骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

このビデオで示されている実験の全体的な目標は、抗菌ペプチドlyinがマウスのデキストラン硫酸誘発性大腸炎の改善に役割を果たすかどうかを評価することです。これは、野生型マウスの骨髄を照射したLICITマウスおよびノックアウトマウスに、ノックアウトマウスの骨髄を照射した野生型マウスに注入することによって達成されます。移植された骨髄は、ドナー遺伝子型のレシピエントに新しい血液細胞を生成します。

その後、レシピエントマウスをデキストラン硫酸塩に曝露し、4週間後に大腸炎を誘発します。移植の成功はフローサイトメトリーによって検証され、結腸組織の損傷は組織学によって評価されます。野生型骨髄をノックアウトマウスに移植すると大腸炎が改善することを示す結果が得られました。

逆に、ノックアウト骨髄を野生型マウスに移植すると大腸炎が悪化します。この方法は、炎症または感染における骨髄由来細胞または非骨髄由来細胞からの遺伝子発現を決定する際の重要な質問に答えるのに役立ちます。この実験では、野生型マウスおよびノックアウトマウスの追跡を可能にするために、C57、ブラックシックス、野生型、およびC誘発ノックアウトマウスを推奨する。

骨髄移植後のドナー細胞。野生型マウスを表すには CD 45.1 マウスを使用し、ノックアウトマウスには CD 45.2 を使用します。ここに示すチャートは、各グループに5匹のドナーマウスと10匹のレシピエントマウスが割り当てられている実験設定を示しています。

グループ A および B の場合、骨髄は野生型マウスからノックアウトマウスに移植されます。大腸炎はグループAで誘発されますが、グループBでは誘発されませんグループCでは骨髄はノックアウトマウスから野生型に移植され、大腸炎はグループCでのみEとFに移植されます。 移植はノックアウトからノックアウトへと行われます。放射線を照射したマウスに移植するためのドナー骨髄を準備するには、バイオセーフティキャビネットで犠牲にしたマウスの骨から骨髄を抽出することから始めます。

滅菌解剖器具を使用して、上腕骨、大腿骨、脛骨、腓骨を筋肉や靭帯の付着のない状態で露出させ、それらをペトリ皿に移します。骨の両端を切り開いて、赤い骨髄を表示します。次に、鉗子で骨の1つをつかみます。

3ミリリットルの注射器と25ゲージの針で冷たいPBSで赤い骨髄を別のシャーレに洗い流します。次に、もう一方の端から骨を洗い流して、より多くの骨髄細胞を生成します。このプロセスを各ボーンで繰り返します。

野生型の骨髄をプールし、マウスを別々にノックアウトします。18ゲージの1/2インチの針が付いた6ミリリットルの注射器を使用して、誤嚥と排出を繰り返すことで赤い骨髄プラグを切断します。次に、血清学的ピペットを使用して、採取した骨髄を50ミリリットルの円錐管に移します。

すべての骨髄が移植されたら、骨髄を摂氏4度で740Gで5分間回転させます。スピン後、上清を捨て、5〜10秒間ボルテックスしてペレットを再懸濁します。ペレットに、ドナーマウスボルテックスごとに5ミリリットルのXRBC溶解バッファーを5秒間再度加え、室温で正確に3分間インキュベートします。

3分後、各チューブに20ミリリットルの冷たいPBSを加え、反転して混合して溶解を停止します。次に、内容物を40ミクロンのセルストレーナーを通して新しい50ミリリットルの円錐管に注ぎます。元のチューブを5ミリリットルのPBSですすぎ、溶液をセルストレーナーに移します。

円錐形のチューブに流れを収集し続けます。次に、PBSで容量を最大50ミリリットルに戻し、反転して混合します。次に、ヘモサイトメーターを使用してトライアンブルー排除により生存細胞数を決定します。

細胞数が決定されたら、骨髄細胞をGの913倍で摂氏4度で5分間スピンダウンします。スピン後、総細胞数に基づいて上清を除去します。Resusは、ペレットをPBSに10〜8番目の細胞/mLで1回懸濁します。

これで、骨髄細胞を照射したレシピエントマウスに移す準備が整いました。この実験のためのレシピエント野生型マウスおよびノックアウトマウスには、添付文献に記載の通り1000radを照射し、マウスを病原体フリー施設で飼育し、照射後4〜24時間後にレシピエントマウスを加温ランプの下の加熱パッド上で温め、ドナー骨髄を注入した。レシピエントマウスを拘束装置に置き、尾部を70%エタノールで拭いて注入部位を滅菌し、局所的な血管拡張を促進して簡単に注射できるようにします。

28.5ゲージ針付きのインスリン注射器を使用して、注射後、各マウスの尾静脈に1〜200マイクロリットルの7番目の細胞に1回10を注射します。マウスを、注射後最初の4週間は、最大3匹の他の注射マウスと一緒にケージに入れます。注射したレシピエントマウスを、抗生物質スルファトリムを含む水を入れたオートクレーブケージに保持します。.

