全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

後期促進複合体（APC / C）依存性ユビキチン化とここサイクリンBのその後の破壊によってトリガされ移行を後期にかけてする中期、我々は、パルスチェイスラベルに続いて、システムを構築し、全体の細胞集団でサイクリンB蛋白質分解を監視することができ、有糸分裂チェックポイントによる干渉の検出を容易にする。

この手順の目的は、サイクリングBのタンパク質分解が後期の開始と有糸分裂の終了をどのように制御するかを監視することです。これは、まず顕微鏡スライド上にBスナップレポーター細胞をサイクリングすることで達成されます。2番目のステップは、キメラCyclin B snap reporter分子を蛍光基質TMRスターで標識することです。

次に、顕微鏡ステーションで画像シリーズを取得します。最後のステップは、細胞を解析し、サイクリングBタンパク質分解を反映したTMRスター蛍光強度を経時的に計算することです。最終的に、生きたレポーター細胞の免疫蛍光顕微鏡は、有糸分裂中に起こるサイクリングBタンパク質分解の動態を明らかにします。

この手法がサイクロンBGFPのモニタリングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、サイクロンB SNAPでは、全タンパク質発現ではなくサイクロンBの分解をモニタリングできることです。この実験用のスナップレポーター細胞は、最初は少なくとも48時間、対数期で非同期に増殖することが許されています。まず、トリプシンを播種する手順は、チャンバー遠心分離機の全表面に一定の分布で8つのウェル顕微鏡チャンバーに細胞を播種するためのサブコンフルエンススナップレポーター細胞です。

10, 000 個の細胞と Resus は、フェノールレッドを含まない正常な成長培地である 350 マイクロリットルで消費します。細胞懸濁液を顕微鏡チャンバーに移し、チャンバーの中央に細胞密度が最大となる8つのウェル顕微鏡チャンバーに細胞を播種します。まず、チャンバーに300マイクロリットルのフェノレッドフリーノーマル成長培地をロードします。

次に、96に細胞を播種するために、顕微鏡チャンバーの中央に5, 000個の細胞を慎重に追加します。井戸の全体の表面にわたって一定の分布で特別な光学プレートは、5、000細胞を遠心分離し、必要な細胞を含む細胞の総数に応じて、フェノールレッドフリーの正常な成長培地の300マイクロリットルに再懸濁します。懸濁液媒体のセル番号と総容量を調整します。

次に、細胞懸濁液を96ウェルプレートに移し、細胞を96ウェルプレートに播種します。ウェルの中央に最大のセル密度を持つ特殊な光学プレート。15マイクロリットルのフェノールレッドフリー正常増殖培地に1, 500個の細胞を各ウェルの中央に小さな滴で慎重に加えます。

これにより、細胞の増殖がウェルの中心に制限されます。染色手順の開始30分前に、標準的な細胞培養条件下で、播種したすべての細胞を少なくとも18時間増殖させます。フェノールレッドフリーの正常な成長培地を摂氏37度までのウォームアップクォート。

このデモンストレーションのスナップ基板は、DMSOに溶解したTMRスターを取り扱いやすく、TMRスターストック溶液の0.5マイクロリットルを希釈した400マイクロモルの濃度のストック溶液を得るためのTMRスターです。200マイクロリットルの温かいフェノールレッドフリーの正常な成長培地で、1マイクロモルの最終標識濃度を得る。次に、非同期増殖細胞から正常な増殖培地を取り出し、標識培地と交換し、標準培養条件下で標識培地で細胞をインキュベートします。

25分後、標識培地を取り出し、温かいフェノールレッドフリーの正常増殖培地で細胞を4回洗浄します。最終洗浄後、顕微鏡に輸送する前に、300マイクロリットルの温かいフェノールレッドフリーの正常増殖培地で細胞をインキュベートします。培地を新鮮で温かいフェノールレッドフリーの通常増殖培地と交換し、予備温37°Cのヒートブロック上の発泡スチロールボックス内の顕微鏡に残留したスナップ基質輸送細胞を除去します。

