血漿タンパク保存用採血キットからゲノムDNAを抽出するために実用的で新手法

このビデオでは、P 100チューブと呼ばれる新しいBDP 100血漿タンパク質保存システムからゲノムDNAを抽出するための、実用的かつ斬新な方法について説明します。血清や血漿保存チューブからの抽出は、これまでも一般的に行われてきた手順ですが、この新しいP 100チューブとここで紹介する抽出方法を組み合わせることで、より少ない労力で、より高品質なDNAを回収できる斬新で簡便なアプローチが可能になります。P 100チューブの内面には、カリウムEDTAおよびプロテアーゼ阻害剤がコーティングされています。

これにより凝固が防止され、血漿タンパク質が安定します。遠心分離後に血漿を回収して検査することを目的として、これらのチューブに血液を採取します。P 100に含まれる血液は密度に基づいて層に分離し、上層に血漿、下層に赤血球、そしてその間に白血球が配置されます。

これら2つの層の間にあるのがバフィーコートです。一般的に、これらのチューブは血漿を回収するために主に使用されます。抗体価やタンパク質レベルなど、いくつかの測定にこの血漿が用いられます。

バフィーコートは通常廃棄されますが、このビデオで示すように、シーケンシング、ジェノタイピング、バイオマーカーの同定など、複数の解析に十分な量のDNAが含まれています。P one hundredsは、主にキャップ、チューブ、セパレーターの3つの構成要素で構成されています。機械的セパレーターは、バフィーコート層の直上まで移動します。

バフィーコートにアクセスするためには、セパレーターからバフィーコートまでの距離を広げる必要があります。これは17% sucroseを添加することで達成されます。通常、バフィーコートはP 102と共に廃棄されますが、このビデオで示すように、-80°CフリーザーからP 100チューブを取り出す前に、この層からいくつかの分析テストを行うのに十分な量のDNAを容易に回収することが可能です。

ウォーターバスを37°Cに予熱し、各P 100チューブをウォーターバスに入れ、約5分間インキュベートしてすべてのサンプルを融解させます。すべてのサンプルが完全に融解したら、セパレーターの上に残っている血清を除去します。次に、セパレーターの上に17% sucroseを5 mL加えます。sucroseを添加後、すべてのチューブを2,500 Gで20分間遠心分離します。これでセパレーターがチューブの上部に移動し、バフィーコートから分離したため、容易に除去することができます。

70%エタノールをケミワイプにスプレーし、ペーパークリップのフックの表面全体を十分に拭いて滅菌させます。滅菌したペーパークリップを用いて、P 100チューブを45度の角度に保持します。セパレーターの縁をそっと上に引き上げ、バイオハザード袋へと誘導しながら、チューブからセパレーターを取り出し始めます。

セパレーターを取り出し、バフィーコート層や赤血球層を乱さないように、17% sucrose層を可能な限り取り除きます。これで、チューブの最上層がバフィーコートになります。この層を、ラベルを貼った新しい15 milliliterコニカルチューブに移します。各チューブから回収されるバフィーコートの量は異なりますが、3 milliliters未満となるはずです。

すべてのチューブの容量を揃えるため、各チューブの容量が3 mLになるまでPBS（リン酸緩衝生理食塩水）を加えます。すべてのバフィーコートが等量に懸濁された状態で、残存している赤血球を除去するため、9 mLの赤血球（RBC）溶血液を加えます。

次に、室温で10分間インキュベートし、その間にチューブを数回反転させて、溶血した赤血球とバフィーコートを分離させます。2,500 Gで5分間遠心分離し、DNA抽出の元となるペレットを形成させます。各チューブから廃棄物を液体バイオハザード容器に注ぎ捨て、ペレットを再懸濁させるための少量の液量だけを残します。チューブをボルテックスして、ペレットを剥離させ、再懸濁させます。

3 mLの細胞溶解液を加え、10秒以上激しくボルテックスします。細胞を溶解させることで、タンパク質とDNAが溶液中に自由に懸濁した状態になるため、これらを分離させる必要があります。まず、1 mLのタンパク質沈殿液を用いてタンパク質を沈殿させ、強設定で15秒以上ボルテックスします。次に、チューブを2,500 Gで5分間遠心分離し、タンパク質をペレット化します。

適切に段階を分けて行う。処理する各サンプルについて、新しいチューブ用の15 mLコニカルチューブにラベルを貼る。100%イソプロパノールを3 mL分注する。

タンパク質を沈殿させ遠心分離した後、各チューブには比較的大きなペレットと、ほぼ透明な上清が形成されているはずです。各チューブのDNAを含む上清を、前工程で準備した対応するイソプロパノール入りのチューブにデカンテーションで移します。イソプロパノールにより溶液中のDNAが沈殿し、小さな白い糸状の構造が現れます。すべてのチューブを50回反転させ、十分に混合させます。次に、すべてのチューブを2,500 Gで3分間遠心分離し、DNAペレットを作製します。通常、DNAはチューブの底に小さな白いペレットとして観察されますが、DNA収量が低い場合は目に見えないことがあります。濃度を測定するまで、すべての抽出操作を継続してください。

