全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

この手順の目的は、サイクリンBのタンパク質分解がどのように後期開始および有糸分裂脱出を制御しているかをモニタリングすることです。まず、サイクリンB snapレポーター細胞を顕微鏡スライド上に播種します。次に、キメラサイクリンB snapレポーター分子を蛍光基質TMR starで標識します。

次に、顕微鏡ステーションで一連の画像を取得します。最終ステップは、細胞を解析してTMR starの蛍光強度を経時的に算出し、サイクリンBのプロテオリシスを反映させることです。最終的に、生きたレポーター細胞の免疫蛍光顕微鏡観察により、有糸分裂中に起こるサイクリンBのプロテオリシスのキネティクスが明らかになります。

サイクローンB GFPをモニタリングするなどの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、サイクローンB SNAPを用いることで全タンパク質の発現ではなく、サイクローンBの分解をモニタリングできることです。本実験に使用するSNAPレポーター細胞は、まず対数増殖期において少なくとも48時間、非同期的に増殖させます。まず、トリプシンを用いてサブコンフルエントなSNAPレポーター細胞を播種し、8ウェルのマイクロスコープチャンバーへ、チャンバー表面全体に均一に分散するように播種します。

10,000個の細胞を350 µLのフェノールレッド不含通常増殖培地で再懸濁します。細胞懸濁液を顕微鏡チャンバーに移し、チャンバー中央の細胞密度が最大となるように、8ウェルの顕微鏡チャンバーに細胞を播種します。まず、チャンバーに300 µLのフェノールレッド不含通常増殖培地を注入してください。

次に、96ウェル専用光学プレートのウェル表面全体に均一に播種するため、5,000個の細胞を顕微鏡チャンバーの中央に慎重に加えます。必要な細胞含有ウェルの総数に応じて、5,000個の細胞を遠心分離し、300 µLのフェノールレッドフリー通常増殖培地で再懸濁させます。細胞数と懸濁培地の総量を調整してください。

次に、細胞懸濁液を96ウェルプレートに移し、ウェル中央に最大細胞密度となるように細胞を播種します。フェノールレッド不含の通常増殖培地15 µLに懸濁した1,500個の細胞を、各ウェルの中央に少量ずつ注意深く加えてください。

これにより、細胞の増殖をウェルの中心に限定させます。染色手順を開始する30分前に、播種したすべての細胞を標準的な細胞培養条件下で少なくとも18時間増殖させておきます。フェノールレッド不含の通常増殖培地を37 °Cに温めておきます。

本デモンストレーションで使用するSNAP基質は、取り扱いが容易なTMR starです。DMSOにTMR starを溶解させ、濃度400 µMのストック溶液を調製します。このTMR starストック溶液0.5 µLを、フェノールレッド不含の加温した通常増殖培地200 µLに希釈し、最終標識濃度を1 µMにします。次に、非同期的に増殖している細胞から通常増殖培地を除去し、標識培地に交換します。細胞を標識培地に入れ、標準的な培養条件下で25分間インキュベートします。

25分後、ラベル用培地を除去し、温めたフェノールレッド不含の通常増殖培地で細胞を4回洗浄します。最後の洗浄後、顕微鏡に transporting する前に、温めたフェノールレッド不含の通常増殖培地 300 µL 中で細胞を30分間インキュベートします。未結合の snaps 基質を除去するため、培地を新鮮で温かいフェノールレッド不含の通常増殖培地に交換し、37 °C に予熱したヒートブロックを入れた発泡スチロール製ボックスを用いて細胞を顕微鏡まで運搬します。

蛍光強度の測定を開始する2時間前に、温度変動を最小限に抑える処置を行います。クライメートチャンバーの空気温度をドライモードで37 °Cに調整し、顕微鏡およびすべての構成部品を目的の温度にします。結露による顕微鏡の損傷を防ぐため、湿度を設定する前に予熱することが重要です。

顕微鏡システム全体が37 °Cに達したら、空気湿度を60%、二酸化炭素濃度を5%に調整します。スキャンまたは取得ソフトウェアを起動し、標準設定を定義します。解析対象とするウェルの位置を指定します。ΔTまたは取得サイクル時間、および取得サイクルの絶対回数を設定します。

このデモンストレーションでは、より多くのウェルを解析するため、ハードウェアオートフォーカスがあらかじめ選択されています。画像取得を開始し、最初の2回の取得サイクルを監視してください。

顕微鏡でヒストンH2-GFPのシグナルに焦点を合わせ、フィルターを切り替えて対応するTMR starの画像を撮影する前に、まずそのチャンネルで最初の画像を撮像します。これを1つのウェル内のすべてのポジション、および解析対象の各ウェルに対して繰り返し、次のサイクルへと移行します。プロテオリシスプロファイルを解析するには、Scan R解析ソフトウェアを起動してください。

ヒストンH2-GFPで可視化された細胞核を画像解析します。信号強度に基づくしきい値と、隣接する細胞の分離を支援するウォーターシェッドアルゴリズムを用いて、これをメインオブジェクトとして定義します。TMR*解析のために、細胞質を含む核からなるサブオブジェクトを作成してください。メインオブジェクトの重要なプロパティは、XおよびY座標、時間、GFPの最大および平均強度、および面積で除した総強度です。

TMR starサブオブジェクトについて、トレースモードに切り替えて、サブオブジェクトの平均TMR star蛍光強度の経時的変化、または解析されたメインオブジェクトに割り当てられた細胞トレースを可視化します。より多くの細胞数を確認することで、代表的かつ客観的な概観を得ることができますが、少なくとも140サイクル持続し、かつヒストンH2 GFP強度の最大値が大きい測定値でゲーティングすることで、検討する細胞数を絞り込むことができます。関心のある細胞トレースを選択すると、単一細胞レベルでヒストンH2 GFPとTMR starの蛍光を同時に可視化できます。

右マウスボタンを使用して、目的の細胞をクリックし、書き出し可能な画像を生成します。ヒストンH2-GFPおよびサイクリンB-SNAP-TMR*の各タイムポイントにおける例示用のギャラリーです。スキャナー解析ソフトウェアのポピュレーションモードに切り替え、ドットプロット上で目的の細胞が示されている領域をゲートします。

ゲート領域に新しいドットプロットウィンドウを適用し、TMR star蛍光強度の平均値の時間経過を可視化します。さらなる計算のため、データをMicrosoft Excelにエクスポートします。ここに示す図はCyclin Bのキネティクスを描いたもので、核膜崩壊（NEBD：赤色の三角形で表示）後の細胞質凝縮時に染色体不整合の兆候なく通常の有糸分裂へと進む細胞のTMR star蛍光強度曲線を示しています。TMR star蛍光強度は、等形態ウィンドウに達するまで急激に上昇します。

細胞が前中期に入ると、前期待および中期にわたって蛍光強度は安定したレベルを維持し、その後急速に低下し始めます。すべての染色体が安定した中期板を形成すると、この低下に続いて染色体の分離が起こります。有糸分裂後期の曲線上の青い点で示される後期において、クロマチンは脱凝集し始め、細胞は後期特有の形態へと移行します。

蛍光強度の曲線がプラトーに近づきますが、これは有糸分裂後のプラトーよりも低くなります。この手法により、有糸分裂分野の研究者が、有糸分裂の進行を制御するサイクリンの分解と合成の間の緻密なバランスを探索する道が開かれました。