蛍光強度の測定の2時間前に温度変動を最小限に抑えるため。ドライモードでクライメートチャンバーの気温を摂氏37度に調整して、顕微鏡とそのすべてのコンポーネントを目的の温度にします。結露やその後の顕微鏡の損傷を避けるために、湿度を設定する前に予熱することが重要です。

顕微鏡システム全体が摂氏37度に達したら、空気の湿度を60%に、二酸化炭素を5%に調整しますスキャンまたは取得ソフトウェアを起動し、標準設定を定義します。分析するウェルの位置を定義します。デルタTまたは集録サイクル時間、および集録サイクルの絶対数を定義します。

このデモンストレーションでは。ハードウェアオートフォーカスは、より多くのウェルの分析のために事前に選択されています。取得を開始し、最初の 2 つの取得サイクルを監視します。

顕微鏡はヒストンHの2つのGFP信号に焦点を合わせ、その後、フィルターを交換して対応するTMRスター画像を取得する前に、そのチャネル内の最初の画像を取得します。これは、井戸内のすべての位置と、次のサイクルを繰り返す前に調査する各井戸に対して繰り返されます。又。タンパク質分解プロファイルを解析するには、スキャンR解析ソフトウェアを起動します。

シグナル強度に基づく閾値と隣接する細胞の分離を支援する流域アルゴリズムを使用して、ヒストンH 2 GFPによって視覚化された細胞核で画像を解析します。TMR星解析のためには、細胞質を持つ核からなるサブオブジェクトを作成する必要があります。メインオブジェクトの重要なプロパティは、XとYの位置、時間と最大値、メインオブジェクトのGFPの平均強度、および合計強度を面積で割ったものです。

TMRスターサブオブジェクトの場合、トレースモードに変更して、サブオブジェクトの平均TMRスター蛍光強度の経時的または解析されたメインオブジェクトに割り当てられた細胞トレースを視覚化します。より多くの細胞を見ることは、最初の代表的かつ客観的な視点を可能にするが、少なくとも140サイクル持続し、大きな最大ヒストンH 2GFP強度を含むそれらの測定値をゲーティングすることによって、検査される細胞の数を絞り込むことができる。目的の細胞トレースを選択すると、ヒストンH、2つのGFPおよびTMRスター蛍光が単一細胞レベルで同時に可視化されます。

マウスの右を使用して、目的のセルをクリックし、エクスポート可能な画像を生成します。histone H two GFPとcycling B snap TMR starのイラストを毎回ギャラリーでご覧いただけます。スキャナー解析ソフトウェアのポピュレーションモードにポイントチェンジし、ドットブロット上に目的の細胞が表される領域をゲートします。

ゲート領域に新しいドットプロットウィンドウを適用し、TMR星の蛍光強度の平均を経時的に可視化します。データをMicrosoft Excelにエクスポートして、さらに計算します。この図は、赤い三角形で示されているように、核膜破壊またはNEBDに続く細胞質の圧縮時に染色体ミスアライメントの兆候なしに通常の有糸分裂を通過する細胞のTMRスター蛍光強度曲線で表されるサイクリンBの動態を示していますTMRブドウ球菌の蛍光強度強度は、同型ウィンドウに達するまで急激に増加します。

細胞が前中期に入ると、細胞が前期と中期を進行する限り、蛍光強度は安定したレベルにとどまり、その後急速に低下し始めます。すべての染色体が安定した中期プレートを確立すると、このドロップは染色体分離に先行します。後期有糸分裂の曲線上の青い点で示される後期には、クロマチンが凝縮し始め、細胞は相形態に採用されます。

蛍光強度曲線はプラトーに近づきますが、これは有糸分裂前のプラトーよりも低くなっています その発生後。この技術は、有糸分裂分野の研究者が、サイクリング、BE分解、および有糸分裂の進行を調節する合成の間の緊密なバランスを探求する道を開きました。