DNAペレットの有無にかかわらず、イソプロパノール溶液を廃棄します。70% ethanolを加えてDNAを洗浄します。これにより、後の解析を妨げる可能性のある不要な不純物が除去されます。2,500 Gで1分間遠心分離します。DNAペレットがチューブの底にしっかりと付着していることを確認するため、チューブから70% ethanolをすべて廃棄し、清潔なペーパータオルの上で逆さまにして1時間自然乾燥させます。

プロトコルを続行する際は、チューブ内にエタノールが目視で確認できない状態にする必要があります。抽出の最終ステップは、DNAを溶液で再懸濁させることです。ほとんどの抽出において、DNAハイドレーション溶液または水のいずれかが適切な選択肢となります。

目に見えるDNAの糸状構造やペレットがほとんど、あるいは全く認められない試料には、DNA水和溶液を250 µL少なめに加えます。その後、DNAを緩やかに段階的にボルテックスし、懸濁させます。最後に、懸濁したDNAをすべて遠心管に移します。この時点で、NanoDropまたはその他の分光光度計を用いて、DNAの濃度と純度を測定することができます。

一般的に、DNAの純度は、DNA回収のみを目的に採取されたK2EDTA管の全血から直接抽出したDNAの純度に近いことが期待されます。DNA濃度は出発材料の量に依存しますが、50 nanograms per microliterから1000 nanograms per microliter近くまで幅があり、平均すると200 nanograms per microliter程度になります。本プロトコルを用いる利点は2点あります。第一に、臨床医が2回の採血を行う代わりに、1回の採血で2つの臨床検査を行うことが可能になる点です。

第二に、前世代のチューブではなく最新のメカニカルセパレーターチューブを使用することで、DNAを含む細胞へのアクセスを得るプロセスが簡略化されます。前世代のゲルセパレーターチューブでは、ゲルセパレーター自体と血液凝固物の両方がDNAを含む細胞への障壁となっていました。P 100チューブでは、17%Sucroseを用いた密度勾配分離により、メカニカルセパレーターを容易に除去することが可能です。

これは、平均的なDNA抽出のNanoDrop測定結果のスクリーンショットです。サンプルP 109につき本手法を用いた結果、DNA濃度 209 ng/µL の溶液が 250 µL 得られました。総収量は約 52 µg でした。

DNA純度の主要な指標である260/280比は1.88であり、最適範囲である1.8から1.9の間に収まりました。DNA純度の補助的な指標である260/230比は2.35であり、期待される範囲である2から2.2に近い値でした。

これらはかなり典型的な結果です。現実的には、標準的なゲル電気泳動と臭化チオニル染色を用いた場合、抽出前の血液量や状態によって、抽出物の収量や品質は変動します。さらなる品質試験により、P 100チューブから抽出されたゲノムDNAは、全血から抽出されたDNAと同等に無傷であることが示されています。

これは、ゲノムDNAを含む各レーンの上部に現れる明るく太いバンドから明らかです。従来の法に代わってこのプロトコルを使用することには、主に2つの利点があります。第一に、通常であれば2回必要となる採血を1回にまとめられる点です。

第二に、本プロトコルは一般的なSSTゲル分離管を用いたプロトコルよりも迅速かつ簡便です。凝固した血液を日常的に分解する必要がなくなるため、遺伝学的検査と血清学的検査の両方が必要な場合、臨床医は2本の採血管で採血を行います。通常は、ゴールドトップと呼ばれるSSTゲル分離管とパープルトップと呼ばれるEDTA-K2採血管を用い、SST管から血清を、パープルトップ管からDNAを抽出します。本手法を用いることで、レッドトップのP 100管1本のみの採血で済ませることが可能になります。

ゲルセパレーター法によるDNA抽出に習熟している施設では、血清学的検査と遺伝学的検査の両方を目的として、すでに1本のチューブで検体を採取している場合があります。本手法は、これらの既存のゲルセパレーター法に対する漸進的ではありますが実質的な改善です。どちらの手法においても何らかのセパレーターを除去する必要がありますが、ゲルはプラスチックゲルよりも汚れやすい傾向があります。

セパレーターチューブを使用する場合、DNA抽出の前に凝固血をワイヤーメッシュで均質化する必要があります。この均質化作業は煩雑になりやすく、また、DNAを含まない赤血球が相当量存在すると、DNA抽出の困難さが増します。このP 100抽出法を用いることで、DNAを含む白血球をヘマトクリットから分離させることができ、DNA抽出を妨げる赤血球の混入を最小限に抑えることが可能です。

従来のゲル分離管ではなくP 100血漿分離管からDNAを回収するこのシステムには、多くの利点があります。P 100管には、マグネシウム依存性エンドヌクレアーゼを抑制するEDTAと、血液凝固を防ぐ抗凝固剤が含まれています。その結果、凝固した血液を破砕して均質化する手間が省けるため、より簡便な抽出プロトコルで、より高いDNA完全性を得ることができます。

さらに、血漿除去血はP100チューブに保存し、DNA抽出が必要になるまで最長3年間保存することが可能です。これにより、臨床医はより少ない採血回数でより有用な患者データを取得でき、その結果、処置を受ける患者へのストレスを軽減することができます。