースリップの調製方法、光学顕微鏡を使用して細胞の動きをモニタリングし定量的に評価する方法について十分に理解できるはずです。

ホットプレート上の沸騰溶液、特にフルオロ、AIC酸、クエン酸ナトリウムの沸騰溶液からの蒸気は、フードでの作業や常識の使用などの危険な予防措置になる可能性があることを忘れないでくださいこの手順を実行する際には、常に講じる必要があります。