これにより、動物が免疫力を取り戻し、ケージ、抗生物質処理水、餌を4日ごとに交換して衛生状態を維持する時間を確保できます。放射線照射と骨髄移植の4週間後、抗生物質を含まない通常の水に切り替え、マウスをさらに2週間維持して正常な腸内細菌叢を取り戻します。骨髄注射の6週間後、大腸炎を誘発するための初期体重を測定します。

大腸炎実験群のマウスに飲料水中の5%デキストラン硫酸塩を与えます。5日後、4匹のマウスの末梢血をバキュテナーヘパリンコーティングチューブにプールし、氷の上に置きます。次に、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで、300マイクロリットルの血液と300マイクロリットルの細胞染色を組み合わせ、血液をバッファーにして、氷上にそれぞれ100マイクロリットルの1〜5本のラベルが付いた5つのフローサイトメトリーテストチューブに分注します。

マウスを犠牲にした後、再度体重を測定し、変化を計算します。結腸組織を解剖し、ホルマリンでペースを合わせてhおよびd染色します。その後、以前と同様に骨髄細胞を採取します。

再懸濁した骨髄を5本のマイクロ遠心チューブに分割し、それぞれ100ミリリットルのラベルを1〜5本にします。フローサイトメトリーによる解析の準備として、添付の文書に記載されているように、暗所で各チューブの抗体混合物を調製すると、1番とラベル付けされた血液および骨髄サンプルがコントロールとして機能し、血液および骨髄サンプルを染色することはありません。標識番号 2 は、fitzy isotype control、PE isotype control、および CD 16 slash 32 ブロッキング溶液で染色されます。

これらのアイソタイプコントロールは、一次抗体結合サンプルの特異性を確認するために使用されます。ラベルの付いた番号3は、FZ CD 45.1およびCD 16スラッシュ32で染色されます。番号 4 とラベル付けされたブロッキング溶液サンプルは、CD 45.2 および CD 16 スラッシュ 32 で染色されます。

ブロッキングソリューション。単色ラベリングにより、血液または骨髄中のドナー細胞またはレシピエント細胞の存在を明らかにすることができます。明らかに、番号5とラベル付けされたサンプルは、CD 45.1、CD 45.2、およびCD 16スラッシュ32に染色されます。

ここでブロックするのは、二重色のラベリングが血液または骨髄中のドナー細胞とレシピエント細胞の相対的な比率を示しています。5マイクロリットルの抗体混合物2と5をそれぞれのサンプルチューブに加えます。次に、3マイクロリットルの抗体混合物3と4をそれぞれのサンプルチューブに加えます。

すべてのチューブを氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、各チューブに2ミリリットル、1つのXRBC溶解バッファーを追加します。次に、サンプルを暗闇の氷上でさらに15分間インキュベートします。

細胞をGの350倍、摂氏4度で5分間スピンダウンします。スピン後、上清を除去し、暗所で500マイクロリットルの細胞染色緩衝液でペレットを再懸濁します。その後、一瞬渦を巻きます。

次に、免疫染色血液および骨髄サンプルに対してフローサイトメトリーを実施します。野生型 CD 45.1 を表すには FZ を、ノックアウト CD 45.2 を表すには PE を選択します。フローサイトメトリーの結果をFlo Joeのソフトウェアで解析します。

適合 E と PE の比率、または PE と適合 e の比率を計算して、ドナーの遺伝子型が血液および骨髄の主要な遺伝子型であるかどうかを判断します。この画像は、正常な組織型とDSS大腸炎の結腸のサンプルhおよびe画像を示しています。組織像は、粘膜組織の損傷と粘膜および粘膜下組織への好中球浸潤に基づいて採点されます。

したがって、組織学スコアが高いほど、lyinが大腸炎の予防に関与しているかどうかをテストするためのより重度の大腸炎を示します。骨髄は、このビデオで説明されているように、野生型マウスとノックアウトマウスの間で交換されました。次に、組織学を評価し、ここに示すように採点しました。

組織学スコアは、ノックアウトマウスの骨髄を照射した野生型マウスに導入すると有意に増加しました。逆に、野生型骨髄をノックアウトマウスに導入すると、スコアは有意に減少した。これらのデータは、骨髄由来細胞由来の内因性Cが抗炎症作用を持ち、大腸炎を改善することを示しており、これらのマウスでの移植が成功したことを確認しています。

フローサイトメトリーは、移植後のマウスの骨髄と血液についても実施しました。野生型の骨髄は、フィッツCD45.1では強く染色されますが、peでは染色されません、ここに示すようにCD45.2では、ここに示すように、ノックアウト骨髄はPEに対して強く染色されますが、フィッツでは染色されません。しかし、移植後、ノックアウト骨髄を受けた野生型マウスの骨髄と血液はともにPEに対して強く染色されたが、フィッツでは染色されなかったことから、染色された細胞の大部分の集団がドナーからのものであったことが示された。

同様に、野生型骨髄を投与されたノックアウトマウスの骨髄および血液は、fitzyに対して強く染色されたが、peでは染色されなかったことから、優勢な染色集団がドナー起源であることが再度確認された。このビデオを見た後、骨髄移植の実験を行うことができ、骨髄由来細胞を介して大腸炎を改変できるようになるはずです。