頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

本手順の目的は、規定の培養条件下で、頭蓋骨髄由来の間質細胞培養の挙動をモニタリングすることです。最初のステップは、妊娠日数を調整したマウスから子宮角を回収することです。

coumから8.5日後。単離後、胚を脱落膜から取り出し、ジェノタイピングのために卵黄嚢を除去します。次に、頭部を微小解剖し、細胞外マトリックスでコーティングした組織培養プレートに転移させます。

X外植片を接着させ、特定の薬理剤の存在下または不在下で最大48時間培養します。最終的に、外植片の画像を撮影し、細胞遊走の違いを確認します。この手法は、神経胚（neurofold）の挙上中に、どのようなシグナル伝達経路や細胞外マトリックスタンパク質が関与し、頭蓋神経堤（cranusing kind）の挙動を制御しているかといった重要な疑問を解決するのに有用です。

マイクロダイセクションの手順を習得するには、忍耐と練習が必要であり、学習が困難であるため、本手法を視覚的に実演することは極めて重要です。まず、免疫組織化学染色を行う場合はカバーガラスを準備します。それ以外の場合は、このステップをスキップして、組織培養プレートに直接ECMをコーティングしてください。12 mmの円形滅菌済みガラスカバーガラスをエタノールに浸して準備し、自然乾燥させます。次に、12ウェルプレートの各ウェルに滅菌済みカバーガラスを配置します。

ラミナーフローフード内で、カバーガラスまたは組織培養プレートの底面をコーティングするために、1 mLの細胞外マトリックス（ECM）を分注します。プレートを37 °Cで3時間インキュベートします。インキュベーション後、ECM溶液を吸引し、PBSで3回洗浄します。この時点で、コーティング済みプレートをすぐに使用するか、ラップに包んで4 °Cで最大2週間保存することができます。

半透明の胚を可視化するため、耐性のある黒色の背景を備えたSylgardプレートを、製造元のプロトコルに従って準備します。

ミニピンをピンホルダーに挿入し、解剖器具を準備します。すべての準備が整ったら、シャープニングブロックを使用してピンセットを研ぎます。膣栓後8.5日のタイミング妊娠マウスから子宮を採取します。

単離した子宮を滅菌PBSを入れたディッシュに置き、洗浄します。解剖顕微鏡下で、ピンセットとハサミを用いて個々の脱落膜を分離します。脱落膜から胚が圧力で飛び出さないよう注意しながら、破るようにして子宮結合組織を除去します。

ピンセットを用いて、胎盤の反対側の子宮組織を慎重に引き裂きます。卵黄嚢に包まれた胚を露出させるため、ピンセットで胚と卵黄嚢を胎盤からつまみ、子宮組織をディッシュから取り除きます。次に、ピンセットでそっと引き裂くようにして、胚から卵黄嚢を除去します。

ピペットを用いて、分離した卵黄嚢をジェノタイピング用のエッペンドルフチューブに入れます。分離後、体節数を数えて胚のステージを判定します。理想的には、胚は6体節から10体節の間、すなわち6〜10体節期のステージであることが望ましいです。このステージでは、神経堤が上昇し始めたばかりであり、頭部間充織の主要な形態形成はまだ起こっていません。

ステージが確定したら、フェノールレッドを含まないDMEMを入れた黒色のセルガードプレートに胚を移します。まず、可能な限り高倍率の解剖顕微鏡下で、両手に解剖用針を持って胚の頭部に焦点を合わせ、rmbaより前方で頭部を切り出します。次に、正中線に沿って二分するように切断します。

両手に解剖針を持ち、頭部を2つの等分に切り分ける。胚の頭部縁および正中線に沿って外縁部を解剖する。目的の部位と不要な組織との混同を防ぐため、必要に応じて除去を行う。

エクスプランには、遊走中の頭部神経堤、側板中胚葉、および表在外胚葉が含まれており、緩く付着した細胞を除去します。200 µLのピペットチップを用いて、慎重にピペッティングを行います。そして、ピペットチップでエクスプランを慎重に回収します。

コート済み組織培養ウェルの中心に約10 µLのDMEMを分注し、15% FBSを添加した加温DMEM 20 µLを加えます。その後、培養皿を組織培養インキュベーターに移します。約1〜2時間後、外植片（explant）が付着するため、さらに250 µLの培地を追加します。約24時間後には、外植片がカバーガラスにしっかりと付着します。

この時点で、さらに24時間経過した後に培地に薬理学的薬剤を添加することができ、細胞がこれらから遊走します。通常、遊走した細胞の距離と数を記録するために画像を撮影します。この段階になると、インキュベーション時間が長くなるにつれて、生存率の低下の兆候が見え始めます。

以下は、頭蓋間充質およびchix植物から遊走する細胞の例です。異なる基質内で48時間経過後、外植片から遊走する細胞の形状とサイズの双方が基質に依存することがわかります。遊走は、フィブロネクチン、ラミニン、matrigel、ECM、およびヒアルロン酸上で支持されました。

この手順に従い、免疫蛍光染色やライブイメージングなどの他の手法を用いて、神経胚の隆起時に頭蓋部中胚葉の挙動を制御する経路をさらに詳細に解析することができます。